嗅幹細胞的體外培養方法

2023-09-17 19:39:15 1

專利名稱：嗅幹細胞的體外培養方法
技術領域：
本發明專利涉及一種建立人胚胎嗅黏膜神經幹細胞的體外培養方法，以獲得足夠數量的 嗅神經幹細胞、嗅神經前體細胞和嗅鞘前體細胞，用於中樞神經系統損傷的細胞移植臨床治 療和基礎研究。
背景技術：
目前，關於嗅黏膜神經幹細胞生物學特性和體外建系培養的研究少見報導，人胚嗅幹細 胞應用於中樞神經系統損傷的移植臨床治療還不成熟。

發明內容
為了使人胚嗅幹細胞應用於中樞神經系統損傷的移植臨床治療成為可能，本發明專利提 出了嗅幹細胞的體外培養方法，能使人胚胎嗅黏膜神經幹細胞大量擴增，對中樞神經系統損 傷的移植臨床治療起到了很重要的作用，也對細胞學等基礎研究起到了很重要的作用。
本發明專利解決問題所採用的技術方案自人胚胎(4~6)月分離，剪取部分嗅黏膜經含 DNA(0.01%)的胰酶和膠原蛋白酶消化製成細胞懸液，接種於十二孔無菌培養板中用含EGF, b-FGF， B27等一系列神經營養因子培養並傳代至20代，動態觀察神經幹細胞克隆球的形成及 生長過程。用nestin (巢蛋白)、tubulin (微管蛋白)、NSE (神經元特異性烯醇酶)、GFAP (神經膠質酸性蛋白)多種抗體作免疫細胞化學染色，對陽性細胞進行形態學鑑定。結果， 神經幹細胞呈球形，不直接貼附於培養皿，僅粘著在首先貼壁的扁平基底細胞上分裂形成克 隆球，隨著細胞傳代次數的增加，克隆球逐漸分裂出新細胞又分裂形成新的克隆球，並以此 循環，球內細胞nestin、 tubulin免疫細胞化學染色陽性。
本發明專利的有益效果本發明成功建立了人胚胎嗅黏膜神經幹細胞的體外培養，大量
擴增方法。能獲得足夠數量的嗅神經幹細胞、嗅神經前體細胞和嗅鞘前體細胞，使人胚嗅幹
細胞應用於中樞神經系統損傷的移植臨床治療成為可能。
具體實施例方式
1. 收集婦產科流產和引產的無明顯發育障礙的胎兒。
2. 試劑DMEM/F12 (Gibco) ， B27 (Gibco) ， EGF (PEPROTECH) FGF (PEPRO TECH) L-穀氨醯胺(Sigma)膠原蛋白酶(Sigma)。
3. 沿死亡胎兒眉弓上開顱，移去腦組織，暴露前顱底，取下嗅球見篩板、雞冠，於篩板 周邊切開顱底骨板向鼻腔方向切取兩側鼻腔外側壁的上、中鼻甲及相對應的鼻中隔中上部分， 取下標本放入DMEM/F12中清洗數遍以洗去嗅黏膜上的血液，剪碎後加入少量的基礎培養基， 用彎頭吸管將剪碎的組織移入15毫升離心管中，力B5毫升基礎培養基，用粗彎頭吸管上下吹打 使之成為組織懸液，離心5min 1000轉棄上清；如此重複2次，加入膠原蛋白酶0.5ug /ml用吸管吹勻，放入3X:水浴鍋中，消化15min後用吸管輕輕吹打靜置lmin吸出上清，加入(含10% 胎牛血清)D/F12的離心管中，如此重複3次基本可以將組織消化為單細胞懸液，將消化終止 後的懸液收集一起離心，D/F12清洗3次，用內含表皮生長因子的條件培養基傳代培養。
4.第一天觀察孔內含有大量的單個細胞，貼附於板壁，以及少量的血細胞。第二天觀 察孔內的單個細胞逐漸聚集成球懸浮於培養液中，血細胞大量繁殖，此時需要傳代。第三
天觀察細胞球基本全部貼壁，並長出突出，此時細胞大量分裂，第四天需要傳代。如此反
復進行細胞傳代，傳至20代細胞基本處於穩定的分裂狀態，細胞均可作為治療中樞神經系統 疾病的種子細胞。而血細胞及各種黏膜中的成熟細胞隨著傳代的增加逐漸凋亡消失。
權利要求
1. 一種嗅幹細胞的體外培養方法，其特徵是在體外培養人胚胎嗅黏膜神經幹細胞，以獲得足夠數量的嗅神經幹細胞、嗅神經前體細胞和嗅鞘前體細胞，用應於中樞神經系統損傷的細胞移植臨床治療和基礎研究。
2. 根據權利l所述的嗅幹細胞的體外培養方法，其特徵是自人胚胎(4~6)月分離，剪取 部分嗅黏膜經含DNA (0.01%)的胰酶和膠原蛋白酶消化製成細胞懸液，接種於十二孔無 菌培養板中用含EGF， b^FGF， B27等一系列神經營養因子培養並傳代至20代，動態觀察 神經幹細胞克隆球的形成及生長過程。
3. 根據權利2所述的嗅幹細胞的體外培養方法，其特徵是用nestin (巢蛋白)、tubulin (微 管蛋白)、NSE (神經元特異性烯醇酶)、GFAP (神經膠質酸性蛋白)多種抗體作免疫 細胞化學染色，對陽性細胞進行形態學鑑定。
4. 根據權利1所述的嗅幹細胞的體外培養方法，其特徵是應用範圍非常廣泛，主要包括(1)臨床治療應用範圍脊髓損傷，運動神經元病，腦性癱瘓，腦卒中後遺症，Alzheimer 病，多發性硬化，帕金森病，頑固性疼痛，癲癇，脫髓鞘疾病，顱腦損傷後遺症，橄欖-橋腦-小腦萎縮，腎上腺腦白質營養不良，額顳葉痴呆，持續性植物生存狀態，Friedreich 遺傳性共濟失調，脊髓炎後遺症，痙攣性截癱，脊肌萎縮症，神經系統變性退行性疾病， 神經創傷，中樞神經系統先天性或發育性疾病，中樞神經系統遺傳性疾病，中樞神經系 統中毒性疾病，中樞神經缺氧或CO中毒疾病(2)基礎研究應用範圍細胞學研究，各 種動物模型包括脊髓損傷，運動神經元病，腦性癱瘓，腦卒中後遺症，Alzheimer病，多 發性硬化，帕金森病，頑固性疼痛，癲癇，脫髓鞘疾病，顱腦損傷後遺症，橄欖-橋腦-小腦萎縮，腎上腺腦白質營養不良，額顳葉痴呆，持續性植物生存狀態，Friedreich遺傳 性共濟失調，脊髓炎後遺症，痙攣性截癱，脊肌萎縮症，神經系統變性退行性疾病，神 經創傷，中樞神經系統先天性或發育性疾病，中樞神經系統遺傳性疾病，中樞神經系統 中毒性疾病，中樞神經缺氧或CO中毒疾病的治療研究。
全文摘要
一種人胚胎嗅黏膜神經幹細胞的體外培養方法，它是通過建立人胚胎嗅黏膜神經幹細胞的體外培養方法，獲得足夠數量的嗅神經幹細胞、嗅神經前體細胞和嗅鞘前體細胞，用應於中樞神經系統損傷的細胞移植臨床治療和基礎研究。
文檔編號A61P9/00GK101429497SQ20071016635
公開日2009年5月13日 申請日期2007年11月8日 優先權日2007年11月8日
發明者黃紅雲 申請人:北京市虹天濟神經科學研究院