一種Kringle5突變體蛋白及其製備方法和應用的製作方法

2023-10-04 17:03:24 2

專利名稱：一種Kringle5突變體蛋白及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學和醫學領域，涉及一種重組人纖溶酶原Kringle5突變體 蛋白(mKringld蛋白)的序列、以及該蛋白的製備方法和應用。
背景技術：
人類纖維蛋白溶解酶原(human Plasminogen，hPgn)是由胺基酸構成基本相同的 五個Kringle環狀結構域組成，每一個結構域均由約80個胺基酸組成，Kringle5是纖溶酶 原的第五個結構域。1994年，0』 Reilly從荷瘤鼠血清和尿中提取出Angiostatin，可特異 性地抑制血管內皮細胞增生的一種內生性蛋白。研究表明，Kringle5具有抑制內皮細胞增 生的生物學活性，而且其抑制活性強於Angiostatin。Kringle5還具有抑制內皮細胞遷移 的生物學活性。正是由於Kringle5具有高活性、細胞型選擇性、短胺基酸序列等特點，該因 子一直被視為一種潛在的新生血管性疾病的治療藥物。血管形成即形成新血管的過程，它是包括生殖、發育和傷口修復在內的正常機體 活性所必需的。儘管沒有完全了解該過程，但它可能包括調節內皮細胞(毛細血管的初級細 胞)與生長因子的相互作用。在正常條件下，這些分子將微脈管系統保持在靜止狀態(即沒 有任何毛細血管生長)，其保持時間可以持續長達數周，在某些情況下長達數年。必要時(如 在傷口修復、腫瘤生長期間)，這些分子可以在5天內經歷快速增殖和轉換。儘管血管生成 在正常情況下為高度受調節的過程，但持久的非調節血管生成會引起許多疾病(以血管生 成為主要特徵)。臨床研究結果證實，糖尿病等患者眼盲的最常見原因是眼部新生血管的生 成，該病因控制著大約20種眼病的發生。在關節炎的發展中，新生毛細血管侵入關節並破 壞軟骨將使病情惡化。目前，正在開發用於治療血管生成疾病的幾種血管生成抑制劑，但這些化合物有 一些相關的缺點，例如，蘇拉明是一種有效的抑制劑，但在抗腫瘤活性所需的劑量下引起人 嚴重的系統性毒性；Retinoid、幹擾素和抗雌激素之類的化合物對於人類使用是安全的，但 具有弱抗血管生成作用；其他的化合物可能難以製備或製備的成本較高。從血管生成抑制劑研究現狀來看，開發高活性、低毒性(高安全性)的血管生成抑 製劑是目前臨床治療血管增生類疾病所急需的藥物。本發明mKringle5蛋白是通過選擇性地抑制新生血管內皮細胞的增殖，同時對正 常機體細胞無或者低毒性，對病理狀態表現出選擇性毒性，而且該mKringld蛋白抑制血 管新生活性顯著高於Kringle5蛋白，因此研究開發Kringle5突變體蛋白的製備方法和使 用方法，具有很大的意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種重組人纖溶酶原Kringle5突變體蛋白及其製備方法， 本發明的另一個目的是提供該重組人纖溶酶原Kringle5突變體蛋白的應用。本發明所述的重組人纖溶酶原Kringle5突變體蛋白(mKringle5蛋白)，具有如下胺基酸序列N 序列-DCGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPD⑶VGGPWCYT TNPRKLYDYCDVPQCA-C 序列，
其中N序列不存在，或為其他長度不限的胺基酸序列；C序列不存在，或為其他長度不 限的胺基酸序列。本發明所述的mKringle5蛋白的表達載體或克隆載體，該載體含有mKringle5蛋 白的基因序列。所述的mKringld蛋白的表達載體或克隆載體，轉化原核細胞或真核細胞後獲得 的細胞株，該細胞株的含有所述的mKringld蛋白的表達載體或克隆載體。本發明所述重組人纖溶酶原Kringle5突變體蛋白的製備方法，包括以下步驟
