一種青稞β‑葡聚糖的製備工藝及其結構序列的製作方法
2023-10-10 04:21:09
本發明屬於生物醫藥領域，具體涉及一種青稞β-葡聚糖的製備工藝及其結構序列。
背景技術：
青稞，大麥屬，是青藏高原地區人民的主食之一，也是家畜飼料和工業原料作物。據監測，青稞中β-葡聚糖的含量是所有穀物中含量最高的農作物。穀物中的β-葡聚糖是由吡喃型葡萄糖通過β-(1→3)或者β-(1→4)糖苷鍵連接而成的線型多糖。近年來，青稞β-葡聚糖在食品科學領域受到很大關注，β-葡聚糖的許多重要的生理學功能和生理活性逐漸被人認知，據報導，青稞β-葡聚糖可以作為固有免疫和獲得性免疫的調節劑，具有良好的降血糖降血脂功能，並在抗氧化、抗腫瘤等方面也顯示出良好的應用前景。由於行業中對青稞β-葡聚糖的結構、活性研究較為有限，因而其在行業中的應用也較為低端，多數將青稞打粉後製作麵食、麵餅等普通食品，未能充分發揮其降糖降血脂等作用。雖然目前已經發現β-葡聚糖具有顯著的降血脂和降血糖作用，但由於其序列結構複雜，絕大多數降血脂降血糖活性片段及其作用機理未能明確，阻礙了它們被開發成防治高血脂和糖尿病新藥的進程。
目前，也有一些關於穀物中β-葡聚糖的製備方法的專利或者文獻的公開，但是大多數方法一般是僅對其中β-葡聚糖進行粗提，得到樣品純度較低，色澤較差或者製備過程需藉助色譜，如離子交換（deae等）或者分子篩（sephadex-g200等）對樣品進行純化，過程較為複雜，不適宜大批量製備進而工業化。
技術實現要素：
本發明目的是提供一種青稞β-葡聚糖的製備工藝和青稞β-葡聚糖的結構序列，解決難以提取純度較高的青稞β-葡聚糖、青稞β-葡聚糖序列複雜、其藥用性能不明確等的問題。
本發明的技術方案是：
提供一種青稞β-葡聚糖的製備工藝，該方法包括如下步驟：
（1）青稞粉碎：將青稞磨成粉後，過40-80目篩，製得青稞粉；
（2）滅酶：在所述青稞粉中加入高濃度乙醇，加熱回流；
(3)提取並除澱粉：在經步驟(2)加工後所得的青稞粉中加入水，調整ph值至7-11，然後加入高溫澱粉酶，混合均勻後於85-90℃條件下攪拌回流1-10h；
（4）除蛋白：調整步驟(3)所得的溶液的ph值至2-4.5，靜置後蛋白沉澱析出，離心去除沉澱，製得提取液；
（5）製備粗多糖：對所述提取液濃縮1-5倍後加入硫酸銨，靜置後粗多糖沉澱析出，離心後收集沉澱，得青稞β-葡聚糖粗品；
（6）除小分子：將所述青稞β-葡聚糖粗品加水復溶，然後去除小分子雜質，製得青稞β-葡聚糖溶液；
（7）乾燥：將所述青稞β-葡聚糖溶液進行乾燥，得到精製的青稞β-葡聚糖。
進一步的，步驟(2)中所述料液比為1g:1ml-1g:20ml，所述乙醇的濃度>80%，所述加熱回流時間為1-5小時。
進一步的，步驟(3)中所述青稞粉與水的料水比為1g:5ml-1g:50ml，所述ph值採用20%的na2co3調整，所述高溫澱粉酶與所述青稞粉的比為10u：1g至1000u：1g。
進一步的，步驟(5)中所述硫酸銨與濃縮後的提取液的料液比為1g:2ml-1g:8ml。
進一步的，步驟(6)中所述去除小分子雜質採用超濾膜過濾的方式，所述超濾膜為有機或者無機膜，所述超濾膜截留分子量為1000–5000da。
進一步的，步驟(7)中所述乾燥的方式為噴霧、帶式、烘箱或冷凍中的任意一種。
本發明的另一技術方案是：
