製備用作血液學對照品的紅細胞組分的製作方法
2023-09-22 11:11:25 2
專利名稱：製備用作血液學對照品的紅細胞組分的製作方法
製備用作血液學對照品的紅細胞組分本申請是國際申請號為PCT/US 2007/073625，國際申請日為2007年7月16日，進入中國國家階段的申請號為200780027^2. 5，名稱為「製備用作血液學對照品的紅細胞組分」的發明專利申請的分案申請。早期申請的交叉引用本申請要求2006年7月17日提交的美國臨時專利申請號60/807，585的優先權， 其內容通過引用全文納入本文。
背景技術：
1.發明領域本發明涉及血液學儀器的對照品材料領域，特別是關注對照品材料的紅細胞組分。2.現有技術描述分析血液組分和化學性質的血液學儀器已使用多年，在此期間這些儀器的精確性和靈敏度不斷提高。因此，早期形式的血液學儀器已被能根據各組分複雜而微妙的特徵來分析血液中不連續組分的較複雜機器替代。除了檢測紅細胞和血小板外，自動血液學儀器中的最新發展是人白細胞的多組分分析。白細胞群通常包括淋巴細胞、單核細胞、嗜中性白細胞、嗜鹼性粒細胞和嗜酸性粒細胞。血細胞分析方法包括檢測各類血細胞的電學和光學特性。典型的儀器可單獨對白細胞組分計數和區分紅細胞和血細胞大小。為計數白細胞，需要利用洗滌劑，例如季銨鹽破壞紅細胞，從而留下白細胞計數和區分大小。Beckman-Coulter 五組分白細胞分析儀器採用幾種不同的技術，各依據電阻率、 電導率(採用低壓DC檢測的DC數字操作)、Rf (射頻)調製和雷射技術(包括光散射和光吸收)。通常聯用Rf檢測和DC低頻檢測以產生稱為不透明度的參數，其是Rf除以DC的計算值。其它生產商，例如 Abbott Diagnostics 、Bayer 和 TOA Medical Electronics 的儀器聯用電阻率，DC電導率和/或雷射技術、Rf、去極化的90°角光散射和/或光吸收。 雖然電子技術的基礎類型看似相同，但各生產商對於分析血細胞所需的儀器硬體和軟體具有獨特的實現方式。各生產商對於該技術的各自實現方式導致各生產商的各自具體儀器需要大量不同的試劑和方法，從而增加了它們應用複雜性和花費。現有的試劑或方法無一可用於多種儀器。為確保血液學儀器的可靠性和精確性，管理當局要求利用血液對照品以驗證儀器的完整性。最佳對照品含有代表新鮮血液的所有細胞元件的顆粒，以及合成血漿，這是一種人工配製的液體懸浮介質以模擬人血漿。合成血漿通常含有與天然血漿的組分相同的或以相同方式起作用的組分。這些組分包括無機鹽、有機和/或無機緩衝液及維持與血漿蛋白質所維持相類似的穩態的粘性材料。對照品的生產商提供，例如細胞計數、細胞大小和細胞類型等所有關鍵值。對照品材料應具有足夠的保存期，從而能使用數天、數周或數月，進而確保儀器性能隨時間推移而一致。製備血液學對照品的方法依賴於使用該對照品的具體儀器的硬體和軟體設計以及長期保存的要求。血液對照品由RBC組分構成，通常是將經洗滌的人紅細胞懸浮在合成血漿中。紅細胞伴有會被儀器視作白細胞亞群的一種或多種顆粒。雖然白細胞對照品可以是人白細胞，但可使用以交聯劑穩定從而能防止被洗滌劑破壞的動物紅細胞作為替代。可用作Coulter -型儀器的人白細胞、紅細胞或血小板對照品的血液對照品產物中的顆粒對於其它儀器，例如Abbott Laboratories 、Bayer 或TOA Medical Electronics生產的那些儀器可能無效。此外，因為這些顆粒通常是修飾形式的各種類型血細胞，它們的性能與活的天然新鮮血細胞不相似。例如，對於Abbott 儀器，用交聯劑，如戊二醛固定的人白細胞的性能類似於嗜中性粒細胞，而對於Coulter 儀器類似於細胞碎片。對於某一類血液學儀器，特別處理並交聯的非哺乳動物脊椎動物的紅細胞還可顯示為單核的細胞，而對於另一類儀器可顯示為淋巴細胞。