一種植酸酶基因及其克隆的製作方法

2023-09-16 06:23:25

專利名稱：一種植酸酶基因及其克隆的製作方法
技術領域：
本發明是一種植酸酶基因及其克隆，屬於生物工程領域，特別涉及到無花果麴黴(A.ficuum)As3.324編碼PYHA型植酸酶的基因及其克隆。
植物中總磷的60％-90％以植酸的形式存在，這些磷不能被人和單胃動物所利用，食物尤其是集約化畜牧業的飼料中需添加礦物質磷，這一方面是礦物質原料的浪費，另一方面未消化的植酸排出體外，造成土質和水質環境的磷汙染。植酸還有強烈的抗營養作用，它能螯合礦物質和蛋白質，影響人及動物對微量礦物質元素的吸收，抑制蛋白質尤其是消化酶系的生物學活性。植酸酶能催化水解植酸，釋放游離肌醇、磷酸及多磷酸中間產物。利用植酸酶對植酸的水解作用，能夠提高人或單胃動物對植物性食品或飼料中磷的利用率，解除植酸的抗營養作用，而且有利於環境保護。植酸酶廣泛存在於微生物特別是真菌中，但目前只有少數來自於不同微生物的植酸酶基因被測序克隆。無花果麴黴(A.ficuum)As3.324的植酸酶屬於PHYA型植酸酶，其酶學性質特別是在pH2.5和pH5.5處有兩個酶活性高峰，適合於在人或動物胃腸中作用。目前，野生型微生物包括無花果麴黴As3.324的產植酸酶水平較低，以至於微生物發酵生產的植酸酶成本很高。
本發明提供了無花果麴黴(A.ficuum)As3.324編碼PHYA型植酸酶的基因phyAI序列及其相應的胺基酸序列。提供了含有As3.324植酸酶基因phyAI的克隆載體pUC19/phyA I和含有這種載體的大腸桿菌(E.coli)細胞JM109/pUC19/phyA I。利用本發明成果，可以構建植酸酶基因工程菌，提高微生物發酵產植酸酶的水平，降低植酸酶生產成本；還可用於植物尤其是經濟農作物的基因轉化，達到改善農作物品質的目的。
本發明以無花果麴黴(A.ficuum)NRRL3135的植酸酶基因phyA核苷酸序列作參考，設計併合成兩條寡核苷酸引物，提取As3.324基因組DNA為模版，PCR方法合成phyAI，並對PCR產物測定核苷酸序列。將phyAI和克隆載體PUCl9分別用限制性內切酶切割，形成互補的粘性末端，T4DNA連接酶連接，形成phyAI克隆載體pUC19/phyAI。熱激法將這個克隆載體導入感受態E.coli JM109，成為含有pUC19/phyAI的大腸桿菌細胞JM109/PUC19/phyAI。
無花果麴黴(A.ficuum)As3.324植酸酶基因phyAI核苷酸序列如下 其中 為轉錄起始密碼， 為轉錄終止密碼， 框線中序列為植酸酶活性位點編碼序列，小寫字母表示內含子序列。
根據以上核苷酸序列，推測A.ficuum As3.324植酸酶蛋白的胺基酸序列如下
441 LGRCT RDSFV KGLSF ARSGG461 DWAEC FAphyA I的結構基因全長1515bp，+46-+156的111個核苷酸為內含子序列，其中含有真菌內含子的特徵保守序列，Donor序列GTATGC，Lariat序列GCTGAC，Acceptor序列CAG。phyA I共編碼467個胺基酸，N端的19個胺基酸為信號肽，信號肽的切割位點在第19位胺基酸Gly之後，在phyA I編碼的胺基酸序列中存在10個潛在的N-糖基化位點，81-88位胺基酸為植酸酶的活性位點保守序列RHGARYPT。克隆載體pUC19/phyA I中含有phyA I全序列。受體大腸桿菌細胞JM109/pUC19/phyA I中含有克隆載體pUC19/phyA I。
phyA I是首次被提取、測序和克隆的無花果麴黴(A.ficuum) As3.324的植酸酶基因。因其所編碼的植酸酶適合作用於在人和單胃動物的胃腸中作用，所以該基因的克隆可用於構建表達植酸酶的基因工程菌，提高微生物發酵產植酸酶的水平，降低植酸酶生產成本；還可用於植物尤其是經濟農作物的基因轉化，達到改善農作物品質的目的。
以下是本發明的最佳實施例實施例1Aficuum As3.324植酸酶基因phyA I的PCR擴增和測序用馬鈴薯培養基培養A.ficuum As3.324，30℃振蕩培養24小時後收集菌體，液氮研磨菌體，以氯化苄為提取液提取As3.324基因組DNA。以A.ficuumNRRL3135的植酸酶基因phyA核苷酸序列作參考，設計併合成兩條PCR引物如下
F15』-AGGTGGGATGAAGGGGTTAT-3』R15』-CAGCGGCCGCCTAAGCAAAACTCTCCGCCC-3』PCR反應條件如下Template1μlLA Taq 0.5μldNTP8μl2×GCIbuffer25μlF1(20pmol/μl) 1μlR1(20pmol/μl) 1μlddH2O up to 50μl94℃ 1′ 4℃PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳後，用回收試劑盒D301CA(TaKaRa公司產品)回收約1.5Kb的DNA片斷，對該DNA片斷用Sanger鏈終止法測定其核苷酸序列，為無花果麴黴(A.ficuum)As3.324的植酸酶基因phyA I。