提供一種上述工藝所製備的青稞β-葡聚糖，所述青稞β-葡聚糖的結構中含有重複單元glc1→3glc1→4glc/glc1→3glc1→4glc1→4glc。
進一步的，所述青稞β-葡聚糖的結構中具有β-(1→3)和β-(1→4)兩種連接方式的直鏈葡聚糖。
進一步的，所述青稞β-葡聚糖的結構中dp3n、dp3n+1和dp3n+2組成一個周期循環，其中，所述dp3n具有兩種序列連接，分別為[glc1→4glc1→4glc]n和[glc1→3glc1→4glc]n；所述dp3n+1是每一個周期中豐度最高的寡糖，其表述為[glc1→3glc1→4glc]n→4glc；所述dp3n+2是每一個周期中含量較少的寡糖，其為均一的β-(1→4)連接葡萄糖片段。
進一步的，所述青稞β-葡聚糖中β-(1→3)與β-(1→4)糖苷鍵的比值為1:2至1:5。
本發明所述青稞β-葡聚糖的具體優點如下：
（1）該青稞β-葡聚糖的製備工藝簡單，適合大規模生產；
（2）利用本發明所述的工藝製備的青稞β-葡聚糖純度高；
（3）該青稞β-葡聚糖結構明確；
（4）該青稞β-葡聚糖具有良好的降血糖降血脂功能。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其它的附圖。其中，
圖1為本發明中所述的一種青稞β-葡聚糖的製備工藝所製備的青稞β-葡聚糖的核磁共振譜圖；
圖2為本發明中β-葡聚糖單糖組成以及各標準品對比圖；
圖3為本發明中β-葡聚糖部分酶解產物中寡糖的分離分析圖；
圖4是本發明中6h、12h以及24h酶解產物中寡糖pad色譜圖及其對應的提取離子流色譜圖(eic)；
圖5是本發明中dp2-dp4的二級質譜圖；
圖6是本發明中dp5-dp7的二級質譜圖；
表1是本發明中青稞β-葡聚糖的13cnmr峰位歸屬；
表2是本發明中青稞β-葡聚糖對高脂血症小鼠血漿中血脂的影響(n=10)；
表3是本發明中青稞β-葡聚糖對高脂血症小鼠肝脂以及肝重係數的影響(n=10)；
表4是本發明中青稞β-葡聚糖對高脂血症小鼠肝組織mda含量，sod和gsh-px活性的影響(n=10)；
表5是本發明中青稞β-葡聚糖對高血糖小鼠空腹血糖的影響(n=10)；
表6是本發明中青稞β-葡聚糖對高血糖小鼠口服葡萄糖耐量的影響(n=10)；
表7是本發明中青稞β-葡聚糖對高血糖小鼠糖原的影響(n=10)。
具體實施方式
本發明提供一種青稞β-葡聚糖的製備工藝，包括以下步驟：
（1）青稞粉碎：將青稞磨成粉後，過40-80目篩，製得青稞粉；
（2）滅酶：在所述青稞粉中加入高濃度乙醇，加熱回流；
(3)提取並除澱粉：在經步驟(2)加工後所得的青稞粉中加入水，調整ph值至7-11，然後加入高溫澱粉酶，混合均勻後於85-90℃條件下攪拌回流1-10h；
（4）除蛋白：調整步驟(3)所得的溶液的ph值至2-4.5，靜置後蛋白沉澱析出，離心去除沉澱，製得提取液；
（5）製備粗多糖：對所述提取液濃縮1-5倍後加入硫酸銨，靜置後粗多糖沉澱析出，離心後收集沉澱，得青稞β-葡聚糖粗品；
（6）除小分子：將所述青稞β-葡聚糖粗品加水復溶，然後去除小分子雜質，製得青稞β-葡聚糖溶液；
（7）乾燥：將所述青稞β-葡聚糖溶液進行乾燥，得到精製的青稞β-葡聚糖。
為使本發明的上述目的、特徵和優點能夠更加明顯易懂，下面結合具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。
