二氧化碳含量測定方法及二氧化碳診斷試劑盒的製作方法

2023-09-20 17:49:05

專利名稱：二氧化碳含量測定方法及二氧化碳診斷試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種測定二氧化碳(碳酸氫根)含量的方法，同時本發明還涉及二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒，屬於醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
血液內二氧化碳的含量對人體內酸鹼平衡的調節起著重要的作用。血液pH的恆定是維持生命活動必不可少的條件，血漿中的多種緩衝系統中以碳酸氫鹽緩衝系統最為重要，直接影響血液的pH。
血液內二氧化碳的含量變化主要反映代謝性酸鹼平衡紊亂。單純代謝性酸或鹼中毒時，血液碳酸氫根[HCO3-]下降或升高，總二氧化碳也隨之下降或升高。而單純呼吸性酸或鹼中毒時，血液碳酸氫根升高或下降。
總二氧化碳和碳酸氫根的測定方法較可分為直接測定和間接推算兩類。直接測定主要有量氣法、量壓法、滴定法、比色法、Conway微量擴散法、流動注射氣體擴散法等。間接推算是利用血氣分析儀測得的PH與PCO2，根據H-H方程的變換形式HCO3-(m mol/L)＝0.03×PCO2(mm Hg)×antilog(PH-p ka)或HCO3-(m mol/L)＝0.225×PCO2(k Pa)×antilog(PH-p Ka)計算獲得。
式中PH為37℃時測得值，p ka在37℃為6.10。
目前，以間接推算法應用較普遍，由血液分析儀的微處理計算機並與血氣分析結果一起報告，準確性基本可以符合臨床要求。
直接測定法以滴定法應用最廣泛，但由於受多種因素影響，測定誤差較大。
酶法測定適合自動化分析，結果可靠，應當是很有前途的測定方法，但目前尚有待深入研究。
檢索中國專利發現，申請號為96190276.0、申請日為1996.02.06的發明專利申請公開了一種用來導出病人血液中氣體含量的非侵入性的系統和方法。該系統相應於體積測量呼氣中的二氧化碳濃度。然後處理該數據導出動脈血中二氧化碳氣體水平。若數據為時間域，處理可將時間域數據轉換成體積域。該方法也經迭代評估了多個變量的顯著性，所得的關係可供快速和準確地對健康人和患肺病病人進行血中氣體含量的測定。近年來，申請號為02282386.7、申請日為2002.10.29的實用新型專利公開了一種醫用的血液碳酸氫根測定儀，主要由操作面板、進樣檢測機構、定滴加液機構、攪拌機構和以單片機為主控元件的電器控制部分組成。
以上專利均與酶法測定無關，這從一個側面說明，國內此方面的實驗研究十分缺乏。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種可以克服以上現有技術缺點的二氧化碳(碳酸氫根)含量的測定方法。同時本發明還給出實現該方法的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒。採用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀上進行二氧化碳(碳酸氫根)含量測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發明測定二氧化碳(碳酸氫根)含量的步驟如下1)、將樣品與主要由磷酸烯醇式丙酮酸、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發生如下原理的反應二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草醯乙酸+磷酸根草醯乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶2)、檢測最終反應物在主波長340nm處吸光度下降的速度，測算出二氧化碳(碳酸氫根)含量的大小。
通常步驟2)將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，測算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量的大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程的測定溫度控制在常規的20℃到50℃範圍，反應時間控制在常規的2-30分鐘。二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
本發明直接應用二氧化碳(碳酸氫根)和磷酸烯醇式丙酮酸經磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用後產生草醯乙酸，再通過偶聯蘋果酸脫氫酶的作用，氧化NAD(P)H成為NAD(P)+，從而得以測定NAD(P)H在340nm處吸光度下降的幅度，通過測量340nm處吸光度下降的幅度，可以測算二氧化碳(碳酸氫根)的含量大小。
用以實現本發明方法的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒可以是單劑，包括緩衝液 40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸1--20mmol/l還原型輔酶 0.2--0.3mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000--20000U/l蘋果酸脫氫酶2000--20000U/l
穩定劑 10--80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑試劑I緩衝液 40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--20mmol/l還原型輔酶 0.2--0.3mmol/l穩定劑 10--50mmol/l試劑II緩衝液 40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000--20000U/l蘋果酸脫氫酶 2000--20000U/l穩定劑 10--80％(總體積)雙劑的配方不僅限於上述配方，其中的試劑I的成分，磷酸烯醇式丙酮酸、還原型輔酶等可以放在試劑II，試劑II其中的成分，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶等也可以放在試劑I，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，更有利於試劑的穩定試劑I緩衝液 40--200mmol/l還原型輔酶 0.2--0.3mmol/l穩定劑 10--50mmol/l試劑II緩衝液 40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--20mmol/l穩定劑 10--50mmol/l
試劑III緩衝液 40--200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000--20000U/l蘋果酸脫氫酶 2000--20000U/l穩定劑 10--80％(總體積)三劑的配方不僅限於上述配方，其中的試劑I的成分，還原型輔酶可以放在試劑II或試劑III中。試劑II其中的成分，磷酸烯醇式丙酮酸也可以放在試劑I或試劑III中，試劑III其中的成分，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶等也可以放在試劑I或試劑II中，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩衝劑的pH範圍可以是6.0～11.0。緩衝劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩衝液、磷酸鹽(Phosphate)緩衝液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩衝液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩衝液、咪唑(Imidazole)緩衝液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩衝液等，但不僅限於這些緩衝液。
以上還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等還原型煙醯胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩定劑10～80％或者10～50mmol/l，穩定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上。
實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關係的本發明二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒較為理想
緩衝液80--120mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 2--8mmol/l還原型輔酶0.2--0.3mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶6000--12000U/l蘋果酸脫氫酶 6000--12000U/l穩定劑20--50％(總體積)由於本發明是完全利用酶學方法，酶解反應具有特異性高的特點，不易受到內、外源其他物質的幹擾。酶法方法簡便、易於操作。酶解反應的特異性促使測試結果精確。酶解反應都是在緩衝液條件下進行，沒有汙染環境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測試成本低廉。因此可以保證具有較高的測試準確性，更便於推廣應用。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一(單劑)本實施例的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒包括緩衝液80mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 2mmol/l還原型輔酶0.2mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶6000U/l蘋果酸脫氫酶 6000U/l穩定劑50％(總體積)在全自動生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測二氧化碳(碳酸氫根)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應。
加入樣品和試劑後，使之混合，發生以下反應
二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草醯乙酸+磷酸根草醯乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應物置於生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的幅度，從而測算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
本實施例應用二氧化碳(碳酸氫根)和磷酸烯醇式丙酮酸經磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用後產生草醯乙酸，再通過偶聯蘋果酸脫氫酶的作用，氧化NAD(P)H成為NAD(P)+，從而得以測定NAD(P)H在340nm處吸光度下降的幅度，通過測量340nm處吸光度下降的幅度，可以測算二氧化碳(碳酸氫根)的含量大小。
實施例二(雙劑)本實施例的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑有試劑I緩衝液100mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 5mmol/l還原型輔酶0.25mmol/l穩定劑20mmol/l試劑II緩衝液100mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶9000U/l蘋果酸脫氫酶 9000U/l穩定劑50％(總體積)測定二氧化碳(碳酸氫根)含量時，溫度控制在30℃，反應時間15分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測二氧化碳(碳酸氫根)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應。
具體測定步驟為二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草醯乙酸+磷酸根草醯乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應物置於生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的幅度，從而測算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
各反應步驟的反應時間控制在15分鐘。
實施例三(三劑)本實施例的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑為三劑，有試劑I緩衝液120mmol/l還原型輔酶0.3mmol/l穩定劑20mmol/l試劑II緩衝液120mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 8mmol/l穩定劑20mmol/l試劑III緩衝液120mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶12000U/l蘋果酸脫氫酶 12000U/l穩定劑50％(總體積)在全自動生化分析儀上設定溫度25℃，反應時間20分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測二氧化碳(碳酸氫根)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應。
具體測定步驟為二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草醯乙酸+磷酸根草醯乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應物置於生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的幅度，從而測算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
各反應步驟的反應時間控制在20分鐘。
實施例四本實施例的二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑有試劑I緩衝液100mmol/l還原型輔酶0.3mmol/l穩定劑30mmol/l試劑II緩衝液100mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 4mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶8000U/l蘋果酸脫氫酶 8000U/l穩定劑50％(總體積)在生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測二氧化碳(碳酸氫根)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應。
加入樣品和試劑後，使之混合，發生以下反應二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草醯乙酸+磷酸根草醯乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應物置於生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的幅度，從而測算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
總之，實驗證明，採用本發明的測定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好，不受內、外源物質的汙染。
權利要求
1.一種二氧化碳含量測定方法，包括以下步驟1)、將樣品與主要由磷酸烯醇式丙酮酸、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發生如下原理的反應二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草醯乙酸+磷酸根草醯乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶2)、檢測最終反應物在主波長340nm處吸光度下降的速度，測算出二氧化碳(碳酸氫根)含量的大小。
2.根據權利要求1所述二氧化碳含量測定方法，其特徵在於所述步驟2)為將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速(程)度，測算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。
3.根據權利要求1或2所述二氧化碳含量測定方法，其特徵在於溫度控制在20℃到50℃範圍，反應時間控制在2-30分鐘。
4.根據權利要求1或2所述二氧化碳含量測定方法，其特徵在於被測二氧化碳樣品與試劑的比例控制在1/10到1/500。
5.一種二氧化碳診斷試劑盒，由以下成分組成緩衝液 40——200mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸1——20mmol/l還原型輔酶 0.2——0.3mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000——20000U/l蘋果酸脫氫酶2000——20000U/l穩定劑10——80％(總體積)
6.根據權利要求5所述二氧化碳診斷試劑盒，其特徵在於所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據權利要求5或6所述二氧化碳診斷試劑盒，其特徵在於所述穩定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨或鹽中的至少一種。
8.根據權利要求5或6所述二氧化碳診斷試劑盒，其特徵在於所述緩衝劑的pH範圍是6.0～11.0，所述緩衝劑是三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、三乙醇胺緩衝液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩衝液、咪唑緩衝液或雙甘氨肽緩衝液中的一種。
9.根據權利要求5或6所述二氧化碳診斷試劑盒，其特徵在於所述還原型輔酶是NADPH、NADH或thio-NADH還原型煙醯胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發明涉及一種測定二氧化碳(碳酸氫根)含量的方法，同時還涉及二氧化碳(碳酸氫根)診斷試劑盒，屬於醫學檢驗測定技術領域。該試劑盒包括緩衝液、磷酸烯醇式丙酮酸、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、穩定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生酶偶聯反應，再將最終反應物置於生化分析儀下，檢測主波長吸光度變化的情況(速度)，從而測算出二氧化碳(碳酸氫根)的含量。採用本發明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好，不受內外源物質的汙染，便於推廣應用。
文檔編號G01N21/77GK1763536SQ20041006505
公開日2006年4月26日 申請日期2004年10月20日 優先權日2004年10月20日
發明者王爾中 申請人:王爾中