實施例2phyA I與克隆載體PUC19的重組phyA I和克隆載體PUC19分別用EcoR I/Pst雙酶切。酶切條件如下
Eppendorf AEppendorf BddH2O 9μl ddH2O 13μl10×H 2μl 10×H 2μl0.1％BSA 2μl 0.1％BSA2μlPCR片段(1μg/μl) 5μl 質粒PUC19(1μg/μl) 1μlEcoR I 1μl EcoR I 1μlPst I 1μl Pst I 1μl37℃酶切3小時，電泳後分別回收兩個目的片段，用T4DNA連接酶連接。連接條件如下ddH2O6μlPCR片段(0.1μg/μl) 1μlPUC19(0.05μg/μl)1μl10×T4DNA連接酶Buffer 1μlT4DNA連接酶(1U/μl) 1μl16℃連接1小時，電泳檢測連接產物，回收其中約4.2Kb片段為含有phyA I的克隆載體pUC19/phyA I，用於轉化大腸桿菌。
實施例3克隆載體pUC19/phyA I轉化大腸桿菌JM109加入60μl解凍的感受態E.coli JM109和10μl連接液至Eppendorf中，冰上30秒，42℃50秒，冰上2分鐘，加入37℃的LB培養基930μl，37℃震蕩培養1小時。菌液與4μlIPTG及40μlX-gal混合後塗含有50mg/Ap的LB平板上，37℃培養過夜。挑選白色菌落做PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳中呈現1.5Kb特異帶者為陽性轉化菌落，為含有pUC19/phyA I的大腸桿菌JM109/pUC19/phyA I。從JM109/pUC19/phyA I中提取質粒，以PUC19的測序通用引物測定外源插入序列phyA I的核苷酸序列，與實施例1所述PCR測序結果一致。
權利要求
1.一種植酸酶基因，phyAI，其特徵在於它是無花果麴黴(A.ficuum)As.3324編碼PHYA型植酸酶的基因。
2.根據權利要求1所述植酸酶基因phyAI的核苷酸序列 466 TACAACTACA GCCTGGGCGC GGATGACCTG496 ACTCCCTTCG GAGAGCAGGA GCTGGTCAAC526 TCCGGCGTCA AGTTCTACCA GCGATACGAA556 TCGCTCACAA GAAACATTGT CCCGTTCATC586 CGATCCTCAG GCTCCAGCCG CGTGATTGCC616 TCTGGCAATA AATTCATCGA GGGCTTCCAG646 AGCACTAAGC TGAAGGATCC TCGTGCCCAG676 CCCGGCCAAT CGTCGCCCAA GATCGACGTG706 GTCATTTCAG AGGCCAGCAC ATCCAACAAC736 ACTCTCGATC CGGGCACCTG CACCGTTTTC766 GAAGATAGCG AATTGGCCGA TGACATCGAA796 GCCAATTTCA CCGCCACGTT CGTCCCCTCC826 ATTCGTCAAC GTCTGGAGAA CGACTTGTCT856 GGCGTGTCTC TCACGGACAC AGAAGTGACC886 TACCTCATGG ACATGTGCTC CTTCGACACC916 ATCTCCACCA GCACCGTCGA CACCAAGCTG946 TCCCCCTTCT GTGACCTGTT CACCCATGAA976 GAATGGATCA ACTACGACTA CCTCCAGTCC1006 CTGAACAAAT ACTACGGCCA TGGCGCAGGT1036 AACCCGCTCG GCCCGACCCA GGGCGTCGGC1066 TACGCTAACG AGCTCATCGC CCGTCTCACC1096 CACTCGCCTG TCCACGATGA CACCAGCTCC1126 AACCACACAT TGGACTCCAA CCCGGCTACT
3.根據權利要求1所述植酸酶基因phyAI的克隆載體PUC19/phyAI。
4.根據權利要求3所述克隆載體PUC19/phyAI的大腸桿菌(E.coli)受體細胞JM109/PUC19/phyAI。
全文摘要
本發明是一種植酸酶基因及其克隆,屬於生物工程領域。本發明提供了一種來自於無花果麴黴(A.ficuum)As3.324編碼PHYA型植酸酶的基因phyAI,提供了phyAI序列及其相應的胺基酸序列。提供了含有phyAI的克隆載體pUC19/phyAI和含有這種載體的E.coli細胞JM109/pUC19/phyAI。本發明可用於構建植酸酶基因工程菌,提高微生物發酵產植酸酶的水平;還可用於農作物的基因轉化,達到改善農作物品質的目的。
文檔編號C12N15/55GK1350060SQ00123168
公開日2002年5月22日 申請日期2000年10月24日 優先權日2000年10月24日
發明者張苓花, 安利佳, 袁曉東, 包永明, 王運吉 申請人:大連理工大學, 大連輕工業學院