一種青蛤抗腫瘤酶解寡肽的製作方法

2023-09-14 10:48:10

本發明涉及一種海洋生物活性寡肽，具體涉及一種青蛤抗腫瘤酶解寡肽。
背景技術：
：前列腺癌的發病率在男性惡性腫瘤中位居首位，好發於老年男性。在我國，前列腺癌發病率呈逐年上升趨勢，居泌尿系統腫瘤的首位，嚴重威脅老年男性的健康。傳統治療方法如手術、放療和冷凍治療等效果並不理想，且復發率比較高，並且當復發的前列腺癌轉化為非雄激素依賴性時，治療將更困難；而化療藥物產生耐藥性後，療效更差並毒副作用明顯。因此，尋找抗前列腺癌藥物成為學者們研究的熱點。海洋是發現新型抗癌藥物的一個豐富的資源寶庫，多種海洋寡肽、糖胺聚糖等都具有抗腫瘤、抗病毒、抗真菌等生理活性。從雙殼貝類中提取的文蛤寡肽Mere15、菲律賓蛤仔寡肽對人慢性骨髓性白血病K562細胞、前列腺癌細胞具有增殖抑制作用，並導致濃度依賴性細胞凋亡；從近江牡蠣提取的糖胺聚糖具有體內外抗腫瘤活性，不僅可以抑制K562、CNE-2Z、Hela細胞的生長，還對CTX損傷小鼠的免疫功能有一定的修復作用。青蛤（Cyclinasinensis）屬於軟體動物門，鰓瓣綱，異齒亞綱，簾蛤目、簾蛤科，含高蛋白、低脂肪和高含量的不飽和脂肪酸，味道鮮美，具有很好的營養價值。青蛤在民間入藥具有悠久的歷史，是一種重要的海洋藥物，具有軟堅散結、清熱燥溼及鎮咳作用。ChangxingJ等從青蛤中提取出的多糖具有抗氧化和保肝活性，對人胃癌BGC-823細胞的生長具有強烈的抑制作用。然而，目前關於青蛤寡肽的提取及活性的研究報導並不多，本實驗採用蛋白酶酶解青蛤內臟，經正交實驗獲得最佳酶解條件，經分離純化，篩選出活性寡肽，研究其體外抗人前列腺癌DU-145細胞的活性，以期為青蛤活性寡肽的製備及抗癌作用研究提供實驗依據。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是提供一種具有抗腫瘤功效的青蛤抗腫瘤酶解寡肽。本發明為解決上述技術問題所採取的技術方案為：該寡肽的胺基酸序列為Ile-Leu-Tyr-Met-Pro（ILYMP），分子量為635.82Da。該肽採用如下方式製備：1）取青蛤勻漿，以活性酶在最適酶解溫度及pH值條件下，加蛋白酶200~12000U/g、保溫4~10h進行酶解；然後後滅活，在0~4oC、12000r/min的條件下離心，取上清；2）取最佳酶種及最優酶解條件下酶解的上清液，用截留分子量為3ku的超濾膜進行超濾；3）取超濾組分進行瓊脂糖凝膠層析分離，濃度：0.01~0.5g/mL，離心後取上清過0.22µm濾膜，進行洗脫；收集洗脫產物，冷凍乾燥；4）取組分過HPLC進一步分離得到青蛤抗腫瘤酶解寡肽。與現有技術相比，本發明提供的一種青蛤抗腫瘤酶解寡肽的優點在於：本發明工藝科學合理，操作簡單，隨著青蛤抗腫瘤酶解寡肽（CSOP）濃度的增加，作用時間的延長，DU-145細胞的增殖抑制率明顯上升；倒置顯微鏡下觀察、AO/EB螢光染色、Hoechst33258螢光染色及透射電鏡技術實驗表明細胞出現凋亡的形態學變化；流式細胞術結果表明，細胞早期凋亡率及線粒體膜電位下降所佔百分率增加，且隨著CSOP濃度增加，早期凋亡率增加較為明顯，其膜電位下降更為顯著，即預示線粒體凋亡信號通路在CSOP誘導的DU-145細胞凋亡過程中起著重要作用。同時，本發明所製備的青蛤抗腫瘤酶解寡肽是天然原料經酶解製得，安全、無毒副作用，抗腫瘤活性顯著，青蛤抗腫瘤酶解寡肽可以作為抗前列腺癌藥品、功能食品進行開發。