一種青稞β-葡聚糖的製備工藝，包括：
步驟一：將青稞磨成粉後，過40-80目篩，製得青稞粉；
步驟二：在所述青稞粉中加入高濃度乙醇，加熱回流；
在一個實施例中，該步驟可以具體如下執行：將青稞粉中加入高濃度乙醇，加熱回流。料液比為1:1-1:20(g:ml)；乙醇濃度>80%；回流時間1-5小時。該過程的目的在於除去脂溶性物質、色素，並且抑制內源性β-葡聚糖酶或生物酶在提取過程中降解目標產物。
步驟三：在青稞粉中加入水，調整ph值至7-11，然後加入高溫澱粉酶，混合均勻後於85-90℃條件下攪拌回流1-10h；
在一個實施例中，該步驟可以具體如下執行：按照1:5到1:50的料水比在處理後的青稞粉中加水，採用20%na2co3調整ph到7-11，並按照活力單位(u)與乙醇處理後青稞粉質量(g)比為10：1至1000：1加入高溫澱粉酶，混合均勻後於85-90℃條件下攪拌回流1-10h。
步驟四：調整所得的溶液的ph值至2-4.5，靜置後蛋白沉澱析出，離心去除沉澱，製得提取液；
在一個實施例中，該步驟可以具體如下執行：調整溶液ph至2-4.5，靜置後蛋白(澱粉酶以及青稞中固有蛋白)沉澱析出，離心去除沉澱。
步驟五：對所述提取液濃縮1-5倍後加入硫酸銨，靜置後粗多糖沉澱析出，離心後收集沉澱，得青稞β-葡聚糖粗品；
在一個實施例中，該步驟可以具體如下執行：對提取液濃縮1-5倍後加入硫酸銨，硫酸銨質量(g)與濃縮後的提取液(ml)料液比為1:2-1:8，靜置後粗多糖沉澱析出，離心後收集沉澱。該步驟是根據不同多糖在不同鹽溶液中溶解度不同，使β-葡聚糖在硫酸銨溶液中沉澱，而提取液中的阿拉伯木聚糖會在加入硫酸銨條件下不會析出，達到純化β-葡聚糖的目的。
步驟六：將所述青稞β-葡聚糖粗品加水復溶，然後去除小分子雜質，製得青稞β-葡聚糖溶液；
在一個實施例中，該步驟可以具體如下執行：將β-葡聚糖粗品加水復溶後，採用超濾膜過濾的方式取去除小分子雜質。這個過程中選用截留分子量為1000–5000da的有機或者無機膜。
步驟七：將所述青稞β-葡聚糖溶液進行乾燥，得到精製的青稞β-葡聚糖。
在一個實施例中，該步驟可以具體如下執行：將經過膜處理的溶液，以噴霧或帶式或烘箱或冷凍等方式進行乾燥，得到精製β-葡聚糖產品。
上述工藝所製得的具有降血糖降血脂功能的青稞β-葡聚糖的結構特徵為含有重複單元glc1→3glc1→4glc/glc1→3glc1→4glc1→4glc，且他們之間存在多個結構序列均一但不同長度的β-(1→4)連接的葡萄糖片段。根據核磁共振結果，在上述條件下提取製備的樣品為具有β-(1→3)和β-(1→4)兩種連接方式的直鏈葡聚糖。根據hpaec-pad-ms/ms分析結果，組成該β-葡聚糖的片段存在一定重複規律，即不同聚合度的寡糖之間存在一定規律，dp3n，dp3n+1，dp3n+2，可組成一個周期循環，其中，dp3n具有兩種序列連接，它們是分別為[glc1→4glc1→4glc]n和[glc1→3glc1→4glc]n；dp3n+1是每一個周期中豐度最高的寡糖，它可以表述為[glc1→3glc1→4glc]n→4glc；dp3n+2含量較少，它為均一的β-(1→4)連接的葡萄糖片段。此外，製備所得葡聚糖中β-(1→3)與β-(1→4)糖苷鍵的比值確定為1:2至1:5。該青稞β-葡聚糖有較好的防治高血脂和糖尿病活性，並有潛在成藥性。
