漢城鏈黴素及其製備方法和應用的製作方法

2023-10-05 05:37:54 2

專利名稱：漢城鏈黴素及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物製藥技術領域，具體涉及從海洋放線菌(Str印tomyces seoulensis)液體發酵物中提取的漢城鏈黴素(str印toseomycin)及其製備方法與應用。
背景技術：
雖然微生物的次生代謝產物已被廣泛研究，但一些特境微生物的代謝產物還是沒 有引起人們足夠重視。海洋環境的特殊性造就了海洋放線菌獨特的代謝方式和代謝產物。 近年來人們不斷從各種海洋環境的放線菌中尋找到能產生具有新型作用機制的抗生素。除 了抗生素以外，海洋放線菌還能夠產生多種酶的抑制劑，海洋放線菌的多樣性為次生代謝 產物提供了一個豐富的來源。隨著抗生素的廣泛使用，致病菌耐藥性急劇增加，原有的抗生素療效已經大幅度 降低，新的疾病不斷出現，這些都給抗生素髮展帶來了巨大的挑戰，發現新菌種以尋找新型 抗生素成為迫切的需要。海洋放線菌可能是篩選抗生素的一條重要途徑。然而，到目前為 止，尚未見從漢城鏈黴菌(Str印tomyces seoulensis)分離抗生素的報導。

發明內容
本發明需要解決的問題是1.提供具有抗菌活性的漢城鏈黴素(str印toseomycin)。2.提供一種提取、分離漢城鏈黴素(str印toseomycin)的方法。3.提供漢城鏈黴素(str印toseomycin)在製備抗生素藥物中的應用。本發明通過下述技術方案予以實現。本發明所述漢城鏈黴素(str印toseomycin)，從海洋放線菌液體發酵提取物中分
離得到，其結構式為 Streptoseomycin單晶結構圖見說明書附圖1。漢城鏈黴素(Str印toseomycin)的製備方法，包括下述步驟1.將新鮮的從對蝦(Penaeus chinensis)腸道中分離、純化得到的漢城鏈黴菌 菌體塊接種到高氏I號培養基(可溶性澱粉20g, KN03lg, NaCl 0. 5g，K2HP04 3H20 0. 5g，MgS04 『 7H20 0. 5g，FeS04 7H20 0. 01g，lL 蒸餾水)中，於搖床上，在 150rpm、28°C條件下培 養5天作為種子液；2.然後將種子液接種於馬丁培養基中，在150rpm、20-3(TC條件下發酵10天；3.將步驟2所得發酵液經紗布過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，真空濃縮乾燥得黑色 粗浸膏F1 ；4.將粗浸膏F1懸浮於水，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液經 濃縮得浸膏F2 ；5.對浸膏F2進行矽膠柱層析，依次用4倍體積的氯仿，氯仿甲醇=100 1，氯 仿甲醇=100 2，氯仿甲醇=100 4，進行洗脫，濃縮100 4(氯仿甲醇)段得 到黑色浸膏F3 ；6.然後對浸膏F3進行S印hadex LH-20分離(洗脫液氯仿甲醇=1 1)合併 綠色螢光部分洗脫液得淡黃色浸膏F4 ；7.對浸膏F4，用反相柱0DS進行分離，先用55%甲醇進行洗脫除去環二肽，然後用 65%甲醇洗脫，合併綠色螢光部分洗脫液得淡黃色固體F5 ；8.對浸膏F5，用高壓液相色譜法(色譜柱Allsphere 0DS-2. 5mm(250R4. 6mm) column ；流動相甲醇/水=60/40 (v/v)流速2. OmL/min)分離得到漢城鏈黴素 streptoseomycin (保留時間 tE = 38. 2min)。本發明的漢城鏈黴素(str印toseomycin)對厭氧菌具有很強的抑制作用，且不具 有細胞毒性，因此漢城鏈黴素(str印toseomycin)可作為一種新穎的抗生素，並在製備抗 生素中得到應用；同時該化合物具有很強的綠色螢光，有望深入研究這類抗生素的作用機 制。與現有技術相比，本發明具有下述突出優點1.本發明的漢城鏈黴素(str印toseomycin)是結構新穎的化合物，可製備成新型 抗生素或先導化合物。克服現有抗生素耐藥性的缺點。2.本發明的漢城鏈黴素(str印toseomycin)可以利用微生物進行液體發酵生產， 工藝簡便，周期短，成本低，來源有保證。


圖1為漢城鏈黴素(str印toseomycin)的單晶結構圖。
具體實施例方式通過下面給出的具體實施例可以進一步了解本發明。但它們不是對本發明的限定。實施例1 海洋來源的漢城鏈黴菌(Str印tomyces seoulensis)的分離與純化在無菌條件下解剖對蝦(Penaeus chinensis)，將取出的對蝦腸道在75%酒精中 表面消毒2分鐘，無菌水漂洗3次，後加少量無菌水在無菌研缽中研磨，用無菌水對研磨液 梯度稀釋成10、10_2，10_3，10_4，分別取各梯度稀釋液0. 2毫升塗布於高氏I號培養基(可溶 性澱粉 20g, KN03lg, NaCl 0. 5g, K2HP04 3H20 0. 5g, MgS04 7H20 0. 5g, FeS04 7H200. Olg, 1L蒸餾水)中，置於28°C恆溫箱中培養，待菌落長出後，挑取孢子純化培養，得到蝦腸道放線菌，經中國科學院微生物研究所鑑定為漢城鏈黴菌(Str印tomyces seoulensis)，現保藏 在中國科學院微生物研究所菌種保藏中心(地址北京市朝陽區北辰西路1號院)，保藏編 號為CGMCC No. 3689，保藏日期為2010年3月25日。實施例2 海洋來源的漢城鏈黴菌(Str印tomyces seoulensis)的液體發酵活化海洋來源的漢城鏈黴菌(Str印tomyces seoulensis)，將新鮮的菌體塊接種 到1 OOOmL錐形瓶中，每瓶含有400mL的高氏培養基，接種5-6瓶於搖床上，在150rpm、28 V 條件下培養5天作為種子液，然後將20mL種子液接種於含有400mL的高氏或馬丁培養基的 IOOOmL錐形瓶中，在150rpm、20-30°C條件下發酵8天。實施例3 漢城鏈黴素(str印toseomycin)的提取與分離實施例2中所得發酵液經紗布過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，真空濃縮乾燥得黑色 粗浸膏Fl。將粗浸膏Fl懸浮於水，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液經濃 縮得浸膏F2，對浸膏F2進行矽膠柱層析，依次用4倍體積的氯仿，氯仿甲醇=100 1， 氯仿甲醇=100 2，氯仿甲醇=100 4，進行洗脫，濃縮100 4 (氯仿甲醇)段 得到黑色浸膏F3，然後對浸膏F3進行Si^phadex LH-20分離(洗脫液氯仿甲醇=1 1) 合併綠色螢光部分洗脫液得淡黃色浸膏F4，對浸膏F4，用反相柱ODS進行分離，先用55% 甲醇進行洗脫除去環二肽，然後用65%甲醇洗脫，合併綠色螢光部分洗脫液得淡黃色固體 F5，對浸膏F5，用高壓液相色譜法(色譜柱Allsphere 0DS-2. 5mm column ；流動相甲醇/ 水=60/40 (ν/ν)，流速-.2. OmL/min)分離得到漢城鏈黴素str印toseomycin (保留時間tK = 38. 2min)。實施例4 漢城鏈黴素(str印toseomycin)的結構鑑定漢城鏈黴素(str印toseomycin)的結構是基於它們的質譜、核磁共振譜、X_ray單 晶衍射分析和Mosher，s法而確定的。光譜學數據如下漢城鏈黴素(str印toseomycin)，無色晶體，在紫外下具有較強的綠色螢光， 熔點(m. p.) 268-270 "C ；[叱。