一種檢測硝酸鹽的微生物細胞傳感器的製作方法
2023-09-22 23:16:35 1
專利名稱：一種檢測硝酸鹽的微生物細胞傳感器的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測水體中硝酸鹽含量的微生物細胞傳感器的搭建及使用。
背景技術：
近年來，隨著工業化和農業現代化進程的加快，硝酸鹽類化肥在農業中的使用越來越多，從農田中淋洗到河水和地下水中的硝酸鹽累積增加，可導致水體富營養化。富營養化會影響水體的水質，對水生動物造成傷害；同時富營養化水中含有硝酸鹽和亞硝酸鹽，人畜長期飲用這些物質含量超過一定標準的水，也會中毒致病。因此對水體中的硝酸鹽含量必須進行檢測控制。利用微 生物細胞傳感器檢測環境中特定物質含量是近年來興起的一種新的檢測方法。
發明內容
本發明檢測硝酸鹽的微生物細胞傳感器是利用大腸桿菌中硝酸鹽還原酶基因啟動子與商業化質粒中信號強度高的螢光素酶報告基因(Iuc) —起構建出的一種有效檢測硝酸鹽含量的微生物細胞傳感器。構建該細胞傳感器的具體操作步驟為:1、含有終止子的質粒的搭建:對pUC19質粒用BamHI與Sph I進行雙酶切處理後純化得到載體a ；以大腸桿菌基因組為模板，擴增得到大腸桿菌終止子，用上述兩種酶進行雙酶切處理後純化得到片段r ；將片段r連入載體a，利用大腸桿菌作為宿主進行轉化得到含有終止子的質粒；2、含有大腸桿菌硝酸鹽還原酶基因啟動子的質粒的搭建:對含有終止子的質粒用BamHI與EcoRI進行雙酶切處理後純化得到載體b ；以大腸桿菌基因組為模板，擴增得到大腸桿菌硝酸鹽還原酶基因啟動子，用上述兩種酶進行雙酶切處理後純化得到片段η ;將片段η連入載體b，利用大腸桿菌作為宿主進行轉化得到含有大腸桿菌硝酸鹽還原酶基因啟動子的質粒；3、目標質粒的搭建:對含有大腸桿菌硝酸鹽還原酶基因啟動子的質粒用BamHI進行酶切處理後純化得到載體c ;以商業化質粒pEGMluc為模板，擴增得到螢光素酶報告基因，用上述酶進行酶切處理後純化得到片段u ;將片段u連入載體C，利用大腸桿菌作為宿主進行轉化得到目標質粒;4、得到檢測硝酸鹽的微生物細胞傳感器:利用商業化宿主感受態細胞為宿主，將目標質粒轉入宿主細胞得到檢測硝酸鹽的微生物細胞傳感器。以下通過具體實事例詳細說明發明的實施，目的在於幫助讀者更好地理解本發明的實質，但不作為對本發明實施範圍的限定。實施例1:第一步:接種單菌落(載體細胞空白同時接種)於50ml三角瓶中；氨苄青黴素終濃度為100 μ g/ml ；37度過夜培養；第二步:5ml的LB培養基加入設定濃度的誘導物(如硝酸鉀濃度100 μ Μ)；第三步:菌體培養至0D600 = 1.2 ；第四步:稀釋到0D600 = 0.4，取5ml的稀釋好的培養液加入第二步準備好的培養液中；23度誘導；第五步:對於細菌，將40 μ I未轉化細胞(載體細胞)與50 μ I轉化的培養物混合(細胞濃度相同)加入10 μ I IM K2HPO4 (pH 7.8)，20mM EDTA ( 一個溶液)。用-70度冰箱快速冷凍混合物(凍融)(lOmin)，然後將細胞轉移至室溫並置於室溫水浴中(23度或置於室溫下平衡30分鐘)。加入300 μ I新鮮配製的裂解混合物(見附錄)。混合併於室溫孵育10分鐘；第五步:檢測；每個96孔板中加入20 μ I的裂解液後，加入100 μ I螢光素酶檢測液，立刻檢測；第六步:數據處理，得到數據與空白對照的差值，然後改差值乘以400得到即為每毫升菌液對應的數值。附錄10毫升裂解混合物配方:5.5ml 水2ml 5 X CCLR
加入25mg BSA 2.5ml 溶菌酶混合液(配 5ml 配方:0.5ml IM IM K2HPO4 (pH 7.8), 20mMEDTA+4.5ml無菌水然後加入25mg溶菌酶)混合均勻。
權利要求
1.一種微生物傳感器，由大腸桿菌作基本材料，通過基因工程手段構建用來檢測水體中硝酸鹽的含量。
2.根據權利要求1 所述的微生物傳感器，其特徵在於:檢測物質為硝酸鹽。
全文摘要
本發明是利用大腸桿菌硝酸鹽還原酶基因啟動子與螢光素酶基因(luc)構建於大腸桿菌中的一種傳感器，用於水體中硝酸鹽含量的檢測。本發明介紹了該傳感器的搭建以及使用。
文檔編號C12Q1/68GK103088113SQ20111034375
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者莊國強, 崔萌萌, 馬安周, 於清, 齊鴻雁 申請人:中國科學院生態環境研究中心