(1)表達Kringle5突變體蛋白用接種環從含有Kringle5突變體蛋白表達載體 pBV220/mKringle5的工程菌JM109/ pBV220/mKringle5的LB培養板上挑取單菌落，接種於 含有100mg/L的Amp的5mL LB培養基的試管中，在37°C搖床上，以230r/min振蕩過夜，然 後以1:50的比例將上述菌分別轉入含有50mL LB培養基的250mL三角瓶中，30°C培養4h， 升高培養溫度至42°C，繼續培養4h，即可獲得Kringle5突變體蛋白的表達；
(2)獲取mKringld蛋白表達後的菌體細胞，並採用超聲法破碎細胞將上述獲得的 含Kringle5突變體蛋白表達的細胞培養液在4°C，12000r/minX 20min離心棄上清液，菌 體沉澱以1:10比例重懸於裂解緩衝液中，所述裂解緩衝液為50 mM Tris-Cl，pH 8.0,100 mmol/L NaCl, lmmol/L EDTA,冰浴超聲破菌，250W, 3秒/次，間隔3秒，超聲200次；
(3)分離mKringle5粗蛋白
將上述細胞培養液用微量離心機於4°C，12000r/minX20min離心，將沉澱重懸於9倍 體積的含0. 5% Triton X-100和10 mmol/L EDTA，pH 8. 0的裂解緩衝液中，室溫靜止5min， 然後用微量離心機lOOOOr/minX 20min離心，重複二次，收集沉澱物，將沉澱物中加入5M的 尿素溶液，懸浮、靜止lOmin，然後4°C，10，000r/minX 15min離心，重複1_3次，收集沉澱物， 將沉澱物中加入1-3%的脫氧膽酸鈉溶液，懸浮、靜止10min，4°C，lOOOOr/minX 15min，離 心取沉澱，即得mKringle5粗蛋白；
(4)使用His-Tag柱獲得mKringle5蛋白純品採用組氨酸親和層析法His-Tag柱對 mKringle5蛋白進行純化。依此製備方法可以大量、高效的製備該Kringle5突變體蛋白，由此方法製得的血 管生成抑制劑具有開發高活性、低毒性，其抑制血管新生活性顯著高於Kringle5蛋白。


圖1 :mKringle5蛋白與Kringle5蛋白空間結構的比較；
圖2 表達重組質粒pBV220/mKringle5在JM109表達的聚丙烯醯胺凝膠電泳結果； 圖3 :mKringle5純化後的蛋白SDS-PAGE結果； 圖4 重組質粒pBV220/mKringle5在JM109表達的免疫學鑑定結果； 圖5 :mKringle5蛋白獲得純化後的免疫學鑑定結果；
圖6 採用雞胚絨毛尿囊膜實驗(CAM)測定使用本發明技術製備的mKringld蛋白抑制 血管新生的生物學活性。
具體實施例方式實施例1
Kringle5突變體蛋白編碼基因的獲得(N序列不存在而C序列存在，體外合成+PCR法)。如果C序列為His-His-His-His-His-His，可設計如下基因片段由上海生工公司 合成
SEQ ID NO 1 (76 bp) :GCGAATTCCATGGACTGTACTGGGACGCCATGCCAGGACT GGGCTGCCCAGG AGCCCCATAGACACAGCATTTTCA
SEQ ID NO 2 (78 bp) :CCACCTACATCACCATCAGGGTTACGGCAGTAATTTTTTTC CAGACCCGCCC GTGGATTTGTCTCTGGAGTGAAAATG
SEQ ID NO 3 (73 bp):TGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAAC TTTACGAC TACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCG
SEQ ID NO 4 (49 bp) :GTCCCTCAGTGTGCCCACCACCACCACCACCACTAATAGCGC ACACTGA 上述基因片段中引入了限制性酶切位點和起始密碼子、終止密碼子，將合成的核酸片 斷5'進行磷酸化，常規進行酚、氯仿抽提，進行常規PCR反應操作，反應體系為上述核酸 液各 2mL，4XdNTPs 2mL, IOXBuffer 2ul, Taq 酶 lmL，dH20 7mL，反應條件為65°C變性 5 min，94°C lmin,58°C lmin,72°C lmin，30 個循環，72°C、lmin，PCR 產物進行測序，結果見 SEQ ID NO :5。該序列與Kringle5序列不同，該序列刪除了 Kringle5蛋白的N端Phe458_Glu459、 Met462-Val477和C端Ala541-Pro542 ,並將Asn517突變為Asp獲得的；其空間結構也與Kringle5 不同，見圖1，圖中(A) Kringle5蛋白空間結構模式圖；(B) mKringle5蛋白空間結構模式 圖。實施例2
mKringle5蛋白編碼基因的獲得(N序列和C序列均存在，體外合成+PCR法)。如果N序列為Phe-Glu，如果C序列為His-His-His-His-His-His，則可設計如下 基因片段由上海生工公司合成
SEQ ID NO 6 (82 bp) :GCGAATTCCATGTTTGAAGACTGTACTGGGACGCCATGCC AGGACTGGGCTG CCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCA
SEQ ID NO 6 (78 bp) :CCACCTACATCACCATCAGGGTTACGGCAGTAATTTTTTTC CAGACCCGCCC GTGGATTTGTCTCTGGAGTGAAAATG
SEQ ID NO 8 (73 bp) :TGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAAC TTTACGAC TACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCG
SEQ ID NO 9 (49 bp) :GTCCCTCAGTGTGCCCACCACCACCACCACCACTAATAGCG CACACTGA 上述基因片段中引入了限制性酶切位點、His-tag標籤和起始密碼子、終止密碼子。將 合成的核酸片斷5'進行磷酸化，常規進行酚、氯仿抽提。進行常規PCR反應操作。反應體 係為上述核酸液各 2mL，4 XdNTPs 2mL, IOXBuffer 2ul，Taq 酶 ImL, dH20 7mL。反應條件 為65°C變性 5 min，94°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，30 個循環，72°C、lmin。PCR 產物進 行測序。結果見SEQ ID NO :10ο實施例3獲得mKringld蛋白的基因(簡寫為mKringld基因)後5'端和3'端均進行限制性 內切酶切割，計劃使用的空載體(如PBV220)也進行同樣的酶切操作，然後進行體外連接(即 重組)，即可獲得含有Kringle5突變蛋白的基因序列的載體。下面，詳述pBV220/mKringle5 突變體蛋白重組質粒表達載體的製備。PCR引物設計根據Kringle5突變體蛋白的基因序列，可設計如下引物引物 1 為5 『 -GCGAATTCCATGGACTGTACTGGGACG - 3 『，弓丨物2 為5' -GCGGATCCCTATTAGTGG TGGTGGT GGTGGTGGGCACACTGAGGGAC -3'。其中，GAATTC和GGAT CC為限制性內切酶EcoR I 和BamH I的酶切位點；ATG為起始密碼子；TAATAG為終止密碼子；GTGGTGGTGGT GGTGGTG為 6個組氨酸序列；5 『 GC為保護序列。PCR擴增Kringle5突變體蛋白基因反應體系為Kringle5 DNA模板5mL， 4XdNTPs 2mL，引物 1 lmL，引物 2 ImL, IOXBuffer 2ul, Taq 酶 lmL，dH20 8mL ；反應條件 為95°C 10min，94°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，30 個循環後 72°C、lmin。Kringle5突變體蛋白基因經EcoR I / BamH I雙酶切反應體系酶切底物5ul， IOXBuffer 2mL, BSA 0. 