一種利用尖吻蝮蛇毒特異蛋白製備抗血清的方法及其應用與流程
2023-10-05 18:04:19 3
本發明涉及一種利用尖吻蝮蛇毒特異蛋白製備抗血清的方法及其應用。一種檢測被尖吻蝮蛇咬傷抗血清的製備方法，屬於免疫學領域。
背景技術：
：尖吻蝮蛇又名俗稱五步蛇(Agkistrodonacutus)，屬於蝮亞科、蝮屬，是我國特有蛇種，為血循環型毒蛇，劇毒。該蛇分布於我國長江以南地區，包括中國臺灣，因蛇毒中含有多種出血毒素，被咬傷後傷口和內臟出血，繼而壞死，被該蛇咬傷後如不及時治療，致死、致殘率極高。尖吻蝮蛇棲息地還有其他毒蛇，如江浙蝮蛇、眼鏡蛇、眼睛王蛇、蝰蛇、竹葉青、烙鐵頭、金環蛇和銀環蛇，被毒蛇咬傷有的患者有時不能夠確定是被哪種毒蛇咬傷，因此不能夠對症治療，耽誤了治療的寶貴時間。如果能夠生產一種抗血清，該抗血清中的抗體能夠與尖吻蝮蛇毒中的某種成分結合，與其他蛇毒成分都不結合，因此可以通過酶聯免疫檢測（ELISA）的方法確定是否為尖吻蝮蛇咬傷。技術實現要素：本發明公開了一種利用尖吻蝮蛇毒特異蛋白製備抗血清的方法及應用。本發明通過CM-SEphadexC50離子交換層析和製備凝膠電泳分離出尖吻蝮蛇毒中特異的蛋白質，注射免疫小鼠製備抗血清，由於該蛋白質僅僅存在於尖吻蝮蛇毒中，其他蛇毒如江浙蝮蛇毒、眼鏡蛇蛇毒、眼睛王蛇毒、蝰蛇毒、竹葉青蛇毒、烙鐵頭蛇毒、金環蛇毒和銀環蛇毒不含這種蛋白質，取含蛇毒的傷口流出液進行ELISA檢測就可以確定是否被尖吻蝮蛇咬傷，避免誤診。本發明的具體技術方案如下：一種利用尖吻蝮蛇毒特異蛋白製備抗血清的方法，其特徵在於包括以下步驟：a、用CM-SEphadexC50離子交換層析法初步純化尖吻蝮蛇毒特異蛋白，用0.2MNaCl的0.05MpH5.6HAc-NaAc洗脫獲得初步純化的尖吻蝮蛇毒特異蛋白；b、用12%PAGE製備凝膠電泳並用考馬斯亮藍染色，第二條帶為獲得的尖吻蝮蛇毒特異蛋白；c、將含有特異蛋白的聚丙烯醯胺凝膠磨細後直接免疫注射小鼠，共注射4次，每次間隔7天，第4次注射後3天斷頭取血，血液放置5-7小時後離心獲得抗血清。所述的一種利用尖吻蝮蛇毒特異蛋白製備抗血清的方法製得的抗血清。所述的抗血清在檢測判斷被尖吻蝮蛇咬傷上的應用。本發明的技術效果體現在二個方面：1、鑑定方法簡單、結果準確由於從尖吻蝮蛇毒中純化的蛋白質是特異的，其他蛇毒不含這種蛋白質，也沒有與此有親緣關係的蛋白質，因此製備的抗血清中的抗體僅僅能夠與尖吻蝮蛇毒中的這個特異蛋白質結合，與其他蛇毒不結合，確保了結果的準確性。由於檢測採用常規的酶聯免疫檢測（ELISA）的方法,從傷口取少量液體（含毒液）通過常規ELISA檢測即可。2、鑑定費用很低需要的主要試劑為抗血清，據估算，一隻小鼠產生的抗血清能夠滿足800次的檢測，因此檢測費用很低。具體實施方式一、特異性蛇毒蛋白的純化取1克皖南產尖吻蝮蛇毒，用15mL0.05MpH5.6HAc-NaAc緩衝液溶解，13000轉/分鐘離心去除不溶性雜質，將蛇毒溶液上長60cm,直徑2cm的CM-SephandexC50離子交換層析柱，用3倍柱體積的0.05MpH5.6HAc-NaAc緩衝液充分洗脫未結合的酸性蛋白，然後用用1.5倍柱體積的含0.1MNaCl的0.05MpH5.6HAc-NaAc洗脫不需要的雜蛋白，然後用1.5倍柱體積的含0.2MNaCl的0.05MpH5.6HAc-NaAc洗脫，特異蛋白被洗脫下來。收集洗脫溶液，透析袋濃縮至5mL，然後對0.05MpH5.6HAc-NaAc緩衝液透析12小時去除多餘的鹽，獲得初步純化的尖吻蝮蛇特異性蛋白，1mL/管分裝，-20℃冷凍備用。取1管蛇毒分離物進行12%PAGE製備電泳（配製見表1，濃縮膠不插梳子），電泳後考馬斯亮藍染色、脫色後獲得三條藍色蛋白質條帶，第二條為特異性蛋白條帶，用手術刀片切下蛋白質條帶，膠體含特異性蛋白，將膠條分成4份冷凍備用。