取上述工藝所得β-葡聚糖進行體內降血脂和降血糖試驗，具體實驗條件以及實驗結果如下：
1）降血脂實驗：通過預防給藥的方式，進行判定，採取上午灌胃給藥(根據體重200mg/kg)，下午灌食高脂乳劑(乳劑由15%豬油和1.5%膽固醇等輔料製備而成)，在連續灌胃21天以後，發現該β-葡聚糖相對與模型組可以顯著降低實驗組小鼠的總膽固醇(tc)(*p<0.05)，低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)(*p<0.05)，以及改善小鼠體內游離脂肪酸(ffa)(*p<0.05)的含量，具體機理可能是β-葡聚糖可以抑制肝腸循環過程中膽汁酸的重新收，從而促進肝臟中ldl-c轉化為膽酸，從而達到降血脂的目的。
2）降血糖實驗：向建模組小鼠根據體重110mg/kg注射鏈脲佐菌素，特異性損傷小鼠胰腺，建立i型糖尿病模型，對實驗組小鼠體重採取灌胃給藥(200mg/kg)的方式給予β-葡聚糖。在連續灌胃給藥10天之後，β-葡聚糖與模型組對比可以顯著降低糖尿病小鼠的空腹血糖(*p<0.05)，改善小鼠口服葡萄糖耐量(*p<0.05)，促進肝糖原的合成(*p<0.05)以及肌糖原的合成(*p95%)。如圖2所示。
（3）序列結構分析
為了研究青稞β-葡聚糖的序列結構特徵，將β-葡聚糖溶於10mmpbs緩衝溶液中，樣品濃度3mg/ml，加入1uβ-葡聚糖酶，置於37℃恆溫水浴培養箱；分別於6h，12h，24h採集樣品；採集後溶液煮沸，使酶失活，並離心(15000r/min，10min)去除變性蛋白。採用離子色譜同時串聯pad和q-tof質譜儀的方式，對不同時間酶解產物進行分離分析。分析柱為carbopacpa-200column(3×250mm，dionex，sunnyvale，ca)，流動相a為100mmnaoh，流動相b為1mnaoac以及100mmnaoh溶液，以0.8ml/min流速進行梯度洗脫，其中，b相在0-35min內由0%洗脫至35%。
β-葡聚糖部分酶解產物中寡糖的分離分析流程具體見圖3，由於流動相中存在高濃度的非揮發性鹽，不可直接進入質譜，因此需經具有在線脫鹽功能的陽離子交換柱處理；圖4，分別為6h、12h以及24h酶解產物的pad色譜圖與其對應的提取離子流色譜圖(eic)，如圖所示，eic與pad譜圖結果可互相對應，在脫鹽過程中，可導致樣品的擴散，因而，eic中峰型比pad譜圖中峰型寬。其次，對圖中各峰進行歸屬，根據圖中6h酶解產物的分析結果可發現，不同聚合度的寡糖分布存在一定規律，dp3n，dp3n+1，dp3n+2，可組成一個周期循環，其中，dp3n具有兩種序列連接，dp3n+1是每一個周期中豐度最高的寡糖，dp3n+2含量較少。
對聚合度為dp2-7的寡糖分別進行二級質譜分析，結果如圖5(a、b、c、d)及圖6(a、b、c、d)。圖5a為二糖二級質譜結果，b1(m/z161)/c1(m/z179)是典型的糖苷鍵斷裂，據報導，2,4a2(m/z221)/2,5a2(m/z263)是1,4糖苷鍵連接二糖的特殊離子峰，因此該二糖的連接方式可以確認為glc1→4glc。圖5b和5c分別為dp3(a)以及dp3(b)的二級質譜結果。在dp3(a)的二級質譜圖中，除了典型的b和c糖苷鍵斷裂以外，還有2,5a2(m/z263)和2,5a3(m/z425)斷裂方式的存在，因此，可以確定dp3(a)的兩個糖苷鍵連接方式均為1，4連接。根據dp3(b)二級質譜圖可知，在二級質譜轟擊過程中，第二個糖環上未發生任何跨環斷裂，而這一特徵可證明1→3糖苷鍵的存在，第三個糖環上出現了2,4a3(m/z383)/2,5a3(m/z425)/0,2a3(m/z443)的斷裂方式，證明了1→4糖苷鍵的存在。因此，dp3(a)和dp3(b)的序列結構可分別確認為glc1→4glc1→4glc以及glc1→3glc1→4glc。圖5d為dp4二級質譜結果，由於2,5a3(m/z425)和2,5a4(m/z587)的存在，可確認，從非還原端處開始的第二個和第三個糖苷鍵均為1,4糖苷鍵;由於該譜圖中未找到第二個糖環上的任何跨環斷裂的碎片離子峰，因而該四糖中第一個糖苷鍵可確定為1,3糖苷鍵。dp4的序列結構確認為glc1→3glc1→4glc1→4glc。同理可得，圖6(a、b、c、d)中dp5，dp6(a)，dp6(b)，dp7的序列結構可分別確定為：
glc1→4glc1→4glc1→4glc1→4glc，
glc1→4glc1→4glc1→4glc1→4glc1→4glc，
glc1→3glc1→4glc1→4glc1→3glc1→4glc，
glc1→3glc1→4glc1→4glc1→3glc1→4glc1→4glc。
綜上所述，實施例1中製備所得的青稞β-葡聚糖具有如下結構特徵：存在重複單元glc1→3glc1→4glc/glc1→3glc1→4glc1→4glc，且存在多個β-(1→4)連接的片段。根據核磁共振結果，在上述條件下提取製備的樣品為具有β-(1→3)和β-(1→4)兩種連接方式的直鏈葡聚糖。根據hpaec-pad-ms/ms分析結果，組成該β-葡聚糖的片段存在一定重複規律，即，dp3n，dp3n+1，dp3n+2，可組成一個周期循環，其中，dp3n存在兩種序列連接，它們是分別為[glc1→4glc1→4glc]n和[glc1→3glc1→4glc]n；dp3n+1是每一個周期中豐度最高的寡糖，它可以表述為[glc1→3glc1→4glc]n→4glc；dp3n+2含量較少，它為均一的β-(1→4)連接的葡萄糖片段。此外，製備所得葡聚糖中β-(1→3)與β-(1→4)糖苷鍵的比值確定為1:3。
2、青稞β-葡聚糖的降血脂功能評價
對實施例1中製備所得青稞β-葡聚糖進行降血脂體內活性評價。
選取40隻雄性昆明小鼠，體重18-22g，通過預防給藥的方式，進行判定，採取上午灌胃給藥(根據體重200mg/kg)，下午灌食高脂乳劑(乳劑由15%豬油和1.5%膽固醇等輔料製備而成)的方式，連續灌胃21天，最後，眼球取血後處死。提取小鼠肝臟組織，稱重，按照不同試劑盒要求測定這40隻小鼠體內總膽固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白膽固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)、小鼠肝臟中總膽固醇、甘油三酯和肝重係數指標以及游離脂肪酸(ffa)的結果以及肝臟內多種酶活性進行評價。試驗中分為空白組、模型組、實驗組和陽性藥對照組，其中陽性藥為辛伐他汀(20mg/kg)。具體結果見表2、表3、表4。
表2青稞β-葡聚糖對高脂血症小鼠血脂的影響(n=10)
