化合物n－全反式維甲醯胺衍生物及其製備方法和應用的製作方法

2023-09-27 05:31:40

專利名稱：化合物n－全反式維甲醯胺衍生物及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬化學領域，具體涉及化合物N-全反式維甲醯胺衍生物及其製備方法和其抗腫瘤的應用。
本發明的另一目的是提供所述化合物在製備抗腫瘤藥物中的用途。
本發明通過分子模擬結構設計，經合成和純化後，製備得新的N-全反式維甲醯胺衍生物。本發明衍生物分子仍然具有末端的羧基結構，但加入另一個氮雜環狀結構，其具有通式I的結構。 其中R代表脯氨酸，羥基脯氨酸，連接方式為醯胺鍵。
所述N-全反式維甲醯胺脯氨酸其分子的化學名稱為N-全反式維甲醯胺脯氨酸(N-all-trans-retinyl proline)，其計算分子量為398。
本發明化合物N-全反式維甲醯胺衍生物通過下述方法製備合成原料以全反式維甲酸乾粉開始，先和苯酚及三氯化磷作用，並在氮氣的保護下攪拌2-5小時，呈現橙紅色溶液，反應瓶壁上有少量的亞磷酸析出，繼續在氮氣的保護下攪拌10-30分鐘，轉移入乾燥分層漏鬥，分離出生成維甲醯氯的苯溶液，置冰浴中攪拌5-20分鐘，滴加入L-脯氨酸，後者事先溶解於2mol/l的鹼性溶液中，繼續攪拌，並用2mol/l的氫氧化鈉溶液調節溶液的pH，保持在9-12以上，去冰浴，將反應液攪拌反應過夜後，反應液分為兩層，上層為棕黃色，下層顏色較深，用乙醚提取三次，上層加入層析柱子，進行層析，分段收集樣品，進行質譜分析，取質量正確的部分，繼續進行分析。
本發明在式II的全反式維甲酸的結構基礎上改造合成了化合物N-全反式維甲醯胺脯氨酸。全反式維甲酸側鏈的末端是一個羧基，本發明化合物在側鏈的末端加上一個脯氨醯基，保留原有的羧基並使之形成醯胺鍵，脯氨醯基上還有一個羧基，因此使該分子側鏈末端的極性增加，親水性增加。本發明N-全反式維甲醯胺脯氨酸的結構式與式III的4-氨基苯酚維甲醯胺(4HPR)的結構特點進行了比較，4HPR在側鏈的末端有一個苯酚環狀結構，具有較強的疏水性，本發明N-全反式維甲醯胺脯氨酸加入了脯氨醯基的氮雜環，該氮雜環和4HPR的苯酚環狀結構類似，但是脯氨醯基的氮雜環不具有雙鍵，也沒有羥基，但具有羧基。 本發明化合物進行了實驗鑑定，結果如下1.物理特性黃色結晶粉末熔點為52℃高效薄層層析(TLC)樣品上樣量為50μg薄層層析材料為矽膠展開劑為氯仿/甲醇/水 95∶5∶3紫外線檢測Rf＝0.352.元素分析試驗測定與本化合物分子結構式計算的數值完全吻合，實驗測定值C，64.75％H，7.66％N，3.33％計算值C，64.83％H，7.62％N，3.02％3.質譜分析化合物的分子質量經Mariner ES-Mass分析儀分析，結果顯示，一個主峰質量為398.5，數值與通過分子結構式計算的398相符合，沒有明顯的雜峰，證實本化合物純度高。
4.核磁共振分析分子結構經H1-NMR分析本化合物分子結構正確。
實驗表明本發明具有調節肝癌細胞中α1，6巖藻糖糖基轉移酶(FUT8)的作用，FUT8負責N-型糖鏈(Asn-bound glycan)的核心巖藻糖基合成。N-型糖鏈的結構對許多細胞功能如生長發育具有重要的作用，如細胞表面的N-型糖鏈被抑制和切除，則將導致細胞的生長緩慢甚至調亡死亡。而細胞表面的N-型糖鏈對細胞黏附功能尤為重要，某些N-型糖鏈直接參與細胞與細胞外基質的接觸和黏附作用，這種細胞與細胞外基質的作用和黏附在腫瘤轉移過程中具有重要的意義。