5mL, dH20 11. 5mL, EcoRI lmL。混勻，略離心，置 37°C水浴 2h，無 水乙醇沉澱lh，12000r/min離心5min，棄上清，蒸發殘餘乙醇，再加入10 XBuffer 2mL, BSA 0. 5ul，dH20 11. 5mL, BamHI lmL，混勻，略離心，置 37°C水浴 2h。酶切片段的挖塊回收與純化質粒pBV220用EcoR I / BamH I雙酶切形成開環 PBV220、軟膠回收基因片段。mKringle5基因酶切片段與開環pBV220的連接反應體系為10 X T4連接Buffer 5mL, pBV220開環2mL，mKringle5酶切基因片段lmL, T4DNA連接酶lmL，dH20 6mL,混勻後略 離心，4°C過夜。軟膠回收重組質粒基因片段將回收穫取的重組質粒基因即為含有Kringle5突 變蛋白的基因序列的載體，命名為pBV220/mKringle5。實施例4
製備多種原核細胞株的感受態細胞，以大腸桿菌的一種菌株JM109為例。並將 Kringle5突變體蛋白的表達質粒載體pBV220/mKringle5轉化上述製備的感受態細胞株， 即可獲得體內含有Kringle5突變體蛋白的基因表達或克隆載體的細胞株。將JM109菌株在瓊脂培養基平板上劃線，37°C、230r/min過夜；從平板中取出1個 2-3mm大小的單菌落移至含50ml LB培養液的試管中，37°C、230r/min、3h至A6tltl = 0. 2-0. 4 (對數生長期)；置冰上20min，轉入離心管中，4000r/min離心IOmin ；棄上清，倒置離心管 Imin流盡剩餘液體，然後加入IOml用冰預冷的0. IM CaCl2致敏液懸浮細胞，冰上15min ； 4000r/min離心lOmin，回收細胞，棄上清，倒置Imin ；2ml冰上預冷的0. IM CaCl2懸浮細胞； 按照200mL /Ep分裝；每管加入80%的甘油29mL至終濃度10%，標註，置一 70°C凍存；若 在24h內轉化pBV220/mKringle5可以留出2管置於4°C冰箱中保存。取JM109感受態菌各兩管其中一管加重組質粒(lmg/mL) lmL，另管加空質粒 PBV220 (2mg/mL) ImL作對照。輕輕指彈，使之混勻，在冰浴上放置30min ；42°C水浴靜置 90s ；每管加LB培養基800mL，混勻，37°C水浴放置Ih ；將各管分別取200mL，平鋪於含氨苄 青黴素(60mg/mL)LB瓊脂板表面，平放置20min後，倒置培養12 h以上，待菌落形成後取 出，4°C保存。該瓊脂板表面生長出的菌落即為體內含有Kringle5突變體蛋白的基因表達或克隆載體的細胞株，本例中的細胞株命名為JM109/ pBV220/mKringle5。實施例5
含有mKringle5蛋白的載體(如pBV220/mKringle5)或者體內含有該載體的細胞株 JM109/ pBV220/mKringle5 可用於表達 Kringle5 突變體蛋白。用接種環從含有Kringle5突變體蛋白表達載體pBV220/mKringle5的工程菌 JM109/ pBV220/mKringle5的LB培養板上挑取單菌落,接種於含有Amp (100mg/L)的5mL LB培養基的試管中，在37°C搖床上，以230r/min振蕩過夜；以1:50的比例將上述菌分別 轉入含有50mL LB培養基的250mL三角瓶中，30°C培養4h，升高培養溫度至42°C，繼續培養 4h,即可獲得Kringle5突變體蛋白的表達。 可採用SDS-PAGE進行初步判定是否有外源蛋白的表達。取培養液離心後用STE洗 滌，ImL TE重懸，取 20mL，加等體積 2 X 上樣緩衝液(100 mmol/L Tris-Cl, 200 mmol/L DTT， 4% SDS,0. 2%溴酚蘭，20%甘油，pH6. 8)混勻，沸水浴中煮沸3min，上樣20mL，進行15% SDS-PAGE 電泳(電泳緩衝液25 mmol/L Tris-Cl, 250 mmol/L 甘氨酸，0.1% SDS，pH8. 3)。 電泳條件110V，約6h，加冷水循環。電泳結果見圖2，其中，M泳道為蛋白質分子量標準，1、 6泳道為誘導表達5小時的菌體總蛋白，2、5泳道為誘導表達4小時的菌體總蛋白，3、4泳道 為誘導表達前的菌體總蛋白。實施例6
