一種吲哚菁綠自組裝納米疫苗及製備方法與流程

2023-10-11 05:14:44

本發明涉及一種納米疫苗的製備方法，尤其涉及一種吲哚菁綠自組裝納米疫苗。

背景技術：

隨著社會老齡化和人們生活方式的改變，惡性腫瘤已成為人類的「第一殺手」。大量的臨床研究結果證實，旨在直接破壞和清除腫瘤細胞的腫瘤常規治療手段，如手術切除、化療及放療等手段，不可能徹底地清除體內所有腫瘤細胞，往往由於殘存微小腫瘤轉移灶的存在，引起腫瘤復發而導致治療失敗。和上述腫瘤常規治療手段不同，腫瘤免疫療法針對的靶標不是腫瘤細胞和腫瘤組織，其目的旨在激活機體免疫系統，是希望依靠自身免疫機能殺滅腫瘤細胞的抗腫瘤療法。誘發機體內在的抗腫瘤免疫反應，在腫瘤治療效應中起著關鍵作用，尤其對防止殘存腫瘤細胞的復發具有非常重要的意義。

隨著腫瘤免疫療法的深入研究，腫瘤疫苗的發展備受關注。現代生物技術開發的新型多肽疫苗，多數不能激發細胞免疫效應，成為絕大多數新型多肽疫苗研發中的瓶頸問題。利用光敏劑的光化學內化作用，可以調控外源性多肽抗原在抗原提呈細胞內的呈遞途徑，進而激活抗原特異性的細胞免疫反應，提高免疫抗腫瘤療效。光敏劑是光化學內化作用的核心物質，但現有的光敏劑常存在水溶性差，易聚集等缺點，限制其在臨床上的廣泛應用。另外，目前研究中多採用將光敏劑和多肽抗原通過簡單物理混合的方式給藥，由於光敏劑和多肽抗原的理化性能差異，通常會導致無法獲得理想的治療效果。

技術實現要素：

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種吲哚菁綠自組裝納米疫苗。

本發明的第二個目的是提供一種吲哚菁綠自組裝納米疫苗的製備方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種吲哚菁綠自組裝納米疫苗的製備方法，包括以下步驟：

(1)將抗原蛋白水溶液與吲哚菁綠琥珀醯亞胺酯二甲基亞碸溶液等體積混合，所述抗原蛋白與吲哚菁綠琥珀醯亞胺酯的摩爾比為1:1～50，在20～30℃下反應18～48小時，使吲哚菁綠通過醯胺鍵連接在所述抗原蛋白上；

(2)將步驟(1)製備的產物加入到水中，製成質量百分比濃度為0.001％～1％的溶液，在20～30℃下孵育18～48小時；調節溫度至4～10℃，以15000～30000rpm轉速離心20～40min，收集納米粒，冷凍乾燥後得到吲哚菁綠自組裝納米疫苗。

上述方法製備的吲哚菁綠自組裝納米疫苗。

本發明的優點：

本發明的疫苗，合成工藝簡單方便，在應用時，吲哚菁綠不易聚集、穩定性良好；所述吲哚菁綠自組裝納米疫苗聯合近紅外雷射照射，可以實現吲哚菁綠和多肽抗原的共遞送，可以激活抗原特異性cd8+細胞毒性t細胞反應，增強抗腫瘤免疫應答，解決了傳統多肽疫苗不能激活細胞免疫反應的技術問題。

附圖說明

圖1為本發明吲哚菁綠自組裝納米疫苗的原子力顯微鏡圖。

圖2為本發明吲哚菁綠自組裝納米疫苗對荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤細胞模型小鼠的抑瘤效果曲線圖。

圖3為荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤細胞模型小鼠接種本發明吲哚菁綠自組裝納米疫苗後，小鼠脾臟內cd8+inf-γ+t細胞的比例分析。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明作進一步的說明。

本發明各實施例所用抗原蛋白為模擬蛋白卵清蛋白(ovalbumin，ova)，是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發明，凡是具有抗腫瘤的抗原蛋白，都可以用於本發明。

