一種l-叔亮氨酸的生產方法
2023-09-22 10:11:35
專利名稱：一種l-叔亮氨酸的生產方法
技術領域：
本發明適用於生物製藥和生物化工技術領域，尤其涉及一種L-叔亮氨酸的生產方法。
背景技術：
非天然胺基酸及其衍生物是重要的化工中間體。其中，L-叔亮氨酸是一種重要的非天然胺基酸。它可以用於合成醫藥中間體，及作為不對稱合成的手性誘導劑和不對稱拆分的拆分試劑，是合成多種抗愛滋病藥物和肝炎病毒抑制劑等藥物的手性前體。隨著我國社會經濟的發展和環境保護意識的增強，醫藥化工行業不但需要提高L-叔亮氨酸的生產能力，而且需要創造綠色無汙染的生產工藝。因此，利用酶法進行生物轉化生產L-叔亮氨酸正越來越受到相關機構的重視。從生產路線上劃分，生產L-叔亮氨酸的方法主要有化學試劑拆分法，手性源合成法，化學合成法和生物轉化法。其中拆分法受到得率限制，手性源法受到天然產物產能的限制，化學合成法成本較高，因此其它合成方法並無成功大規模應用的實例，生物轉化法目前已經成為生產L-叔亮氨酸的主要方法。生物轉化法中，利用脂肪酶拆分消旋體DL-叔亮氨酸的相關工藝研究較多，如中國專利CN201010210770. 0等，但是該路線存在著與化學拆分法同樣的缺陷，即收率難以超過50%。因此，目前生物法的主要研究方向均集中於利用L-亮氨酸脫氫酶從三甲基丙酮酸還原為L-叔亮氨酸的路線，並利用甲酸脫氫酶原位再生輔酶NADH，利用甲酸銨提供氨分子和氫原子。早在上世紀九十年代德國的Degussa公司就利用該路線與超濾膜反應器結合，生產L-叔亮氨酸。該路線已經有數個專利申請公開，如中國專利CN201110116253. 1，CN201110277030. 3等，其存在的主要問題如下1.目前公開的專利中，反應起始底物濃度為10-15%。事實上，學術界公認的L-叔亮氨酸脫氫酶在底物濃度過高時會受到顯著的底物抑制，反應速率急劇下降(Enzyme Catalysis in Organic Synthesis Edition
I,Wiley, 1186)，在高氨濃度的條件下，過量的底物和生成的產物累積都會形成副產物(Biocatalysis 1994，10: 37-47; J. Mol. Catal: B 1998，5: 1-11) 可見，以上專利的方法是低效率的，或是難以重複的；2.酶投料量過多。顯而易見的，這是問題I的必然結果。例如專利CN201110116253. I中，昂貴的輔酶NAD投料量達到底物的l%(w/w)，經濟性差，專利CN201110277030. 3中整細胞催化劑佔反應體系的濃度為80%(4g/5 mL) ；3.無明確的後提取工藝。同樣由於問題I的存在，其得率和收率均不能滿足工業化生產的需要。基於以上三點，目前尚未見利用該方法規模化生產L-叔亮氨酸的報導。
發明內容
為解決以上問題，本發明的目的在於提供一種酶法合成L-叔亮氨酸的方法。該方法製備條件溫和，環境友好，收率高，成本低，適用於工業化生產。為實現上述目的，本發明提供的技術方案是一種L-叔亮氨酸的生產方法，所述方法利用L-亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶生產L-叔亮氨酸，其製備反應方程式為
權利要求
1.一種L-叔亮氨酸的生產方法，其特徵在於，所述方法利用L-亮氨酸脫 氫酶和甲酸脫氫酶酶法合成L-叔亮氨酸。
2.根據權利要求I所述酶法生產L-叔亮氨酸的方法，其特徵在於，包括如下步驟 (1)稱量一定量L-亮氨酸脫氫酶，甲酸脫氫酶，NAD於2000mL三口瓶中，加入200 mL5.0 mol/L甲酸銨水溶液，430 mL去離子水，150 mL 2.0 mol/L三甲基丙酮酸溶液包含底物40 g，裝置搭建完成，溫度達到預定值後，啟動機械攪拌，開始反應計時，維持反應體系在一定溫度; (2)補料流程反應開始後，2小時補加150mL 2.0 mol/L三甲基丙酮酸溶液包括底物40g，4小時補加70 mL包括底物20 g ； (3)反應過程利用HPLC-MS和HPLC監測反應，至24小時底物完全轉化為產物，加熱反應液至60°C，1-2小時後加入硅藻土過濾，得到產物溶液，旋轉蒸發去除水得到固體粗產品; (4)加入200mL甲醇洗滌兩次，取甲醇洗滌液蒸乾，得到精製產品。
3.根據權利要求2所述酶法生產L-叔亮氨酸的方法，其特徵在於，步驟(I)中，L-亮氨酸脫氫酶，甲酸脫氫酶的總投料量不超過底物質量的4%，輔酶NAD投料量不超過底物質量的O. 2%ο
4.根據權利要求2所述酶法生產L-叔亮氨酸的方法，其特徵在於，步驟(I)中，溫度達到預定值具體為36°C，反應過程維持反應體系溫度為35°C -37°C。
5.根據權利要求2所述酶法生產L-叔亮氨酸的方法，其特徵在於，步驟(I)、⑵中，所述底物分子結構式為
6.根據權利要求2所述酶法生產L-叔亮氨酸的方法，其特徵在於，步驟(3)中反應過程用HPLC-MS和HPLC監測反應進度，具體通過監測底物
全文摘要
本發明涉及生物製藥和生物化工領域，具體涉及一種L-叔亮氨酸的生產方法，所述方法由L-亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶酶法合成L-叔亮氨酸。酶催化步驟中酶投料量為底物的4%(w/w)，輔酶投料量為底物的0.2%(w/w)，時空產率為100g/d/L，產品純度>98%，光學純度>99%。本發明與傳統的製備工藝相比，有效減少了催化劑酶的用量，產品純度高、產率高，工藝流程簡單，對設備無特殊要求，適用於工業化生產，產品可廣泛應用於化工中間體和醫藥中間體。
文檔編號C12P13/04GK102978251SQ20121050808
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月3日 優先權日2012年12月3日
發明者王海豔, 鞠鑫, 李斌, 唐圓圓, 張超 申請人:蘇州漢酶生物技術有限公司