一種抗肺癌a549細胞增殖的中藥提取物及其製備方法
2023-09-20 04:03:05 1
專利名稱：：一種抗肺癌a549細胞增殖的中藥提取物及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及中藥
技術領域：
，具體的說是涉及一種抗肺癌A549細胞增殖的中藥提取物及製備方法。
背景技術：
：肺癌(lungcancer)原發於支氣管黏膜和肺泡上皮細胞，是當今全球常見惡性腫瘤之一，近年來已居惡性腫瘤之首，特別是隨著人口老齡化，城市人口比例逐年升高，城鎮工業生產迅速發展，環境汙染進一步惡化，吸菸等不良習慣相當普遍等原因，其發病率在我國呈上升趨勢[1'2]。據世界衛生組織(WHO)預測，到2025年，我國每年新增的肺癌病死例數將超過100萬，患病人數將居世界之首[3]。治療包括肺癌在內的腫瘤一直是臨床醫學研究和新藥開發的熱點，但是傳統的放化療由於缺乏特異性，取得療效的同時往往給患者帶來較大的毒副反應，而中藥(包括單味藥和中藥複方)在這方面已嶄露頭角，並迅速發揮重要作用，具有廣闊的開發前景。
發明內容針對肺癌高發病率及西醫西藥治療局限性的現狀，本發明目的在於提供一種抑制肺癌A549細胞增殖的中藥提取物及製備方法。本發明的目的是通過一下的技術方案來實現的1.處方一種抗肺癌A549細胞增殖的中藥提取物，其特徵在於該提取物由下列重量配比的原料藥所製成貓爪草515g、金蕎麥515g、魚腥草515g、仙鶴草515g、冬瓜子5~15g、山茨菇10~20g、蘇木10~20g、紅花10~20g、法半夏10~20g、膽南星5~15g、沙參5~15g、玉竹515g、麥冬515g。上述中藥提取物的製備方法，其特徵在於其方法步驟如下-1)將處方藥13味加水煎煮，過濾收集提取液，把提取液濃縮得提取液I;2)取提取液I精製取上述提取液I用石油醚萃取，得精製提取液II:3)精製的提取液n純化將精製提取液n經大孔樹脂柱富集，用蒸餾水洗脫至無色，用乙醇洗脫，收集洗脫液，經濃縮，即得本發明的中藥提取物。上述步驟l)中加水的水量為藥材量的15~110倍，煎煮0.5-1.0小時，過濾收集提取液濃縮至0.5g生藥/ml。上述步驟2)中用與提取液I等量的石油醚萃取56次。上述步驟3)中用10~40%的乙醇洗脫，收集洗脫液濃縮至10g生藥/ml、上述的中藥提取物在製備治療抗肺癌藥物中的應用。1.1處方來源肺為嬌髒，主氣，司呼吸，其氣宜宣宜降。肺在病理狀態下常為"貯痰之器"。肺癌患者的臨床主要表現為咳嗽、咯痰，痰多或少，痰色或白或黃或灰黑，痰質或清稀如水、或粘稠濁膩，或痰中夾血，氣急，胸悶，胸痛。西醫學診斷通過CT、MRI、支氣管鏡、脫落細胞檢查等發現肺部實質性佔位病變及惡性細胞。周仲瑛教授為中國著名中醫，博士生導師，政府津貼專家，已業醫六十餘年，醫德高尚，技藝精湛，治癒急疑難雜症患者難計其數。近年來，隨著腫瘤發病率的增高，肺癌患者急驟增多。周老師結合肺的生理病理特點，經過數十年的臨床觀察與治療，認為肺癌的關鍵癌毒因素在於痰濁、瘀血、氣逆；肺之氣陰兩虛是肺癌發生、復發，轉移的關鍵。因此確立治則為祛邪治標實，固本培正虛。治法重在化痰洩濁，活血祛瘀、行氣降逆以及益氣養陰。根據病患病期之不同，病理因素的重點而隨證治療。多選用冬瓜子、法夏、膽南星(燥溼化痰)；山茨菇、貓爪草、金蕎麥、魚腥草(軟堅散結)，仙鶴草、蘇木、紅花(活血化瘀)；沙參、玉竹、麥冬(益氣養陰)等藥物。該抗肺癌有效經驗方又名周氏克金巖方(下簡稱克金巖方)，通過大量臨床研究，肺癌的中醫治療在改善患者臨床症狀，防止復發，穩定瘤體，提高生活質量等方面均有良好的作用，成為腫瘤綜合治療手段中必不可少的組成部分。1.2.藥效學研究1.2.1處方提取物製備將上述處方13味藥材加10—15倍量水提取0.5—1小時，共3次，合併濾液，減壓濃縮至0.5g生藥/ml為全方提取物I。