N-型糖鏈中β1，6GlcNAc分枝的含量多少直接影響腫瘤細胞對細胞外基質如纖連素，層連素黏附的強弱，剔除合成這種結構的糖基轉移酶之後的小鼠，或含有這種糖基轉移酶的轉基因動物，以及剔除小鼠和轉基因動物雜交後均可以顯著地影響腫瘤在小鼠體內的轉移能力。N-型糖鏈的結構中的核心巖藻糖與腫瘤細胞轉移能力有關，在脯乳動物α1，6巖藻糖是唯一的核心巖藻糖(又稱FUT8)，FUT8具有SH3同源序列又有SH3配體的同源區域，有多個富含脯氨酸的motifs，因此整個分子形成一個穩定的核心結構，同時還具有與其它巖藻糖轉移酶同源的保守催化序列。已有報導在肝癌病人的血漿和肝癌細胞中，FUT8活性均比正常對照輕度升高，肝癌組織FUT8活性為175±78pmol/mg/h，癌周組織為144±34pmol/mg/h，正常肝組織為79±19pmol/mg/h。FUT8活性還與肝癌組織的分化程度相關，高度分化的肝癌為38±0.7pmol/mg/h，中度分化的肝癌為177±182pmol/mg/h，低分化的肝癌為219±189pmol/mg/h。肝癌細胞中的FUT8活性改變也是由於該基因的mRNA表達升高所致，升高的FUT8活性能促進甲胎蛋白的巖藻糖糖基化，還與整合蛋白的糖鏈加工有關。通過基因轉染技術，使肝癌細胞過高表達FUT8，可以使整合蛋白過度巖藻糖化，抑制肝癌細胞在體內的轉移能力。因此FUT8基因表達的調控無論對腫瘤細胞的生長還是轉移都具有重要的意義，促使該基因在肝癌細胞中過高表達，就可能抑制肝癌細胞的轉移能力。
本發明化合物N-全反式維甲醯胺衍生物，經試驗證實其對α1，6巖藻糖糖基轉移酶(FUT8)明顯的調節作用，並且毒性比維甲酸低，抑制肝癌細胞作用比維甲酸強，有顯著抑制肝癌細胞在裸鼠體內的轉移潛能的作用，可製備新型抗腫瘤藥物，尤其是抗惡性程度高並生存率低的肝癌藥物，具有較高的、潛在的社會效益和應用前景。
其中上樣標本100μmol N-全反式維甲醯胺脯氨酸溶解於50％甲醇和2mmol/l醋酸中。
圖2是H1-NMR分析圖譜。
2、對肝癌細胞表面Lewis抗原的表達影響N-全反式維甲醯胺脯氨酸作用Hep3B肝癌細胞1-3天，然後用一系列特異性抗體(Lewis a，b，x，y和Sialyl Lewis抗體)檢測觀察細胞表面的Lewis抗原表達量，結果表明，經N-全反式維甲醯胺脯氨酸作用3天以後，細胞表面的Lewis x抗原表達量顯著減少，P＜0.05。Lewis抗原是細胞表面的重要抗原，可以作為黏附分子的配體，在腫瘤細胞的轉移中起重要作用，已知Lewis抗原與結腸癌和肝癌的轉移有密切的關係，經N-全反式維甲醯胺脯氨酸作用以後，肝癌細胞表面的Lewis x表達量減少，表明本化合物能影響肝癌細胞Lewis抗原的表達。表2是本化合物對肝癌細胞表面Lewis抗原表達的影響作用。
3、對肝癌細胞表面糖鏈的核心巖藻糖結構的影響核心巖藻糖是處於N-型糖鏈的核心部分，是N-型糖鏈核心結構中唯一個巖藻糖糖基，該糖基以α-1，6糖苷鍵連接於核心結構中的氨基乙醯葡萄糖。所述核心巖藻糖結構具有與小扁豆凝集素(LCA)結合的特性，本發明利用LCA結合核心巖藻糖，AAL凝集素結合外周側鏈巖藻糖結構的特點，觀察肝癌細胞經過3μM的N-全反式維甲醯胺脯氨酸作用3天以後的核心巖藻糖的改變，檢測採用流式細胞儀測定，結果顯示，經N-全反式維甲醯胺脯氨酸作用以後，Hep3B細胞表面的LCA結合量顯著增加(P＜0.01)，維甲酸的另一衍生物4HPR作用不顯著。
表3是N-全反式維甲醯胺脯氨酸作用後細胞表面糖鏈巖藻糖殘基含量。