注:與正常組比較，##p˂0.01，#p˂0.05；與模型組比較**p˂0.01，*p˂0.05。
表3青稞β-葡聚糖對高脂血症小鼠肝脂以及肝重係數的影響(n=10)
注:與正常組比較，##p˂0.01，#p˂0.05；與模型組比較**p˂0.01，*p˂0.05。
表4青稞β-葡聚糖對高脂血症小鼠肝組織mda含量，sod和gsh-px活性的影響(n=10)
注:與正常組比較，##p˂0.01，#p˂0.05；與模型組比較**p˂0.01，*p˂0.05。
表2、表3、表4中，與正常組小鼠對比，模型組小鼠體內多項參數存在顯著差異，具有統計學意義(##p˂0.01或#p˂0.05)，說明模型建立成功。表2中，實驗組小鼠與模型組對比，血清中tc、ldl-c以及hdl-c等指標均有顯著改善，且存在顯著差異，存在統計學意義(**p˂0.01或*p˂0.05)，表3和表4中，實驗組小鼠與模型組相比，實驗組小鼠肝臟係數具有顯著改善(**p˂0.01)，且肝臟內sod以及gsh-px活性增加，機體抗氧化能力增強。
高血脂小鼠體內實驗結果表明，青稞β-葡聚糖可以有效降低血清中tc、ldl-c和ffa的濃度,並且可以適當增加小鼠血清中hdl-c,此外，青稞β-葡聚糖可以有效地增加實驗組小鼠體內抗氧化酶活性，因而可確定，採用該工藝生產的青稞β-葡聚糖具有良好的降血脂作用以及抗氧化作用。
3、青稞β-葡聚糖的降血糖活性評價
對實施例1中製備所得青稞β-葡聚糖進行降血糖體內活性評價試驗。
選用雄性昆明小鼠，體重18-22g，適應性培養後隨機分為兩組，空白組和建模組，向建模組小鼠根據體重110mg/kg注射鏈脲佐菌素，特異性損傷小鼠胰腺，建立i型糖尿病模型，並將建模成功的小鼠隨機分為三組：模型組、陽性對照組以及實驗組。對實驗組小鼠體重採取灌胃給藥(200mg/kg)的方式給予β-葡聚糖，分別於0day、10day、20day、30day取血，測量空腹血糖濃度，並於培養第30天後，禁食，分別取0h、0.5h、2h測定口服葡萄糖耐受量，並於眼球取血後處死，提取小鼠肝臟組織和肌肉組織，稱重，按照不同試劑盒要求測定這40隻小鼠空腹血糖濃度、肝糖原、肌糖原、口服葡萄糖耐受量(ogtt)進行測量。試驗中共設置4組，分別為空白組、模型組、實驗組和陽性藥對照組，其中,陽性藥為二甲雙胍(20mg/kg)。具體結果見表5、表6、表7。
表5青稞β-葡聚糖對高血糖小鼠空腹血糖的影響(n=10)
注:與正常組比較，##p˂0.01，#p˂0.05；與模型組比較**p˂0.01，*p˂0.05。
表6青稞β-葡聚糖對高血糖小鼠口服葡萄糖耐量的影響(n=10)
注:與正常組比較，##p˂0.01，#p˂0.05；與模型組比較**p˂0.01，*p˂0.05。
表7青稞β-葡聚糖對高血糖小鼠糖原的影響(n=10)
注:與正常組比較，##p˂0.01，#p˂0.05;與模型組比較**p˂0.01，*p˂0.05.
表5、表6、表7中，與正常組小鼠對比，模型組小鼠體內多項參數存在顯著差異，具有統計學意義(##p˂0.01或#p˂0.05)，說明模型建立成功。表5中，與模型組小鼠相比，實驗組小鼠空腹血糖濃度得到有效控制(**p˂0.01)，血糖耐受量得到有效改善(**p˂0.01)；表6中，實驗組小鼠體內的肌糖原和肝糖原含量顯著增多(**p˂0.01).