1.2.2細胞來源人肺癌A549細胞由南京大學生命科學院惠贈。1.2.3A549細胞的增殖抑制作用取對數生長期A549細胞，消化、重懸，調節細胞濃度為5xl0MVmL，接種至96孔培養板，每孔0.2mL，繼續培養24小時後，每6孔為一組，吸棄細胞培養液，每組添加由細胞培養液配製成提取物I，每孔0.2mL，另有6孔對照組，每孔加入0.2mL細胞培養液。分別於培養24小時後，吸棄培養液，每孔添加新細胞培養液0.2mL，並加入20nL5mg/mL的MTT(用PBS配製)，繼續培養4小時後，吸棄培養液，每孔加入0.15mLDMSO，振搖30min，充分溶解細胞內生成的紫色甲臢結晶，於490nm下測定每孔吸光度(OD值)。結果見表l。提取物I可顯著抑制A549細胞的增殖作用。表lMTT法檢測提取物I對A549細胞的增殖抑制作用tableseeoriginaldocumentpage5注與對照組比較，*:p<0.05,**:p<0.012.部位提取物2.1部位提取物製備提取物I用等量石油醚萃取5—6次，水層為精製提取物II。提取物II經大孔樹脂富集，水洗無色後，收集10%—40%乙醇洗脫液，濃縮為提取物III(10g生藥/ml)。2.2藥效實驗2.2.1A549細胞的增殖抑制作用方法同上。結果見表2，不同濃度提取物III對A549細胞增殖有不同程度的抑制作用。表2MTT法檢測提取物III對A549細胞的增殖抑制作用tableseeoriginaldocumentpage5注:與對照組比較，*:/<0.05,2.2.2A549克隆形成實驗克隆形成實驗6孔板，每孔200個細胞，待細胞貼壁後加含藥DMED，濃度分別為表中所示，繼續培養6-10d，至對照組形成30-50個細胞/克隆時結束實驗。Giemsa染色15min，PBS洗1次，鏡檢，計算克隆數。結果見表3，不同濃度提取物III有顯著的克隆形成抑制作用，並有量效關係。表3提取物III對A549細胞克隆形成實驗tableseeoriginaldocumentpage6注與對照組比較，*:p<0.05，**:p<0.012.2.3流式細胞檢測以5xlS個/ml的密度接種A549細胞於6孔板中，每孔2.5ml。待細胞貼壁後換不含血清的培養液飢餓24h，再分別用含有終濃度為100、10、l叱/ml提取物m的培養液繼續培養，繼續培養72h收集細胞，PBS洗2次，調整細胞密度為lxl(^個/ml，PI染液避光染色30min，400目尼龍網過濾，採用流式細胞儀進行檢測，分析細胞周期各時相分布百分比。結果見表4，提取物III具有顯著促進A549細胞凋亡的作用。表4流式細胞檢測不同濃度提取物III對A549細胞周期的影響tableseeoriginaldocumentpage6*:與對照組相比，；K0.05;**:與對照組相比，"O.Ol本發明提供的一種抗肺癌的中藥提取物。由處方藥貓爪草5—15g、金蕎麥5—15g、魚腥草5—15g、仙鶴草5—15g、冬瓜子5—15g、山茨菇10—20g、蘇木10—20g、紅花10—20g、法半夏10—20g、膽南星5—15g、沙參5—15g、玉竹5—15g、麥冬5—15g提取得到。該處方藥是由我國名中醫周仲瑛教授積數十年的臨床觀察和治療的經驗方，又名周氏克金巖方，經藥效學試驗結果表明，該處方藥提取物對肺癌A549細胞的增殖有顯著的抑制作用。具體實施例方式實施例1:抗肺癌A549細胞增殖的中藥提取物及其製備方法(一)處方冬瓜子10g、法半夏12g、膽南星10g、山茨菇12g、貓爪草10g、金蕎麥10g、魚腥草10g，仙鶴草15g、蘇木12份g、紅花15g、沙參10g、玉竹10g、麥冬10g。