糧食作物深加工製品高通量五重巢式pcr轉基因檢測方法

2023-09-20 09:37:15

>(3)五重巢式PCR反應體系(3.1)第一輪五重PCR反應體系及反應條件在第一輪五重PCR反應體系中，加DNA模板1μL(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2×PCR緩衝液，引物混合液I10μL，DNA聚合酶4U，補水至50μL，擴增條件為95℃預變性10min，10個循環(95℃，30sec；65℃，60s；72℃，60s)；10個循環(95℃，30sec；62℃，60s；72℃，60s)；10個循環(95℃，30sec；60℃，60s；72℃，60s)；10個循環(95℃，30sec；58℃，60s；72℃，60s)；最後72℃延伸10min；(3.2)第二輪五重PCR反應體系及反應條件取第一輪五重PCR產物1μL作為模板，進行五重巢式PCR第二輪擴增，反應體系加引物混合液II10μL，DNA聚合酶3U，其餘同前。擴增條件同第一輪反應條件；(4)擴增產物檢測兩輪擴增產物用瓊脂糖電泳檢測，瓊脂糖膠濃度為3％，膠中溴化乙錠濃度為0.5μg/mL，電泳緩衝液為1×TAE，DL-2000DNA做分子質量標準，電泳條件為以100V/cm電壓，電泳30min；(5)結果判定(5.1)對照樣品結果分析陽性對照PCR反應中，RBCL內標準基因和外源基因均得到了擴增，且擴增片段大小與預期片段大小一致，而陰性對照中僅擴增出RBCL基因片段，空白對照中沒有任何擴增片段，表明PCR反應體系正常工作，否則重新檢測；(5.2)試樣檢測結果分析a)RBCL內標準基因和外源基因均得到了擴增，且擴增片段大小與預期片段大小一致，表明試樣中檢測該外源基因，該樣品中含有轉該外源基因成分；b)RBCL內標準基因片段得到擴增，且擴增片段大小與預期片段大小一致，而外源基因未得到擴增，或擴增片段大小與預期片段大小不一致，表明試樣中未檢測出CP4-EPSPS、Cry1A(B)、PAT和BAR基因，該樣品不含有轉CP4-EPSPS、Cry1A(B)、PAT和BAR基因成分。全文摘要本發明公開一種糧食作物深加工製品五重巢式PCR轉基因檢測方法，其檢測方法為1.DNA提取和濃度檢測；2.引物設計；3.第一、二輪五重巢式PCR反應體系及反應條件；4.擴增產物檢測；5.結果判定。本發明技術具有高通量、快捷、準確、靈敏、經濟的諸多優點，不僅可以用來檢測轉基因大豆、玉米和水稻的單一深加工製品，還可以檢測轉基因大豆、玉米和水稻的混合深加工製品。本發明提高了檢測效率、減少了檢測時間和檢測成本，並可以有效減少假陽性的結果，因此，可以應用於對主要糧食作物如大豆、玉米和水稻豆油等轉基因深加工食品進行DNA檢測，具有實際意義。文檔編號C12Q1/68GK101402996SQ20081013746公開日2009年4月8日申請日期2008年11月6日優先權日2008年11月6日發明者仇有文,營劉,敖金霞,波曲,李慶章,袁肖寒,高學軍申請人:東北農業大學