一種產脂肪酶的黃連木內生菌的製作方法

2023-09-17 10:50:00 2

本發明涉及一種微生物，具體涉及一種產脂肪酶的黃連木內生惡臭假單胞菌PC2(Pseudomonas putida)PC2。

背景技術：

黃連木(Pistaciachinensis Bunge)屬於漆樹科黃連木屬落葉喬木。黃連木籽含油量接近50％，脂肪酸鏈長多在C17-C19之間，是生成生物柴油的理想木本油料植物。植物內生菌(endophyte)是指一定階段或全部階段生活於健康植物的組織和器官內部的真菌或細菌。脂肪酶是一類能在水-油界面催化甘油三酯水解，並在非水相介質中催化酯合成反應的酶，可廣泛應用於食品、醫藥、皮革、日用化工等方面。但至今關於在黃連木中可產脂肪酶內生菌的報導非常有限。我們希望從黃連木種子中分離出新型的內生菌資源，並可以分離出新的脂肪酶基因從而加以應用。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是：針對上述現有技術的不足，提供一種產脂肪酶的黃連木內生菌。

上述提及的黃連木內生菌，命名為惡臭假單胞菌PC2(Pseudomonas putida)PC2，於2015年5月18日保藏於中國典型培養物保藏中心(地址：中國武漢武漢大學)，保藏編號為CCTCC NO：M2015318。

本發明的菌株PC2的形態學特徵：將培養12-16h的PC2菌株進行革蘭氏染色，置於顯微鏡下觀察，單個菌落表面光滑，白色(見圖1A)，革蘭氏染色觀察菌體呈杆狀、革蘭氏陰性菌(圖1B)。

將本發明菌株PC2接種於LB液體培養基中，28℃培養12-16h，利用TENS法提取基因組DNA，再利用細菌通用引物8F/1506R擴增16S rDNA片段。PCR擴增體系：15μL的2×Taq MasterMix(含Mg2+，dNTPs，DNA聚合酶)、10μL mQH2O、2μL的正反向引物和1μL模板DNA。PCR擴增條件：94℃預變性2min；94℃變性30s，58℃復性30s，72℃延伸2min，30個循環；72℃延伸2min。PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、並送公司測序，測序結果在NCBI網站進行BLAST比對，與惡臭假單胞菌有最大同源相似性(＞99.9％)。結合形態學特徵，鑑定本菌株PC2為惡臭假單胞菌，並將其命名為惡臭假單胞菌PC2(Pseudomonas putida)PC2。

將本發明菌株PC2以三丁酸甘油酯為底物，或以橄欖油為底物、維多利亞藍B為指示劑，於LB固體培養基上進行酶活性測定，有明顯的水解圈和變色圈，表明本發明菌株PC2能產脂肪酶。

本發明首次從黃連木種子中分離得到可產脂肪酶的內生惡臭假單胞菌PC2，為分離出新的脂肪酶基因提供了新內生菌。

附圖說明

圖1是本發明菌株PC2的形態學特徵圖。

其中：A為單菌落；B為革蘭氏染色圖。

圖2是本發明菌株PC2於維多利亞藍B篩選板和三丁酸甘油酯篩選板上的水解圈圖。

其中，C為維多利亞藍B篩選板；D為三丁酸甘油酯篩選板。

具體實施方式

實施例1

取產於江蘇的健康的黃連木果實若干，去果皮後，依次浸於75％質量濃度的酒精10min和0.1％質量濃度的HgCl2溶液10min進行表面消毒，再用無菌水清洗5次，每次1min。將表面消毒後的果實種子置於無菌研缽中，加少量無菌水磨碎，取1mL研磨液，均勻塗抹於牛肉膏蛋白腖培養基，同時以等量的最後一次清洗液為對照，各設3組平行，於30℃培養3-7天。利用平板劃線的方式，對生長出的菌種進行分離、純化，即得本發明菌株PC2。

實施例2

將本發明菌株PC2劃線培養於LB平板上，28℃培養過夜，然後接種一個單菌落於LB液體培養基，28℃震蕩培養過夜，再分別取2μL菌液，分別點在維多利亞藍B篩選板(pH為8.0)和三丁酸甘油酯篩選板上，以大腸桿菌為陰性對照，28℃培養過夜。見圖2，本發明菌株PC2在該兩種板上均產生明顯的水解圈，並且可以導致維多利亞板變色，說明本發明菌株PC2能產生鹼性脂肪酶。

上述三丁酸甘油酯篩選板：80ml LB固體培養基+1.6ml三丁酸甘油酯乳化液。其中，三丁酸甘油酯乳化液：6ml 4％阿拉伯樹膠液+1/3體積(2ml)滅菌三丁酸甘油酯，無菌條件下乳化；4％阿拉伯樹膠是取4g阿拉伯樹膠粉，加入100ml蒸餾水，加熱攪拌，121℃滅菌20min，即得。

上述維多利亞藍B篩選板：80mlLB固體培養基+1.6ml橄欖油乳化液+4mg維多利亞藍B粉末。其中，橄欖油乳化液：45ml 3％PVA+15ml橄欖油，震蕩混勻；3％PVA溶液是取7.5g PVA，加入250ml無菌水，加熱混勻，勿沸騰，即可，pH為7.5。