一種用生物反應器培養葛仙米的方法

2023-09-09 16:09:45

專利名稱：一種用生物反應器培養葛仙米的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，更具體涉及一種利用生物反應器生產培養葛仙米的方法。
背景技術：
葛仙米是一種藍藻，原名「天仙米」，學名擬球形念珠藻(Nostoc sphaeroides)，是藍藻綱，念珠藻科，念珠藻屬的一個種。葛仙米是席上珍品，食療珍品，藥膳珍品。它甚稱天下佳餚，名貴山珍。我國人民食用藍藻的文字記載是世界上歷史最悠久的，對葛仙米的認識也以有2000年了。據世界名著《本草綱目》記載「葛仙米，生湖廣沿溪山穴石上，遇大雨衝開穴口，此米隨流而出。土人撈取，初取時如小鮮木耳，紫綠色，以醋拌之，肥絕可食。土名天仙菜，幹則天仙米……。晉葛洪(注東晉人，醫學家，煉丹家，道教倫理家)隱此乏糧，採以為食，故名」。據鄂西先民世代傳頌的傳說，晉朝葛洪南貶途徑走馬患疾，迫災荒採葛仙米以食之，奇獲身疾康復之功效。後，洪入朝歌，以此奉獻皇上，體弱多病的太子食之，病除體壯，皇帝娘娘食之，四處求醫無法治癒的夜盲症病除，皇感洪恩，隨將「天仙米」賜名「葛仙米」。葛仙米營養豐富，蛋白質含量高(52-56％)，胺基酸組分齊全，含有豐富的生物活性多糖(8-12％)，維生素含量是獼猴桃的3倍以上，比柑橘高15倍，其含量接近鮮棗；富含不飽和脂肪酸和多種礦質元素如P.S.K.Ca.Fe.Se等十分豐富。因此，葛仙米具有強身健體和許多醫療保健等功效。據《全國中草藥彙編》介紹「葛仙米性寒、味淡，可以清熱、收斂、益氣、明目。主治夜盲症、脫肛，外用可治燒傷，燙傷。」由於葛仙米的生態生境比較特殊，葛仙米的生長對自然條件的選擇極為嚴格。它的生長繁殖受生態條件所限制，因而在國內，僅在我國個別山區的少數稻田中生長。葛仙米要求的生長條件是多種多樣的，如礦質營養，溫度，光照，水的酸鹼度，以及有無有害氣體、農藥、自然天敵等。全球氣候變暖，環境變化和汙染已不是短期內憑一部分人的意志可以改變的，欲求糧食的豐收，農藥與化肥的使用也不可避免。於是矛盾就出來了，一方面是葛仙米產量下降，產品質量逐步降低；而人們的需求上升，另一方面是產地減少，加上大量採收，自然生態遭到破壞，使得本來就貧乏葛仙米的產量不斷下降。

發明內容
本發明的目的在於提供一種利用生物反應器培養葛仙米的方法，此方法易行，操作方便，適宜工業化生產；解決了葛仙米生長快，產量高、成本低的問題。
為了達到上述目的，本發明採用了以下技術措施A、培養液配製將稱好或配製好的貯藏液加入水中的順序是按每升水中加入硫酸鎂0.07-0.08g、氯化鈣0.03-0.042g、檸檬酸0.005-0.007g、檸檬鐵銨0.005-0.007g、乙二酸四乙酸二鈉鹽(EDTA)0.001-0.002g、碳酸鈉0.03-0.05g、微量元素A51mL、磷酸氫二鉀0.07-0.09g，即可得培養液。
B、葛仙米種子製備1)一級種子由試管原種接到小三角瓶(150ml)，靜止培養或通氣培養；培養到出現細微小顆粒後轉入二級種子培養。
2)二級種子由一級種子接到500-1000ml培養瓶通氣培養，達到微小圓珠狀後進入三級種子培養。
3)三級種子由二級種子接入到5-10L培養瓶進行養殖，葛仙米顆粒達到小顆粒狀時，轉入規模化養殖容器中(10L以上容器)進行生產。