附圖說明圖1本為發明實施例分子結構示意圖；圖2本為發明實施例瓊脂糖凝膠柱洗脫峰示意圖；圖3本為發明實施例寡肽組分在280nm處高效液相色譜圖；圖4本為發明實施例寡肽對DU-145細胞的增殖抑制作用對比圖；圖5為本發明實施例對DU-145細胞nm23H1蛋白的表達示意圖。具體實施方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例：一種青蛤抗腫瘤酶解寡肽製備工藝流程如下：1）樣品的製備將青蛤洗淨、去殼、取內臟，並用0.1mol/L的NaoH溶液浸泡去脂，於蒸餾水中輕輕攪拌去雜質，加一倍體積的純水勻漿後備用。2）青蛤的酶解：分別取10.0g勻漿樣品，以鹼性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶這5種酶為供試酶種，在各自最適酶解溫度及pH值條件下（見表1），加蛋白酶1200-1800U/g、保溫1-6h進行酶解。結束後滅活15min，4oC、12000r/min離心10min，取上清。表1不同蛋白酶的最適酶解溫度和pH酶種酶解溫度（℃）酶解pH鹼性蛋白酶45.010.0胰蛋白酶37.08.0木瓜蛋白酶60.06.0中性蛋白酶45.07.0胃蛋白酶37.02.0作為優選，最優酶種為木瓜蛋白酶。料液比為1:4，pH值為7.0，加酶量為1500U/g，溫度為45.0℃，酶解時間是4h。3）青蛤抗腫瘤酶解寡肽的分離純化：將選取上述上清液＜3ku分子段酶解液進行下步純化。具體過程為：取＜3ku分子段凍幹樣品進行瓊脂糖凝膠層析，於280nm處出現三個峰，即峰1、峰2和峰3，見圖2，收集各峰組分，冷凍乾燥。MTT法顯示峰1和峰3對DU-145細胞的抑制活性較好。收集峰1冷凍乾燥。峰1即為青蛤酶解寡肽，該峰的保留時間約為12min，峰面積16.32，峰高1999.79，經N端測序得出該肽的胺基酸序列為：Ile-Leu-Tyr-Met-Pro，分子量635.82Da。CSOP作用DU-145細胞後的MTT結果見圖4。青蛤酶解寡肽（即CSOP）濃度的增加、作用時間的延長，增值抑制率IR明顯上升。當CSOP濃度為2mg/mL，作用時間為24h，IR為9.89±0.49%；而當濃度為15mg/mL，作用時間72h，IR達到84.17±4.21%，IC50為5.36±0.27mg/mL，與對照組相比具有統計學意義（P＜0.05）。nm23H1蛋白陽性表達為細胞質內出現棕色結構。A正常DU-145細胞B2mg/mLCSOP組DU-145細胞，C8mg/mLCSOP組DU-145細胞，D12mg/mLCSOP組DU-145細胞。對照組大部分細胞胞漿內呈淺棕色，個別細胞呈現陰性（見A）。而隨著CSOP作用濃度的增加，視野下的細胞數量明顯減少，細胞質內的陽性部位顏色逐漸加深，出現了巨核細胞，部分細胞核呈固縮狀態。最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的一個具體實施例。顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。SEQUENCELISTING浙江海洋學院一種青蛤抗腫瘤酶解寡肽zjou-yzs-011PatentInversion3.515PRT人工合成1IleLeuTyrMetPro15當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp