一種誘導重樓未成熟合子胚產生體細胞胚的組織培養方法與流程
2023-10-06 20:08:34
本發明涉及中藥組織栽培技術領域，具體來說是一種誘導重樓未成熟合子胚產生體細胞胚的組織培養方法。
背景技術：
重樓為我國雲南、四川地區地道稀缺名貴藥材，是「雲南白藥」、「宮血寧」及「季德勝蛇藥片」等中成藥的主要原料，也可直接入藥用於止血、止痛及治療蛇咬、骨折、腮腺炎、腫瘤和免疫失調等症。因為極高的藥用價值，重樓需求量每年增長近20％。且重樓種子休眠期長、發芽率低，資源再生周期長，同時因為巨大的需求量，重樓野生資源的無節制掠奪式採集現象極其嚴重，這導致了嚴重的重樓資源危機。目前重樓規模化栽培的有效措施尚未獲得實質性進展，重樓每年單株結實量波動巨大，這也嚴重阻礙了重樓規模化栽培。因此大規模的穩定生產重樓種苗以滿足製藥工業化生產迫在眉睫。植物組織培養快繁可以使植株繁殖係數成倍數增加，是解決重樓資源短缺的有效方法。傳統重樓組培多以根莖或芽軸為外植體進行培養，目前已報導的重樓愈傷組織誘導發生率高達43.52％。但是從誘導形成愈傷組織，分化不定芽，誘導生根及最終移栽至土壤成活整個周期歷時580天。同時重樓根莖內生菌較多，組培難度大，目前的組培效果並不顯著，其繁殖係數低。此外隨著繼代次數的增加，重樓愈傷組織不定芽誘導率不斷降低。因此目前尚無可行的規模化重樓種苗繁育技術推廣，探索短期內擴大重樓繁育的組培快繁方法以緩解重樓資源需求壓力勢在必行。
技術實現要素：
本發明的目的是針對上述技術存在的問題，提供一種誘導重樓未成熟合子胚產生體細胞胚的組織培養方法。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案是：一種誘導重樓未成熟合子胚產生體細胞胚的組織培養方法，其特徵在於，步驟包括：
1)取樣及消毒：每年的8-9月，將帶肉質種皮的重樓種子去掉附著的纖維組織後流水清洗後自來水浸泡24小時，在無菌條件下經0.1％濃度HgCl2消毒5min後，無菌水清洗10次；
2)未成熟合子胚剝離：無菌條件下將已消毒的種子剝離掉肉質種皮，體式解剖顯微鏡下用組培鑷子固定住剝去種皮的胚乳，用手術刀片縱切胚乳；
3)體細胞胚誘導：將剝離的未成熟胚接種於pH為5.8的培養基上，20±1℃下持續暗光培養；
4)胚性組織培養體系建立：培養6個月後，誘導成功的體細胞胚生長至紡錘形後未成熟胚剝離並置於新的誘導培養基上繼續培養使其獲得90％誘導成功率的重樓體細胞胚。
進一步的，所述培養基為1/2MS、瓊脂粉濃度為7.5g/L、蔗糖濃度為30g/L。
本發明適用於包括華重樓(Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara)及雲南重樓(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz)的組織培養快繁。
本發明的有益技術效果是：目前報導的重樓組培以根莖或芽軸為外植體，這類外植體內生菌感染概率極大，在加入高濃度的抗生素培養條件下仍有較高的染菌率。本發明採用重樓種子中未成熟合子胚進行誘導，該方法可以避免內生菌感染問題，染菌率極低。目前重樓組培通過誘導根莖或芽軸等外植體產生愈傷組織，愈傷組織經誘導分化產生不定芽，再誘導生根後才能得到可大田栽培的完整植株。本發明誘導的體細胞胚可以直接誘導生成具有根和芽的完整植株，較愈傷組織具有更好的可塑性。通過重樓幼芽等器官誘導的愈傷組織生長緩慢，且藥效成分低於原植物。本發明獲得的體細胞胚生長分化速度遠高於營養器官誘導的愈傷組織，且具有更高的遺傳穩定性，通過體細胞胚誘導生成的重樓植株重樓皂苷組分及含量與原植物相比差異不顯著。本發明為重樓規模化種苗繁育提供了重要的技術支撐。
具體實施方式