4、肝癌轉移灶和正常肝組織的巖藻糖轉移酶活性核心巖藻糖是以α-1，6-糖苷鍵連接於核心糖鏈，催化這種糖苷鍵的酶為α-1，6巖藻糖轉移酶(α-1，6FT)，Lewis抗原結構中含有巖藻糖糖基，上述糖基通常是以α-1，3/4巖藻糖糖苷鍵連接於糖鏈，催化這些糖苷鍵的生成可以是α-1，3/4巖藻糖轉移酶(α-1，3/4FT)，本發明直接測定並比較了肝癌轉移灶和正常幹細胞的巖藻糖轉移酶活性。所述肝癌轉移灶組織來源於裸鼠肝癌轉移模型，先注射Hep3B細胞到裸鼠脾臟組織中，2個月後解剖裸鼠，選擇肝臟轉移灶組織和正常肝組織作為酶的來源，測定其中的α-1，6FT和α-1，3FT活性，進行比較，結果為，轉移灶肝組織的α-1，6FT活性比母細胞株顯著降低，比正常肝組織活性升高(P＜0.05)，轉移灶組織的α-1，3FT活性與正常肝組織無顯著的差別，但也比母細胞株低很多。結果表明轉移灶組織的巖藻糖糖鏈結構有異常。
表4是肝組織的巖藻糖糖基轉移酶酶活性的測定。
表5是三種化合物對肝癌細胞α-1，6FT的作用比較(pmol/hr·mg)。
表6是裸鼠體內肝癌轉移試驗。
表1.
N-全反式維甲醯胺脯氨酸作用Hep3B細胞4天均值G0-G1G2-M S G2/G1調亡細胞標準差對照 60.114.21 35.68 2.08 0.29±3.93 ±0.87 ±3.06±0.03±0.031μM 60.8216.5922.70 2.01 1.05±9.2±5.98 ±3.21±0.01±0.353μM 63.6616.05*20.30 2.00 2.42±7.88 ±2.94 ±4.9 0.00 ±0.46μM 58.0417.87*24.10 2.00 2.77±11.07 ±5.01 ±6.1 0.00 ±1.379μM 53.8417.6*28.56 2.04 4.09±7.84 ±2.4±4 ±0.01±1.3n＝3*P＜0.01表2.
Lewis a Lewis b Lewis y Lewis x Sialyl Lewis x天數 對照 ATRP 對照 ATRP 對照 ATRP 對照 ATRP 對照 ATRP3天0.0560.0579 0.0457 0.0497 0.1093 0.11810.17210.01586* 0.07060.0699±0.0129 ±0.014 ±0.014 ±0.014 ±0.0172 ±0.0121 ±0.0243 ±0.02±0.0217 ±0.0202P value 0.42270.05230.1317 0.0465 0.39172天 0.0650.0477 0.0307 0.0360.0923 0.10770.15 0.138 0.04570.0477±0.0174 ±0.0142 ±0.0023 ±0.0044 ±0.0114 ±0.0084 ±0.0225 ±0.0151 ±0.004 ±0.0025P value 0.16090.14990.1532 0.14997 0.219021天 0.0133 0.0120.0140.0123 0.0380.03230.051 0.051 0.012 0.013±0.0042 ±0.001 ±0.0025 ±0.0004 ±0.0056 ±0.0022 ±0.0078 ±0.0091 ±0.0017 ±0.0025P value 0.31270.128 0.0947 0.4736 0.2114表3.平均 Hep3 B LCA LCASD Control4HPR ATRP黏附弱的細胞 黏附強的細胞LCA 137.72 156.26186.61*160.23171.39±12.7 ±30.65 ±13.95±7.79±18.86AAL 760.34 717.65755.11 356.56227.13±12.17±7.89±41.43±62.52 ±74.51N＝4*P＜0.01表4.