=+91.3。(c = 0.080，MeOH) ；CD(MeOH, c = 6. 6X10_3) λ (Δ ε ) = 361sh (-11. 97) 288 (+1. 63) ,22sh(+2. 30) ,224 (-9. 40mor1dm3cm_1) ；1H 禾口 13C NMR 數據見表 1 ；IR :v(cm_1) = 3462，3426，3245，2896，1769，1724，1695，1641，1594， 1263, 1206, 1176, 1106, 1023,754 ；UV/Vis (MeOH) λ max ( ε ) = 358 (2305)，293 (454)， 207nm(10891moΓ1 Cta3CnT1) ；HR-ESIMS :m/z :calcd forC31H37O11NNa :622. 2261 ；found :622. 2262 [M+Na]+·表1.漢城鏈黴素的NMR數據Table 1. NMR spectral data of streptoseomycin in DMS0_d6 S 單峰，d 雙重峰，t 三重峰，dd 四重峰，m 多重峰，br 寬單峰漢城鏈黴素(str印toseomycin)的Χ-ray單晶衍射分析=C31H37NO11, M599，空間
群P2(l)，晶胞參數a= 12.816(2)，b = 11.607(2)，c=15.681(3)A, α = 90.00°，β =
108. 12(3) ° , γ = 90. 00° ；晶胞體積 V-2105.2(7) A3，晶胞內分子數 Z = 4。Rf 和 Rw 值分 別為0.0696，0. 1102。用MoK α輻射、石墨單色器。用ω掃描方式，獲得獨立衍射點3699 個。在微機上用直接法(SHELXS-97)解析出漢城鏈黴素(str印toseomycin)的單晶結構 (見附圖1)。實施例5 =MIC法測定漢城鏈黴素(str印toseomycin)抗厭氧菌活性1)培養基的製備強化布魯氏瓊脂中加入5% (ν/ν)溶解綿羊血、氯化血紅素5 μ g/ml和1 μ g/ml維 生素K1。2)瓊脂稀釋平板的製備首先配製好不同濃度的試驗用的抗生素溶液及事先配製好試驗用的強化布魯氏瓊 脂。然後製備含不同濃度抗生素的瓊脂平板。具體步驟如下在每塊平板上標記好每一種抗 生素的濃度，然後放置於水平桌面上。將熔化的強化布魯氏瓊脂冷卻至50°C左右，加入不同 濃度的抗生素，同時加入5% (ν/ν)溶解綿羊血，輕輕混勻，注意不要產生氣泡，然後倒入平板 內，使其凝固，可放在無菌層流櫥內並將平板蓋半開著，或35°C孵育30min，使其表面乾燥。
3)接種方法及接種菌量首先在平板上標記好接種菌的位點，使用含量為1 2 μ 1的多點接種器，蘸取菌 液後直接加在瓊脂表面，每點最終接種菌量為105CFU。4)瓊脂稀釋法藥敏試驗首先將不同稀釋度的抗生素加入已熔化並冷卻至50°C左右的瓊脂中，混勻後傾注 平板，待其凝固後，使用接種器將接種標準化的被檢菌株菌懸液分別接種在含不同抗生素 的平板上，在接種後30min內將接種平板放入無氧環境中，越快越好，以免對氧極度敏感的 厭氧菌死亡。孵育48h後，肉眼檢查接種的平板，能抑制細菌生長的最低的抗生素濃度，可 報告為抗生素的MIC。抗厭氧菌活性測試結果(表2)表明漢城鏈黴素(str印toseomycin)可以選 擇性的抑制嗜酸乳桿菌(臨床株)、雙歧桿菌(臨床株)、短真桿菌(臨床株)、丙酸桿菌 (ATCC6919)和丙酸桿菌(ATCC11827)。表2化合物str印toseomycin的抗厭氧菌活性Table 2. the antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria of streptoseomycin *以硫酸慶大黴素(Gentamicin)為陽性對照以上結果提示，漢城鏈黴素(str印toseomycin)具有很強的抗厭氧菌活性且具有 一定的選擇性，因此本發明的漢城鏈黴素可開發成新型抗生素。