動物實驗結果表明，青稞β-葡聚糖可以有效地降低高血糖小鼠的空腹血糖，改善口服血糖耐受量，促進肝糖原以及肌糖原的合成，從而可以進一步確認，採用該工藝製備的β-葡聚糖具有良好的降血糖的作用。
根據上述數據，可以判斷採取該工藝製備的青稞β-葡聚糖具有較好的降血脂以及降血糖活性。
實施例二
本實施案例按如下步驟展示一種青稞β-葡聚糖的製備工藝：
將青稞連帶麩皮磨粉，過40目篩；將青稞粉收集後，稱取80g青稞粉，加入400ml80%乙醇溶液，置於75℃回流2h。離心，除去乙醇溶液和色素，將沉澱置於乾燥箱烘乾。加水攪拌，按照料水比為1:20，向80g青稞粉中加入1600ml水溶液，使用20%na2co3調整ph至10，並加入12ml(約359u)耐高溫澱粉酶，在85℃條件下攪拌回流2h，4500r/min，15min，收集上清液；冷卻至室溫，4500r/min，15min，分離後收集上清液，再加入適量耐高溫澱粉酶，85℃保持1-2h，選用0.1mol/l碘液作為指示劑，直至碘液不再變色，確認澱粉降解為單糖或寡糖；冷卻至室溫後，用hcl調整溶液ph至3，攪拌，靜置，沉澱蛋白；4500r/min，15min，離心得上清液，調整ph至7.0，旋轉蒸發，將體積濃縮至1/3，並於每50ml濃縮液中加入16.5g(nh4)2so4固體，邊加邊攪拌，使硫酸銨溶液充分溶解後，置於4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉澱，加入250ml純水，充分加熱溶解；冷卻至室溫，緩慢加入3倍體積的無水乙醇，充分攪拌後，置於4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉澱，加入250ml純水，邊加熱邊攪拌，直至沉澱完全溶解；採用孔徑為3500da的卷式有機膜進行脫鹽處理，每隔1h換水，透析24h，用0.5mbacl2進行監測，直至樣品溶液與bacl2溶液混合時不再產生白色沉澱；12000r/min，15min，去除溶液中可能存在的不溶性小顆粒，收集上清液，將溶液濃縮為原來體積的1/5，冷凍乾燥，得到3.5gβ-葡聚糖產品。
實施例三
本實施案例按如下步驟展示一種青稞β-葡聚糖的製備工藝：
將青稞連帶麩皮磨粉，過40目篩；將青稞粉收集後，稱取120g青稞粉，加入600ml80%乙醇溶液，置於75℃回流2h。離心，除去乙醇溶液和色素，將沉澱置於乾燥箱烘乾。加水攪拌，按照料水比為1:15，向120g青稞粉中加入1800ml水溶液，使用20%na2co3調整ph至10，並加入14ml(約408u)耐高溫澱粉酶，在90℃條件下攪拌回流2h，4500r/min，15min，收集上清液；冷卻至室溫，4500r/min，15min，分離後收集上清液，再加入適量耐高溫澱粉酶，85℃保持1-2h，選用0.1mol/l碘液作為指示劑，直至碘液不再變色，確認澱粉降解為單糖或寡糖；冷卻至室溫後，用hcl調整溶液ph至2.5，攪拌，靜置，沉澱蛋白；4500r/min，15min，離心得上清液，調整ph至7.0，旋轉蒸發，將體積濃縮至1/3，並於每50ml濃縮液中加入12.5g(nh4)2so4固體，邊加邊攪拌，使硫酸銨溶液充分溶解後，置於4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉澱，加入400ml純水，充分加熱溶解；冷卻至室溫，緩慢加入3倍體積的無水乙醇，充分攪拌後，置於4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉澱，加入400ml純水，邊加熱邊攪拌，直至沉澱完全溶解；採用孔徑為3500da的卷式有機膜進行脫鹽處理，每隔1h換水，透析24h，用0.5mbacl2進行監測，直至樣品溶液與bacl2溶液混合時不再產生白色沉澱；12000r/min，15min，去除溶液中可能存在的不溶性小顆粒，收集上清液，將溶液濃縮為原來體積的1/5，冷凍乾燥，得到4.8gβ-葡聚糖產品。
實施例四
本實施案例按如下步驟展示一種青稞β-葡聚糖的製備工藝：