表112%PAGE試劑分離膠(12%)36mL濃縮膠（5%）10mLddH2O11.886.830%丙烯醯胺14.41.71.5MTris-HCl（pH8.8）9.01.0MTris-HCl（pH6.8）1.2510%過硫酸胺0.360.1TEMED0.0150.01二、免疫小鼠並製備抗血清取1份含特異蛋白的膠體，加2mL生理鹽水，於研缽內充分磨細，吸入到5mL規格的一次性注射器中，免疫注射18-22克規格的小鼠，每隻小鼠0.5mL，第一次注射每隻小鼠皮下注射0.25mL,腹腔注射0.25mL，第二、第三、第四間隔7天，均為腹腔注射，每隻小鼠腹腔注射0.5mL，第四次注射後第3天斷頭取血，6小時後離心獲得抗血清，冷凍保存。三、抗血清特異性的篩選將常見的蛇毒江浙蝮蛇毒、眼鏡蛇蛇毒、眼睛王蛇毒、蝰蛇毒、竹葉青蛇毒、烙鐵頭蛇毒、金環蛇毒和銀環蛇毒8種蛇毒分別用包被液（0.05mol/L碳酸鹽緩衝液，pH9.6）配製成0.1%濃度溶液作為樣品抗原，進行常規ELISA檢測，以沒有抗原的包被液作為陰性對照孔，0.1%濃度尖吻蝮蛇作為陽性對照孔，用製備的抗血清作為一抗（抗尖吻蝮蛇特異性蛋白），羊抗兔IgG-鹼性磷酸酶為二抗，1mg/mL的p-NPP為底物，顯色45分鐘後在酶標儀上測定OD405值，以陰性對照OD405值為標準，樣品值超過2.1倍陰性對照OD405值確定為陽性，否則為陰性。結果表明：8種蛇毒均顯色陰性結果，尖吻蝮蛇抗原顯色陽性結果，說明8種蛇毒都不含與尖吻蝮蛇毒特異蛋白相同或者抗原性相同的蛋白質，製備的抗血清僅能夠與尖吻蝮蛇毒中的特異蛋白結合。四、模擬檢測實施例一：第一步：咬傷模擬用3公斤雄性實驗家兔模擬實驗，將腿部毛剃除，用1公斤重尖吻蝮蛇咬家兔腿部，傷口簡單衝洗；第二步：檢測樣品的獲得30分鐘後從傷口取約50uL血液，離心去除細胞等顆粒，加200uL包被液稀釋作為待測樣品溶液；第三步：ELISA檢測分別設二個陰性對照孔（包被液）、二個陽性對照孔（0.1%尖吻蝮蛇毒）、二個樣品孔。用製備的抗血清作為一抗（抗尖吻蝮蛇特異性蛋白），羊抗兔IgG-鹼性磷酸酶為二抗，1mg/mL的p-NPP為底物，顯色45分鐘後在酶標儀上測定OD405，平均值分別為，OD405陰性對照＝0.045;OD405陽性對照＝1.246；OD405樣品＝1.421；說明製備的抗血清能夠檢測被尖吻蝮蛇咬傷的動物。實施例二：第一步：咬傷模擬用2.8公斤雌性實驗家兔模擬實驗，將腿部毛剃除，用另一條1.1公斤重尖吻蝮蛇咬家兔腿部，傷口簡單衝洗；第二步：檢測樣品的獲得40分鐘後從傷口取約50uL血液，離心去除細胞等顆粒，加200uL包被液稀釋作為抗原溶液；第三步：ELISA檢測與「實施例一」第三步相同。顯色45分鐘後在酶標儀上測定OD405平均值分別為，OD405陰性對照＝0.050;OD405陽性對照＝1.189；OD405樣品＝1.240；說明製備的抗血清能夠檢測被尖吻蝮蛇咬傷的動物。實施例三：第一步：咬傷模擬用2.9公斤雌性實驗家兔模擬實驗，將腿部毛剃除，用另一條0.9公斤重尖吻蝮蛇咬家兔腿部，傷口簡單衝洗；第二步：檢測樣品的獲得50分鐘後從傷口取約50uL血液，離心去除細胞等顆粒，加200uL包被液稀釋作為抗原溶液；第三步：ELISA檢測與「實施例一」第三步相同。顯色45分鐘後在酶標儀上測定OD405平均值分別為，OD405陰性對照＝0.048;OD405陽性對照＝1.521；OD405樣品＝1.210；說明製備的抗血清能夠檢測被尖吻蝮蛇咬傷的動物。本發明三個實施例用不同重量家兔、不同重量的尖吻蝮蛇、不同時間取樣品獲得的檢測結果相似，說明該發明製備的抗血清能夠檢測尖吻蝮蛇咬傷，穩定且可靠。當前第1頁1 2 3