(二)製法1、處方提取物製備取冬瓜子10g、法半夏12g、膽南星10g、山茨菇12g、貓爪草10g、金蕎麥10g、魚腥草10g，仙鶴草15g、蘇木12份g、紅花15g、沙參10g、玉竹10g、麥冬10g，加15倍量水煎煮0.5小時，過濾收集提取液，濃縮得全方提取物I(0.5g生藥/ml)。2、處方提取物精製取全方提取液I用等量石油醚萃取5次，得精製提取物II。3、部位提取物製備精製提取物II經大孔樹脂柱富集，蒸餾水洗脫至無色後，用40%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮至10g生藥/ml，即得抗肺癌A549細胞增殖的中藥提取物m。實施例2:抗肺癌A549細胞增殖的中藥提取物及其製備方法(一)處方冬瓜子5g、法半夏20g、膽南星5g、山茨菇10g、貓爪草5g、金蕎麥5g、魚腥草5g，仙鶴草10g、蘇木20g、紅花10g、沙參5g、玉竹15g、麥冬15g。1、處方提取物製備-取冬瓜子5g、法半夏20g、膽南星5g、山茨菇10g、貓爪草5g、金蕎麥5g、魚腥草5g，仙鶴草10g、蘇木20g、紅花10g、沙參5g、玉竹15g、麥冬15g，加IO倍量水煎煮I小時，過濾收集提取液，濃縮得全方提取物I(0.5g生藥/ml)。2、處方提取物精製取全方提取物I用等量石油醚萃取6次，得精製提取物II。3、部位提取物製備精製提取物II經大孔樹脂柱富集，蒸餾水洗脫至無色後，用35%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮至10g生藥/ml，即得抗肺癌A549細胞增殖的中藥提取物m。權利要求1.一種抗肺癌A549細胞增殖的中藥提取物，其特徵在於該提取物由下列重量配比的原料藥所製成貓爪草5～15g、金蕎麥5～15g、魚腥草5～15g、仙鶴草5～15g、冬瓜子5～15g、山茨菇10～20g、蘇木10～20g、紅花10～20g、法半夏10～20g、膽南星5～15g、沙參5～15g、玉竹5～15g、麥冬5～15g。2.—種製備權利要求1所述中藥提取物的方法，其特徵在於其方法步驟如下1)將處方藥13味加水煎煮，過濾收集提取液，把提取液濃縮得提取液I;2)取提取液I精製取上述提取液i用石油醚萃取，得精製提取液n;3)精製的提取液n純化將精製提取液n經大孔樹脂柱富集，用蒸餾水洗脫至無色，用乙醇洗脫，收集洗脫液，經濃縮，即得本發明的中藥提取物。3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟l)中加水的水量為藥材量的10~15倍，煎煮0.51.0小時，過濾收集提取液濃縮至0.5g生藥/ml。4.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟2)中用與提取液I等量的石油醚萃取56次。5.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟3)中用1040%的乙醇洗脫，收集洗脫液濃縮至10g生藥/ml。6.如權利要求1所述的中藥提取物在製備治療抗肺癌藥物中的應用。全文摘要一種抗肺癌A549細胞增殖的中藥提取物，它是由原料藥貓爪草、金蕎麥、魚腥草、仙鶴草、冬瓜子、山茨菇、蘇木、紅花、法半夏、膽南星、沙參、玉竹、麥冬按一定重量配比製成；其製法是首先將上述13味原料藥加水煎煮，過濾收集提取液，濃縮得全方提取液I；然後取提取液I用石油醚萃取，得精製提取液II；最後將精製提取液II經大孔樹脂柱富集、蒸餾水洗脫後，用乙醇洗脫，收集洗脫液濃縮至10g生藥/ml，即得中藥提取物，經藥效學試驗結果表明該中藥提取物對肺癌A549細胞的增殖有顯著的抑制作用。文檔編號A61P35/00GK101391042SQ200810195060公開日2009年3月25日申請日期2008年10月28日優先權日2008年10月28日發明者葉麗紅,周仲瑛,怡孫,蓮尹,旭張,陽美平申請人:南京中醫藥大學