4)二或三級培養物得到的球形體長到約直徑0.8-1.2mm的培養物就可作為大量培養的接種種源；也可用收穫物中通過篩濾出的直徑在1-1.5mm的葛仙米小球體作為種子繼續培養。
C、生物反應器培養(普通生物反應器)1)採用一般生物反應器該裝置可以控制溫度、光強、營養液及通氣條件等；控制溫度28-30℃，光強80-100μE.m-2.s-1，容積180-240l/個。
2)培養場地與培養器可在室內或塑料大棚中，有條件的地方也可在玻璃溫室安置光生物反應器。並配備一個孔徑約0.5cm的不鏽鋼篩，用來篩選合格的球形體。
3)接種與培養按每升培養液0.5-2g溼重的比例接種於光生物反應器中。用空氣充氣泵通氣(通氣起到攪動和提供CO2的作用)以5-10L/min的速度從通氣口通氣。為了減少氣體對培養物的汙染，進入反應器之前，將氣體以棉花過濾。通氣量由閥門控制。
D、監控建立的監控條件和標準。溫度25-30℃；光強700-800μE.m-2.s-1pH8.0-8.5；其它細菌(主要有粘細菌)、真菌(主要為黴菌類)和雜藻(主要有小球藻等單細胞綠藻)檢測(1)塗平板法將培養液塗布在細菌培養的基本培養基上，37℃溫培24小時後，觀察是否由菌落出現；(2)顯微觀察取少量培養液，加入DAPI(一種螢光染料)至終濃度1μg/ml染色5分鐘，在螢光顯微鏡下用紫外光激發觀察。若發現有藍綠運動亮點，即為雜菌汙染。(3)顯微鏡下直接觀察是否有雜藻存在。營養鹽濃度檢測方法參看美國出版的Standard Methods for Water and Waste Water一書。
若檢測的值不在上述範圍內，則需通過相應的措施解決。如溫度可通過調節室內溫度控制；光強度光生物反應器內光強較穩定(700-800μE.m-2.s-1)；pH通過酸或鹼調節。微生物汙染嚴重時則需徹底更換培養液，並對反應器進行滅菌處理。營養不足時則注入新鮮培養液或添加營養鹽等。
E、收穫將欲收穫葛仙米培養物通孔略小於0.5cm的不鏽鋼篩子過篩。直徑0.5cm左右的球形體留在篩子上，這些就是所要獲得的葛仙米產品。篩下來的葛仙米小群體和培養液經處理後繼續作種子培養。
F、提高葛仙米球形體的機械強度將過篩後直徑大於0.5cm的葛仙米球形體通過下面任一途徑提高機械強度。一種是在培養液中加入1.5g/L的碳酸鈉，將球形體轉移到這種含有新鮮培養液中，以培養時的同樣條件通氣培養3-5天，收穫即可；另一種是將合格的球形體靜置於原培養液中，於低溫下(1-10℃)靜置10-15小時。並注意，在靜止時，要將反應器置於少於10μE.m-2.s-1的光強下以防止球形體的裂解。
G、乾燥收穫的球形體若不及時乾燥，就會腐爛變質。乾燥時，由於球形體胞外具有的多糖有高粘性，因此極易與盛放器皿黏結在一起。因此在乾燥時把藻體放在絹布或絲網上就可避免黏結。乾燥的方法有篩幹，風乾或烘乾。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果方法易行、設備簡單、操作方便、產量高，產品質量好、無汙染、安全性高、生長過程短，可廣泛適用於城鄉大規模的工業化生產。葛仙米培養的過程中吸收二氧化碳，並向大氣中排放出氧氣，可起到淨化空氣的作用，不產生有害或有毒物質，培養液鹽度低，酸鹼度接近於自然水體，可循環利用。生長過程短，葛仙米生長快，10天就可完成對數生長，效率高，適量接種的培養物，20天後產量可達2-2.5g(乾重)/l，每立方米培養液可收穫2kg幹藻。
具體實施例方式
利用生物反應器培養葛仙米方法的具體實施步驟如下1、培養液配製將稱好或配製好的貯藏液加入水中的順序是按每升水這加入硫酸鎂0.075g、氯化鈣0.036g、檸檬酸0.006g、檸檬鐵銨0.006g、乙二酸四乙酸二鈉鹽(EDTA)0.001g、碳酸鈉0.03g、微量元素A51ml、磷酸氫二鉀0.07g。
2、葛仙米種子製備2.1一級種子製備由試管原種接到小三角瓶(150ml)，放置在培養架(或箱)上，在光照10μE.m-2.s-1，溫度28℃條件下靜止培養或通氣培養；培養到出現細微小顆粒後轉如二級種子培養。
2.2二級種子製備由一級種子接到500-1000ml培養瓶，放置在培養架(或箱)上，在光照50μE.m-2.s-1，溫度28℃條件下通氣培養，達到微小圓珠狀後進入三級種子培養。
2.3三級種子製備由二級種子接入到5-10L培養瓶進行養殖，在光照80μE.m-2.s-1，溫度28℃條件下通氣培養，葛仙米小顆粒達到約直徑在1mm左右時，為製備好的規模化生產所用的種子。
3.接種培養(生物反應器培養)3.1生物反應器可以控制溫度、光強、營養液及通氣條件等；控制溫度28-30℃，光強100μE.m-2.s-1，容積180L/個。
3.2培養場地與培養器可在室內或塑料大棚中，有條件的地方也可在玻璃溫室安置光生物反應器。並配備一個孔徑約0.5cm的不鏽鋼篩，用來篩選合格的球形體。
3.3接種與培養按每升培養液0.5-2g溼重的比例接種於光生物反應中。用空氣充氣泵通氣(通氣起到攪動和提供CO2的作用)以5-10L/min的速度從通氣口通氣。為了減少氣體對培養物的汙染，進入反應器之前，將氣體以棉花過濾。通氣量由閥門控制。
4、監控建立的監控條件和標準。溫度28℃；光強800μE.m-2.s-1pH8.0；其它微生物如細菌，真菌和雜藻檢測(1)塗平板法將培養液塗布在細菌培養的基本培養基上，37℃溫培24小時以上後，觀察是否由菌落出現；(2)顯微觀察取少量培養液，加入DAPI(一種螢光染料)至終濃度1μg/ml染色5分鐘，在螢光顯微鏡下用紫外光激發觀察。若發現有藍綠運動亮點，即為汙染微生物。(3)顯微鏡下直接觀察是否有雜藻存在。營養鹽濃度檢測方法參看美國出版的Standard Methods for Water and Waste Water一書。若檢測的值不在上述範圍內，則需通過相應的措施解決。如溫度可通過調節室內溫度控制；光強度光生物反應器內光強較穩定(700-800μE.m-2.s-1)；pH通過酸或鹼調節。微生物汙染嚴重時則需徹底更換培養液，並對反應器進行滅菌處理。營養不足時則注入新鮮培養液或添加營養鹽等等。
5、收穫將欲收穫葛仙米培養物通孔略小於0.5cm的不鏽鋼篩子過篩。直徑0.5cm左右的球形體留在篩子上，這些就是我們所要獲得的葛仙米產品。篩下來的葛仙米小群體和培養液經處理後繼續作種子培養。
6、提高葛仙米球形體的機械強度將過篩後直徑大於0.5cm的葛仙米球形體通過下面任一途徑提高機械強度。一種是在培養液中加入1.5g/L的碳酸鈉，將球形體轉移到這種含有新鮮培養液中，以培養時的同樣條件通氣培養3-5天，收穫即可；另一種是將合格的球形體靜置於原培養液中，於低溫下(1-10℃)靜置10-15小時。並注意，在靜止時，要將反應器置於少於10μE.m-2.s-1的光強下以防止球形體的裂解。