權利要求
一種漢城鏈黴菌，其特徵是在PDA平板上，菌落典型特徵為基內菌絲黃色，易產生單個菌落，劃線不連續氣生菌絲灰褐色，孢子白色；在馬丁培養基上，基內菌絲灰褐色，氣生菌絲白色，孢子灰褐色，菌落產生花狀邊緣；在高氏一號平板上，基內菌絲灰褐色，氣生菌絲白色，孢子灰褐色，菌落產生花狀邊緣；在查氏培養基上狀態較特殊，基內菌絲淺黃色，氣生菌絲亮黃綠色，孢子褐色。經中國科學院微生物研究所鑑定為漢城鏈黴菌Streptomyces seoulensis，現保藏在中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院，保藏編號為CGMCC No.3689，保藏日期為2010年3月25日。
2.根據權利要求1所述漢城鏈黴菌發酵液製備的漢城鏈黴素，其特徵是結構式為
3.根據權利要求2所述的漢城鏈黴素str印toseomycin的製備方法，其特徵是由以下 步驟構成1)將新鮮的從對蝦Penaeuschinensis腸道中分離、純化得到的漢城鏈黴菌 Streptomycesseoulensis菌絲體塊接種到高氏I號培養基中，於搖床上,在150rpm、28°C 條件下培養5天作為種子液；高氏I號培養基可溶性澱粉20g，KNO3 lg, NaCl 0. 5g, K2HPO4 · 3Η200· 5g, MgSO4 · 7H20 0. 5g, FeSO4 · 7H20 0. Olg, IL 蒸餾水；2)然後將種子液接種於高氏或馬丁培養基中，在150rpm、20-3(TC條件下發酵8天；3)將步驟2所得發酵液經紗布過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，真空濃縮乾燥得黑色粗浸 膏Fl ；4)將粗浸膏Fl懸浮於水，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液經濃縮 得浸膏F2 ；5)對浸膏F2進行矽膠柱層析，依次用先4倍體積的氯仿，氯仿甲醇=100 1，氯 仿甲醇=100 2，氯仿甲醇=100 4，進行洗脫，濃縮100 4段得到黑色浸膏F3 ；6)然後對浸膏F3進行S^hadexLH-20分離，洗脫液氯仿甲醇體積比1 1，合併綠 色螢光部分洗脫液得淡黃色浸膏F4 ；7)對浸膏F4，用反相柱ODS進行分離，先用55%甲醇進行洗脫除去環二肽，然後用 65%甲醇洗脫，合併綠色螢光部分洗脫液得淡黃色固體F5 ；8)對浸膏F5，用高壓液相色譜法製備得到漢城鏈黴素str印toseomycin。
4.根據權利要求2所述的漢城鏈黴素str印toseomycin在製備抗生素藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬於生物製藥技術領域，具體涉及從海洋放線菌(Streptomyces seoulensis)液體發酵物中提取的漢城鏈黴素(streptoseomycin)及其製備方法與應用。漢城鏈黴素從海洋來源的漢城鏈黴菌分離純化發酵生產獲得。漢城鏈黴素(streptoseomycin)對厭氧菌有很強的抑制作用，且對細胞沒有毒性，因此漢城鏈黴素可作為抗生素生產的先導化合物，並在製備抗生素藥物中得到應用。
文檔編號A61P31/04GK101892181SQ20101018043
公開日2010年11月24日 申請日期2010年5月24日 優先權日2010年5月24日
發明者喬紅運, 劉敏, 吳琦, 宋勇春, 梅亞寧, 譚仁祥 申請人:南京大學