下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
實施例1
1)取樣及消毒：所用外植體適取樣時間為8月，重樓果臨近成熟，但果皮尚未開裂時最佳。將重樓整果剪下後剖開，將帶肉質種皮的重樓種子去掉附著的纖維組織後流水清洗後自來水浸泡24小時，在無菌條件下經0.1％濃度HgCl2消毒5分鐘後，無菌水清洗10次；
2)未成熟合子胚剝離：無菌條件下用鑷子將1)中已消毒的種子剝離掉肉質種皮，在體式顯微鏡下利用特細的組培鑷子固定住剝去種皮的胚乳，用手術刀片縱切胚乳。因胚顏色與胚乳顏色一致，但組織密度存在差異，因此調試顯微鏡垂直光照強度，可以發現位於胚乳中的陰影狀未成熟合子胚。利用手術刀片尖端部位沿胚邊緣斜下壓迫擠出完整未成熟胚。
3)體細胞胚誘導：將剝離的未成熟胚接種於培養基上，培養基為1/2MS培養基，瓊脂粉濃度為7.5g/L，蔗糖濃度為30g/L，PH調製5.8，培養基中不添加生長激素。培養溫度(20±1)℃，光照設置為持續暗培養。
4)胚性組織培養體系建立：培養6個月後，約35.01％的未成熟胚會分化生產淡黃色卵圓形胚性組織，該組織即為體細胞胚。卵圓形胚性組織繼續縱向生長形成紡錘型單體組織，將這類組織剝離，置於新的誘導培養基上繼續培養2個月後，超過90％的紡錘形胚性組織會繼續產生淡黃色卵圓形胚性組織。
實施例2
1)取樣及消毒：每年的9月，將帶肉質種皮的重樓種子去掉附著的纖維組織後流水清洗後自來水浸泡24小時，在無菌條件下經0.1％濃度HgCl2消毒5min後，無菌水清洗10次；
2)未成熟合子胚剝離：無菌條件下將已消毒的種子剝離掉肉質種皮，用組培鑷子固定住剝去種皮的胚乳，用手術刀片縱切胚乳；
3)體細胞胚誘導：將剝離的未成熟胚接種於pH為5.8的培養基(培養基為1/2MS、瓊脂粉濃度為7.5g/L、蔗糖濃度為30g/L)上，19℃下持續暗光培養；
4)胚性組織培養體系建立：培養6個月後，培養6個月後，將誘導獲得的體細胞胚剝離置於新的誘導培養基上繼續培養使其90％的紡錘形胚性組織產生淡黃色卵圓形胚性組織。
實施例3
1)取樣及消毒：每年的8月，將帶肉質種皮的重樓種子去掉附著的纖維組織後流水清洗後自來水浸泡24小時，在無菌條件下經0.1％濃度HgCl2消毒5min後，無菌水清洗10次；
2)未成熟合子胚剝離：無菌條件下將已消毒的種子剝離掉肉質種皮，用組培鑷子固定住剝去種皮的胚乳，用手術刀片縱切胚乳；
3)體細胞胚誘導：將剝離的未成熟胚接種於pH為5.8的培養基(培養基為1/2MS、瓊脂粉濃度為7.5g/L、蔗糖濃度為30g/L)上，21℃下持續暗光培養；
4)胚性組織培養體系建立：培養6個月後，將誘導獲得的體細胞胚剝離置於新的誘導培養基上繼續培養使其90％的紡錘形胚性組織產生淡黃色卵圓形胚性組織。
本技術領域技術人員可以理解，除非另外定義，這裡使用的所有術語(包括技術術語和科學術語)具有與本發明所屬領域中的普通技術人員的一般理解相同的意義。還應該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術語應該被理解為具有與現有技術的上下文中的意義一致的意義，並且除非像這裡一樣定義，不會用理想化或過於正式的含義來解釋。
最後所應說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發明的技術方案，儘管參照上述實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應該理解：依然可以對本發明進行修改或者等同替換，而不脫離本發明的精神和範圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。