mKringle5蛋白的製備方法多種，根據不同的設計而定。基因工程技術製備mKringle5 蛋白多從體內含有該載體的細胞株中提取。下面，詳述從JM109/pBV220/mKringle5細胞中 提取mKringle5蛋白的方法。(1)採用實施例6的方法使pBV220/mKringle5在JM109細胞中獲得表達。(2)獲取mKringld蛋白表達後的菌體細胞，並採用超聲法破碎細胞。細胞培養液 在4°C，12000r/minX20min離心棄上清；菌體沉澱以1:10比例重懸於裂解緩衝液(50 mM Tris-Cl pH 8. 0，100 mmol/L NaCl, lmmol/L EDTA)中，冰浴超聲破菌，250W，3 秒 / 次，間隔 3秒，超聲200次。(3)超聲破碎菌體細胞後，從菌體總蛋白中分離mKringld粗蛋白，實施方法如 下
細胞培養液在4°C，12000r/minX20min離心棄上清；菌體沉澱以1:10比例重懸於裂 解緩衝液(50 mmol/L Tris-Cl pH 8. 0，100 mmol/L NaCl, lmmol/L EDTA)中，冰浴超聲破 菌，250W, 3秒/次，間隔3秒，超聲200次。用微量離心機於4°C，12000r/minX 20min離心； 將沉澱重懸於9倍體積含0.5% Triton X-100和10 mmol/L EDTA (pH 8.0)的裂解緩衝 液中，室溫靜止5min ；用微量離心機10000r/minX20min離心；重複二次，製備沉澱用於以 下實驗。沉澱樣品取一支依次加入5M的尿素溶液各1ml，懸浮、靜止IOmin ；4°C，10，000r/ minX 15min離心，重複1_3次。上步沉澱樣品加入的脫氧膽酸鈉溶液各1ml，懸浮、靜 止 IOmin ；4°C，10000r/minX 15min，離心取沉澱、上清製備 SDS-PAGE 樣品。(4)使用His-Tag柱獲得mKringle5蛋白純品，實施方法如下
在實施例1和實施例2中設計了 C-序列，含有6Hi s序列。根據此特徵可以採用組氨酸 親和層析(His-Tag柱)法對mKringle5蛋白進行純化。His-tag colum (280nm監測，液體 流速均為 0. 5ml/min)用 Buffer A (lmol/L 尿素、100mmol/L NaH2PO4、IOmmo 1/L Tris-Cl,
7PH 8.0)平衡至基線平穩後，將包涵體溶解上清直接上樣，蛋白濃度約lmg/ml，上樣體積為 Iml/次；用 Buffer B (lmol/L 尿素、100mmol/L NaH2PO4、IOmmo 1/L Tris-Cl, ρΗ 6· 3)洗 脫非特異結合蛋白，直至基線再次平穩；用Buffer C (lmol/L尿素、lOOmmol/L NaH2PO4, 10mmol/L Tris-Cl, ρΗ 5. 9)洗脫結合在Ni2+上的mKringle5蛋白，分部收集洗脫峰；用 Buffer D (Buffer C、250mmol/L咪唑)繼續洗脫，分部收集洗脫峰；用Buffer E (lmol/L 尿素、100mmol/L NaH2PO4UOmmo 1/L Tris-Cl.pH 4. 5)繼續洗脫，直至無基線平穩。純化後 獲得的純品mKringle5蛋白的SDS-PAGE結果見圖3，圖中1_5為純化過程中各階段收集的 樣品，6為洗脫液洗脫後獲得的mKringld純品，可見已經達到電泳純。實施例7