將青稞連帶麩皮磨粉，過60目篩；將青稞粉收集後，稱取140g青稞粉，加入840ml80%乙醇溶液，置於75℃回流2h。離心，除去乙醇溶液和色素，將沉澱置於乾燥箱烘乾。加水攪拌，按照料水比為1:10，向140g青稞粉中加入1400ml水溶液，使用20%na2co3調整ph至10，並加入19ml(約600u)耐高溫澱粉酶，在85℃條件下攪拌回流2h，4500r/min，15min，收集上清液；冷卻至室溫，4500r/min，15min，分離後收集上清液，再加入適量耐高溫澱粉酶，85℃保持1-2h，選用0.1mol/l碘液作為指示劑，直至碘液不再變色，確認澱粉降解為單糖或寡糖；冷卻至室溫後，用hcl調整溶液ph至3，攪拌，靜置，沉澱蛋白；4500r/min，15min，離心得上清液，調整ph至7.0，旋轉蒸發，將體積濃縮至1/3，並於每50ml濃縮液中加入16.5g(nh4)2so4固體，邊加邊攪拌，使硫酸銨溶液充分溶解後，置於4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉澱，加入500ml純水，充分加熱溶解；冷卻至室溫，緩慢加入3倍體積的無水乙醇，充分攪拌後，置於4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉澱，加入500ml純水，邊加熱邊攪拌，直至沉澱完全溶解；採用孔徑為3500da的卷式有機膜進行脫鹽處理，每隔1h換水，透析24h，用0.5mbacl2進行監測，直至樣品溶液與bacl2溶液混合時不再產生白色沉澱；12000r/min，15min，去除溶液中可能存在的不溶性小顆粒，收集上清液，將溶液濃縮為原來體積的1/5，冷凍乾燥，得到5.2gβ-葡聚糖產品。
實施例五
本實施案例按如下步驟展示一種青稞β-葡聚糖的製備工藝：
將青稞連帶麩皮磨粉，過60目篩；將青稞粉收集後，稱取200g青稞粉，加入1000ml80%乙醇溶液，置於75℃回流2h。離心，除去乙醇溶液和色素，將沉澱置於乾燥箱烘乾。加水攪拌，按照料水比為1:15，向200g青稞粉中加入3000ml水溶液，使用20%na2co3調整ph至10，並加入24ml（約750u）耐高溫澱粉酶，在85℃條件下攪拌回流2h，4500r/min，15min，收集上清液；冷卻至室溫，4500r/min，15min，分離後收集上清液，再加入適量耐高溫澱粉酶，85℃保持1-2h，選用0.1mol/l碘液作為指示劑，直至碘液不再變色，確認澱粉降解為單糖或寡糖；冷卻至室溫後，用hcl調整溶液ph至3，攪拌，靜置，沉澱蛋白；4500r/min，15min，離心得上清液，調整ph至7.0，旋轉蒸發，將體積濃縮至1/3，並於每50ml濃縮液中加入16.5g(nh4)2so4固體，邊加邊攪拌，使硫酸銨溶液充分溶解後，置於4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉澱，加入600ml純水，充分加熱溶解；冷卻至室溫，緩慢加入3倍體積的無水乙醇，充分攪拌後，置於4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉澱，加入600ml純水，邊加熱邊攪拌，直至沉澱完全溶解；採用孔徑為3500da的卷式有機膜進行脫鹽處理，每隔1h換水，透析24h，用0.5mbacl2進行監測，直至樣品溶液與bacl2溶液混合時不再產生白色沉澱；12000r/min，15min，去除溶液中可能存在的不溶性小顆粒，收集上清液，將溶液濃縮為原來體積的1/5，冷凍乾燥，得到12.3gβ-葡聚糖產品。
綜上所述，本發明公開了一種青稞β-葡聚糖的製備工藝，通過高效溶出、硫酸銨沉澱、超濾膜過濾等關鍵工藝的改進，使得β-葡聚糖有較高的純度，純度達到95%以上，且色澤較好；得率較高，每100g乾燥青稞粉中可提取3-10gβ-葡聚糖；結構序列明確；以及具有良好的降血脂以及降血糖活性，可以用於高血脂以及糖尿病的治療，為開發治療高血脂以及糖尿病的新藥打下基礎，積極推動高血脂以及糖尿病天然藥物活性成分的研究開發。
應說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。