7、乾燥收穫的球形體若不及時乾燥，就會腐爛變質。乾燥時，由於球形體胞外具有的多糖有高粘性，因此極易與盛放器皿黏結在一起。因此在乾燥時把藻體放在絹布或絲網上就可避免黏結。乾燥的方法有篩幹，風乾或烘乾。
權利要求
1.一種用生物反應器培養葛仙米的方法，包括下列步驟A、培養液配製按每升水加入硫酸鎂0.07-0.08g、氯化鈣0.03-0.042g、0.001-0.002g、碳酸鈉0.03-0.05g、微量元素A51ml、磷酸氫二鉀0.07-0.09g；B、葛仙米種子製備一是一級種子製備，由試管原種接到三角瓶，放置在培養架上，在光照10μE.m-2.s-1，溫度25-30℃條件下靜止培養，培養到小顆粒後轉二級種子培養；二是二級種子製備，由一級種子接到培養瓶，放置在培養架上，在光照10μE.m-2.s-1，溫度25-30℃條件下通氣培養，達到圓珠狀後進入三級種子培養；三是三級種子製備，由二級種子接入到培養瓶進行養殖，在光照10μE.m-2.s-1，溫度25-30℃條件下通氣培養，葛仙米顆粒直徑在0.8-1.2mm時，為製備好的規模化生產所用的種子；C、生物反應器培養一是採用生物反應器控制溫度28-30℃，光強80-100μE.m-2.s-1，容積180-240L/個；二是培養場地與培養器在室內或塑料大棚中，有條件的地方也可在玻璃溫室安置光生物反應器；三是接種與培養按每升培養液0.5-2g溼重的比例接種於光生物反應中，用空氣充氣泵通氣，以5-10L/min的速度從通氣口通氣，進入反應器之前，將氣體滅菌以棉花過濾，通氣量由配氣閥門控制；D、監控建立的監控條件和標準為，溫度28-30℃，光強700-800μE.m-2.s-1，pH8.0-8.5；E、收穫將收穫葛仙米培養物通孔小於0.5cm的不鏽鋼篩子過篩，直徑0.5cm的球形體留在篩子上，為葛仙米產品，篩下來的葛仙米小群體和培養液經處理後繼續作種子培養；F、提高葛仙米球形體的機械強度將過篩後直徑為0.5cm的球形體在培養液中加入1.5g/L的碳酸鈉，將球形體轉移到含有新鮮培養液中，以培養時的同樣條件通氣培養3-5天，收穫即可；G、乾燥乾燥時把藻體放在絹布或絲網上就可避免黏結，乾燥有篩幹，風乾或烘乾。
全文摘要
本發明公開了一種用生物反應器培養葛仙米的方法，1.培養液配製，採用硫酸鎂、氯化鈣、檸檬酸、檸檬鐵銨、乙二酸四乙酸二鈉鹽、碳酸鈉、微量元素液A5、磷酸氫二鉀按比例配製；2.藻種製備，二或三級培養物得到的球形體的培養物作為培養的接種種源；3.生物反應器培養，控制溫度、光強、培養液通氣條件；4.製備接種物；5.培養；6.監控；7.收穫；8.提高葛仙米球形體的機械強度；9.乾燥。本發明方法易行、設備簡單、操作方便、產量高，產品質量好、無汙染、安全性高、生長過程短，廣泛適用於城鄉大規模的工業化生產。
文檔編號A01H13/00GK1528127SQ20031011121
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月10日 優先權日2003年10月10日
發明者沈銀武, 劉永定, 吳國樵, 李敦海, 劉其芳, 丘昌強 申請人:中國科學院水生生物研究所