正常 轉移 轉移 Hep3B肝組織 癌組織淋巴結 細胞α-1，6FT 6.35 13.82 26.07 177.4±1.69±3.64±10.03±5.04P值 0.0222*α-1，3FT 11.68 9.62 8.74 47.17±0.93±4.81±0.58 ±4.12P值 0.2175**Compared with normal liver tissues and parent Hep3B cells.n＝4表5.細胞對照 4HPR ATRP HPR+ATRPATRAAverage SDAverageSD Average SD Average SDAverage SDHep3 B 150.51 68.94 139.64 14.18 266.47 11.91 ND223.77 73.66P value0.7496 0.0007 0.3109sub-Hep3 BLCA黏附細胞227.39 64.07 287.58 72.12 359.84 19.54 414.05 65.55 199.65 24.23P value0.3163 0.00340.075 0.4424LCA不黏附細胞 201.09 57.45 255.57 90.03 261.15 13.84 200.03 45.2130.67 11.7P value0.3027 0.00630.9236 0.0062F1黑色素瘤細胞 79.58 13.27 100.27 28.2 125.37 93.48 ND NDP value0.4165 0.5057n＝4ND＝not done表6細胞分組裸鼠轉移的裸鼠 由於腫瘤轉移死亡的裸鼠對照 10 8 0Hep3B 4HPR 88 1ATRP 81*0*P＜0.0權利要求
1.一種化合物N-全反式維甲醯胺衍生物，其特徵是具有通式I的結構 其中R代表脯氨酸，羥基脯氨酸。
2.按權利要求1所述的化合物N-全反式維甲醯胺衍生物，其特徵是所述的衍生物是N-全反式維甲醯胺脯氨酸，具有下述結構式 其計算分子量為398，
3.一種權利要求1的化合物N-全反式維甲醯胺衍生物的製備方法，其特徵是按下述步驟進行1)取全反式維甲酸乾粉與苯酚及三氯化磷作用；2)氮氣下攪拌，分離出生成維甲醯氯的苯溶液，加入L-脯氨酸；3)鹼性溶液調節pH值9-12以上，過夜；4)用乙醚提取後進行層析，質譜分析，取質量正確的部分。
4.按權利要求3的製備方法，其特徵是所述的鹼性溶液是氫氧化鈉溶液。
5.按權利要求3的製備方法，其特徵是所述的氮氣下攪拌時間為2-5小時。
6.按權利要求3的製備方法，其特徵是所述的鹼性溶液調節pH值9以上。
7.化合物N-全反式維甲醯胺衍生物在製備抗腫瘤藥物中的應用。
8.化合物N-全反式維甲醯胺衍生物在製備抗肝癌藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬化學領域，具體涉及化合物N－全反式維甲醯胺衍生物及其製備方法和其抗腫瘤的應用。本發明通過分子模擬結構設計，以全反式維甲酸乾粉為原料與苯酚及三氯化磷作用，經氮氣下攪拌、乙醚提取、層析、質譜分析等合成和純化後製得，本發明衍生物分子具有上述通式結構。本發明化合物經試驗證實其對α1，6巖藻糖糖基轉移酶有明顯的調節作用，比維甲酸毒性低，抑制肝癌細胞作用強，有顯著抑制肝癌細胞在裸鼠體內的轉移潛能的作用，可製備新型抗腫瘤藥物，具有較高的、潛在的社會效益和應用前景。
文檔編號C07D207/00GK1429815SQ0213676
公開日2003年7月16日 申請日期2002年9月2日 優先權日2002年9月2日
發明者吳興中 申請人:復旦大學