轉基因棉花抗蟲檢測法的製作方法

2023-09-20 12:58:20 1

專利名稱：轉基因棉花抗蟲檢測法的製作方法
技術領域：
本發明屬檢測方法。
對轉基因棉花抗蟲性的檢測，目前國內外採取兩種方法，即分子檢測和生物學測定。分子檢測要使用一些精密儀器和同位素，操作複雜，一般由分子生物學研究人員完成。生物學測定，一方面需要飼養棉鈴蟲，另一方面需種子長成植株後才能鑑定，另外環境氣候還造成檢測結果不準確。種子經營和基層育種單位一般不具備分子檢測的條件，他們雖然具備生物學測定的條件，但種子單位無法在購種時檢測種子是否抗蟲，育種單位無法在選擇單株時確定所選種子是否抗蟲。因此，目前的方法不能滿足科研生產單位對轉基因棉花抗蟲的檢測。
本發明的目的就是為種子和育種單位提供一套快速檢測轉基因棉花抗蟲檢測試劑及檢測方法。
本發明包括試劑盒、試劑製備方法和檢測方法。試劑盒由4支5ml離心管、1支10ml離心管和支持膜組成，可以放置在一個塑料包裝袋內，也可以組成一個盒。這5個離心管和支持膜的組成成份如下。
1.對照液，體積1ml，將0.875mg純化毒蛋白溶於0.5mol/L磷酸緩衝液中。毒蛋白通過蘇雲金桿菌HD-1菌株發酵製備並提純。
2.提取液，體積10ml，使用時蒸餾水稀釋10倍。其成份內含5g聚山梨醇脂20，0.5mol/LTris-HCl，pH值7.9，1.5mol/L NaCl。
3.支持膜，5張，每張82mm2，為國產或進口硝酸纖維素膜。
4.封閉劑，體積5ml，用時蒸餾水稀釋10倍。其成份跟提取液基本相同。再加入7.5g胎牛血清蛋白。
5.酶標抗體，體積0.5ml，使用時用提取液稀釋500倍。製備方法為，用提純抗原免疫日本大耳白兔，純化高效價IgG抗體，用過碘酸法標記辣根過氧化物酶，再加入適量牛血清蛋白作保護劑製備而成。
6.顯色液，體積5ml，用時用蒸餾水稀釋10倍，內含25mg，3＇3二氨基聯苯胺、0.5mol/L Tris-HCl，用前加30％雙氧水。
操作方法分為快診膜製備、檢測和顯色判別三個步驟。
本方法具有操作方便、檢測靈敏、成本低廉、重複性好、不需複雜儀器等優點。最主要的特點是可以在種子期(或幼苗期)取樣，6個小時內即獲得檢測結果。經過對目前推廣的轉基因抗蟲棉檢測驗證。符合率達100％。
說明書附圖


圖1轉基因棉花抗蟲檢測設備及試劑。
圖1中，1.對照液、2.提取液、3.封閉液、4.酶標抗體、5.顯色液、6.支持膜圖2轉基因棉花抗蟲檢測操作程序本發明最佳實施例實施本發明的基本原料均已組配在試劑盒中，實施過程中還需要加樣器、蒸餾水和40℃左右的溫水。操作方法分為以下三步(1)快診膜的製備，取1g種子(或葉片)，加1ml提取液，研細，靜置1小時。用加樣器取5μl上清液加在支持膜上，並加1μl對照，自然乾燥。可以立即檢測。也可以長期保存。(2)檢測。將快診膜放入10ml封閉劑中，在37℃下封閉1小時，取出後放置在10ml酶標抗體的稀釋液中，在37℃溫育1小時。(3)顯色判別，取出快診膜、置入10ml稀釋顯色液中，待對照出現黃色斑點時，取出乾燥。凡能顯示黃色斑點的為抗蟲種子，否則不抗蟲。
本方法在種子經營和育種單位具有較廣闊的使用前途。檢測結果靈敏、方法簡單。
權利要求
1.一種轉基因棉花抗蟲檢測法，檢測試劑主要由對照液、提取液、支持膜、封閉劑、酶標抗體和顯色液組成，其特徵在於將種子或葉片提取液加在支持膜上，在封閉劑和酶標抗體液中溫育後，再由顯色液顯色，以測定棉花是否抗蟲。
2.根據權利要求1所述的轉基因棉花抗蟲檢測法，其特徵在於支持膜為硝酸纖維素膜。
3.根據權利要求1所述的轉基因棉花抗蟲檢測法，其特徵在於酶標抗體為兔抗Bt抗體。
全文摘要
轉基因棉花抗蟲檢測法,屬檢測方法。它分為檢測試劑的製備和操作方法兩部分。試劑由對照液(B
文檔編號A01C1/00GK1183558SQ9710614
公開日1998年6月3日 申請日期1997年10月16日 優先權日1997年10月16日
發明者沈法富, 於元傑, 尹承佾 申請人:山東農業大學