實施例1

一種吲哚菁綠自組裝納米疫苗的製備方法，包括以下步驟：

(1)將模擬蛋白模型抗原ova水溶液與吲哚菁綠琥珀醯亞胺酯二甲基亞碸溶液等體積混合，所述模擬蛋白ova與吲哚菁綠琥珀醯亞胺酯的摩爾比為1:25，在25℃下反應32小時，使吲哚菁綠通過醯胺鍵連接在模擬蛋白ova上；

(2)將步驟(1)製備的產物加入到水中，製成質量百分比濃度為0.01％的溶液，在25℃下孵育32小時；調節溫度至7℃，以22500rpm轉速離心30min，收集納米粒，冷凍乾燥後得到吲哚菁綠自組裝納米疫苗，見圖1，圖2和圖3。

圖1為本實施例獲得的吲哚菁綠自組裝納米疫苗的原子力顯微鏡圖。由圖1可以看出該吲哚菁綠自組裝納米顆粒的粒徑在80nm左右，粒徑分布均勻。

圖2是本實施例獲得的吲哚菁綠自組裝納米疫苗對荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤細胞模型小鼠的抑瘤效果曲線圖。

本實驗中涉及到的eg.7-ova小鼠t淋巴瘤細胞購買於美國細胞培養收藏中心(americantypecellculture，atcc)，在該腫瘤模型小鼠中，ova可以作為腫瘤抗原產生抗腫瘤免疫效應。圖中顯示了生理鹽水組，游離抗原蛋白組，吲哚菁綠自組裝納米疫苗組。實驗表明在相同抗原劑量下，吲哚菁綠自組裝納米疫苗組同游離抗原蛋白組相比較具有明顯的抑瘤效果。

圖3是荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤細胞實體瘤模型小鼠接種本實施例的吲哚菁綠自組裝納米疫苗後，小鼠脾臟內cd8+inf-γ+t細胞的比例分析，其中顯示了生理鹽水組，游離抗原蛋白組，吲哚菁綠自組裝納米疫苗組。流式細胞術結果顯示，在相同抗原劑量下同游離抗原蛋白組相比較，吲哚菁綠自組裝納米疫苗組顯著促進了疫苗接種小鼠淋巴結中cd8+t細胞的增殖活化。

實施例2

一種吲哚菁綠自組裝納米疫苗的製備方法，包括以下步驟：

(1)將模擬蛋白ova水溶液與吲哚菁綠琥珀醯亞胺酯二甲基亞碸溶液等體積混合，所述模擬蛋白ova與吲哚菁綠琥珀醯亞胺酯的摩爾比為1:1，在30℃下反應18小時，使吲哚菁綠通過醯胺鍵連接在模擬蛋白ova上；

(2)將步驟(1)製備的產物加入到水中，製成質量百分比濃度為0.001％的溶液，在30℃下孵育18小時；調節溫度至10℃，以30000rpm轉速離心20min，收集納米粒，冷凍乾燥後得到吲哚菁綠自組裝納米疫苗，

粒徑在50nm左右，粒徑分布均勻。

實驗證明，本實施例吲哚菁綠自組裝納米疫苗對荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤細胞模型小鼠的抑瘤效果與實施例1相似。

實施例3

一種吲哚菁綠自組裝納米疫苗的製備方法，包括以下步驟：

(1)將模擬蛋白ova水溶液與吲哚菁綠琥珀醯亞胺酯二甲基亞碸溶液等體積混合，

所述模擬蛋白ova與吲哚菁綠琥珀醯亞胺酯的摩爾比為1:50，在20℃下反應48小時，使吲哚菁綠通過醯胺鍵連接在模擬蛋白ova上；

(2)將步驟(1)製備的產物加入到水中，製成質量百分比濃度為1％的溶液，在20℃下孵育48小時；調節溫度至4℃，以15000rpm轉速離心40min，收集納米粒，冷凍乾燥後得到吲哚菁綠自組裝納米疫苗。

粒徑在120nm左右，粒徑分布均勻。

實驗證明，本實施例吲哚菁綠自組裝納米疫苗對荷eg.7-ova小鼠t淋巴瘤細胞模型小鼠的抑瘤效果與實施例1相似。