mKringle5蛋白是否獲得表達或者純化的蛋白是否為mKringle5蛋白，可採用免疫 學Western blot鑑定。在實施例1和2的基因設計中引入了 C-序列，其為6His，可使用 His-tag單克隆抗體進行鑑定。安裝轉膜裝置(轉移緩衝液25 mmol/L Tris, 192 mmol/L甘氨酸，20 %甲醇)， 將SDS-PAGE表達聚丙烯醯胺膠進行轉移到硝酸纖維素膜，轉膜條件9mA，l_2h ；去離子水 洗膜2次，每次IOmin ；將硝酸纖維素膜放在平皿中，加封閉液(10 mmol/L Tris-Cl, 100 mmol/L NaCl, ρΗ8. 0，5%脫脂奶粉)浸膜，室溫搖蕩2h ；與第一抗體結合多克隆第一抗體 (His-Tag Monoclonal Antibody，購於美國Novagen公司)按1 :1000的比例稀釋，按每平 方釐米加0. ImL比例加入一抗液體，室溫搖蕩2h ；洗滌用TBST (10 mmol/L Tris-Cl, 100 mmol/L NaCl，pH8. 0,0. 1% Tween-20)洗3次，每次IOmin ；與第二抗體結合將膜轉入第二 抗體(山羊抗小鼠Ig-G-Ap，購於寶生物工程(大連)有限公司)溶液(1:200倍比稀釋第二抗 體於封閉液)中，4°C搖蕩5h，取出後，用TBST洗3次，每次IOmin ；鹼性磷酸酶顯色取0. 5g NBT (氮藍四唑nitroblue terazolium)溶於IOml 70%的二甲基甲醯胺中，取0. 5g BCIP C5' -bromo-4-chloro- 3-indoxyl phosphate)溶於 10ml 70%的二甲基甲醯胺中，於 10ml 鹼性磷酸酶緩衝液(IOOmM NaCl、5mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris · Cl)中加入 BCIP 4mL、 NBT 4mL，待條帶達所需深度時，立刻用水洗膜。結果見圖4和圖5，圖4中1、3泳道為誘導 表達前菌體總蛋白與His-Tag抗體反應的結果，2泳道為誘導表達後菌體總蛋白與His-Tag 抗體反應的結果，圖5中1泳道即為mKringle5蛋白純品。實施例8
採用雞胚絨毛尿囊膜法(CAM)檢測mKringld蛋白抑制血管新生的生物學活性。參照姜志剛、鄂徵(姜志剛，鄂徵，解剖學雜誌，1989，12 :142_143)的方法以0. 5% 甲基纖維素膜製備，實驗組分為粗樣品組、mKringle5蛋白純品未復性組、mKringle5蛋白 純品復性組，設PBS組和包涵體溶解、稀釋液組為陰性對照組。雞胚孵育用0. 的新潔 而滅將新鮮雞胚清洗後，將雞蛋放入38-40°C、60%相對溼度的孵箱內常規孵育，氣室朝上， 雞蛋長軸與蛋託呈80度角。每天翻蛋2-3次。至第7天，選擇成活的雞胚，在尿囊膜兩條 主要的血管交叉點而又離胚體有一定距離處確定開窗位置。開窗先在氣室頂端開一個小 孔減壓，然後在確定的位置消毒後開一約0. 5X0. 5cm的小窗，小心掀起殼膜，暴露其下方 的尿囊膜及其血管。施加測試物將已製備的甲基纖維素膜置於測試區，用透明膠帶封閉小 窗。繼續孵育至10天。每個劑量組至少保證成活8隻雞胚。取膜及拍照加測試膜後第3 天，去掉CAM平面以上的卵殼膜，加入1 1的甲醇/丙酮固定液1. 5ml/只，室溫固定15min後，待血液凝固剪下尿囊膜，放入水中展開。將尿囊膜鋪在玻璃板上，上面再用另一玻璃板 壓平，在解剖顯微鏡下觀察並拍照。結果觀察用解剖顯微鏡觀察、計數與載體盤邊緣接觸 的總、大、中、小血管數目，根據管徑將血管分為三類(王蕾，張樹成，吳志奎，等，中國藥理與 臨床，2000，16 (6):46-47):① >0. Imm 為大血管；0. lmm> ① >0. 05mm 為中血管；① <0. 05mm 為小血管。從主幹分枝出的血管稱為一級血管，自一級再分枝為二級血管，依次類推為三 級、四級……，記錄血管分級狀況。以被檢物膜為中心，周圍血管放射狀朝向被檢物的生長 狀態稱為血管輻輳；主幹血管向載物膜的彎曲和靠近稱之為血管的吸引。觀察載物膜周圍 Icm範圍內與遠離(大於1cm)位置的血管密度，計數出現血管增生或抑制的雞胚數目，數據 進行方差分析，結果見表1和表2、圖6，圖6中A為PBS組，B為包涵體溶解、稀釋液組，C為 Kringle5蛋白組，D為mKringle5蛋白組。可見，mKringle5蛋白能有效阻斷其作用範圍的 CAM血管的新生。 表1 :mKringle5蛋白抑制CAM—級、二級血管形成
權利要求
1.一種Kringle5突變體蛋白，其特徵是具有如下胺基酸序列N序列-DCGTPCQDWAAQE PHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYT TNPRKLYDYCDVPQCA-C 序列，其中N序列不存在，或為其他長度不限的胺基酸序列；C序列不存在，或為其他長度不 限的胺基酸序列。
2.權利要求1所述的Kringle5突變體蛋白的製備方法，其特徵是包括以下步驟(1)表達Kringle5突變體蛋白用接種環從含有Kringle5突變體蛋白表達載體 pBV220/mKringle5的工程菌JM109/ pBV220/mKringle5的LB培養板上挑取單菌落，接種於 含有100mg/L的Amp的5mL LB培養基的試管中，在37°C搖床上，以230r/min振蕩過夜，然 後以1:50的比例將上述菌分別轉入含有50mL LB培養基的250mL三角瓶中，30°C培養4h， 升高培養溫度至42°C，繼續培養4h，即可獲得Kringle5突變體蛋白的表達；(2)獲取mKringld蛋白表達後的菌體細胞，並採用超聲法破碎細胞將上述獲得的 含Kringle5突變體蛋白表達的細胞培養液在4°C，12000r/minX 20min離心棄上清液，菌 體沉澱以1:10比例重懸於裂解緩衝液中，所述裂解緩衝液為50 mM Tris-Cl，pH 8.0,100 mmol/L NaCl，lmmol/L EDTA,冰浴超聲破菌，250W, 3秒/次，間隔3秒，超聲200次；(3)分離mKringle5粗蛋白將上述細胞培養液用微量離心機於4°C，12000r/minX20min離心，將沉澱重懸於9倍 體積的含0. 5% Triton X-100和10 mmol/L EDTA，pH 8. 0的裂解緩衝液中，室溫靜止5min， 然後用微量離心機lOOOOr/minX 20min離心，重複二次，收集沉澱物，將沉澱物中加入5M的 尿素溶液，懸浮、靜止lOmin，然後4°C，10，000r/minX 15min離心，重複1_3次，收集沉澱物， 將沉澱物中加入1-3%的脫氧膽酸鈉溶液，懸浮、靜止10min，4°C，lOOOOr/minX 15min，離 心取沉澱，即得mKringle5粗蛋白；(4)使用His-Tag柱獲得mKringle5蛋白純品採用組氨酸親和層析法His-Tag柱對 mKringle5蛋白進行純化。
3.權利要求1所述的一種Kringle5突變體蛋白的表達載體或克隆載體，其特徵是含有 mKringle5蛋白的基因序列。
4.權利要求3所述的一種Kringle5突變體蛋白的表達載體或克隆載體轉化原核細胞 或真核細胞後獲得的細胞株，其特徵是含有權利要求2所述的表達載體或克隆載體。
5.權利要求1所述的一種Kringle5突變體蛋白在製備抑制血管新生類藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種Kringle5突變體蛋白(mKringle5蛋白)，其特徵在於具有如下胺基酸序列N序列-DCGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPKLYDYCDVPQCA-C序列，其中N序列——不存在，或為其他長度不限的胺基酸序列；C序列——不存在，或為其他長度不限的胺基酸序列。本發明也涉及mKringle5蛋白的表達載體和克隆載體、mKringle5蛋白相關載體轉化原核細胞或真核細胞後獲得的細胞株、mKringle5蛋白的製備方法和使用。依此製備方法可以大量、高效的製備該Kringle5突變體蛋白，由此方法製得的血管生成抑制劑具有開發高活性、低毒性，其抑制血管新生活性顯著高於Kringle5蛋白。
文檔編號C12P21/02GK102093993SQ20101059129
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月16日 優先權日2010年12月16日
發明者牛勃, 王軍, 解軍, 趙榮瑞, 陳顯久 申請人:山西醫科大學