血液學對照品的紅細胞組分可在許多儀器上良好使用以驗證數值和化學值，例如計數和血紅蛋白含量以及物理特徵，例如大小和形狀，而這些數值，特別是物理特徵的那些值，例如平均細胞容積(MCV)、大小分布(RDW，即紅細胞分布寬度)和細胞形狀在不同儀器之間差別很大。此外，一類儀器可將紅細胞製品讀取為在血小板和/或白細胞計數區中所含的碎片，而另一類儀器讀取為不含這種碎片。例如，生物輻射實驗室公司(Bio-Rad Laboratories, Inc.)製造的血液學(C)產品中的紅細胞製品在拜爾Hl-E血液學儀器(Bayer Hl-E Hematology Instrument)上具有高血小板背景。在阿伯特細胞-DYN 4000 (Abbott CELL-DYN 4000)儀器上，此同一紅細胞製品在光學血小板和白細胞區中顯示有幹擾。在阿伯特細胞-DYN3000系列或1000系列儀器上不出現血小板或白細胞幹擾。生物輻射血液學(C)產品所用的紅細胞製品在考特爾(Coulter)儀器，例如考爾特MaxM型 (Coulter Model MaxM)上顯示沒有血小板或白細胞幹擾，但在阿伯特細胞-DYN 4000儀器上確實顯示血小板和白細胞幹擾。現有技術報導了將某些分析物加入血液對照品的懸浮介質，從而通過改進組分的物理特徵和防止顆粒碎片形成來改善該對照品中紅細胞組分性能。Ryan等在美國專利號 6，403，377B1中指導可加入脂蛋白來改善白細胞組分的大小特徵，加入抗氧化劑以防紅細胞裂解。^ung在公布的美國專利申請號US2005/0221497A1中類似地公開了利用脂蛋白增加白細胞組分的容積。與Ryan等相反，在^img的申請中，脂蛋白通過考特爾儀器所用的洗滌劑起到使紅細胞適當裂解的作用。Young還描述了血液對照品中需要非離子洗滌劑以進一步促進紅細胞裂解，而不損害血液對照品中所用白細胞替代品的完整性。已證明固定紅細胞是提供適用作白細胞類似物的不可裂解顆粒的有效方法。Hunt 在美國專利號3，873，467中描述了利用人紅細胞產生白細胞類似物的固定方法。上文Ryan 等描述了利用交聯劑穩定紅細胞。藉助這些方法固定的細胞可耐受機械應力，例如超聲處理誘導的應力。上文^ung等詳細描述了產生許多不同類型白細胞類似物的固定方法。 Carver 等在美國專利號 6，146，901，6，514，763B2，4, 704，364和 5，380，664 中公開了白細胞類似物的其它固定方法。本章節和本說明書它處引用的所有專利和公布的專利申請通過引用納入本文。發明概述本發明的目的之一是提供從脊椎動物來源製備用於血液學血液對照品中的紅細胞的方法，特別是足夠靈活從而能補償血液學儀器生產商所用不同技術的方法。本發明使得人們可採用本文所述方法定製工藝，從而獲得唯一符合所選血液學儀器規格的血液學對照品。提供從人紅細胞製備血液學血液對照品而無需血漿膽固醇或脂蛋白來增強紅細胞可裂解性的方法也是本發明目的之一。本發明的另一目的是提供含有紅細胞組分的血液學血液對照品，其中所述對照品本身不需要表面活性劑或其它裂解促進劑來增強紅細胞組分在血液學儀器中的可裂解性能。本發明的另一目的是提供含有紅細胞組分的血液學血液對照品，其中所述紅細胞組分用交聯劑固定從而儘可能降低或防止形成幹擾血小板和白細胞計數區的顆粒。本發明的另一目的是提供含有紅細胞組分的血液學血液對照品，其中所述紅細胞組分(a)用交聯劑固定從而能為多種儀器類型提供均勻的大小和形狀和(b)在有已知常規血液學儀器所用的和本領域用於區分白細胞亞群的溫和洗滌劑存在下，仍維持可裂解性能。本發明的另一目的是提供能在不同生產商製造的多種儀器上使用的血液學血液對照品。本發明還有另一目的是提供易製備且廉價的血液學血液對照品。為實現這些和其它目的，通過用低濃度固定劑在較短時間內處理(S卩，預處理)脊椎動物來源的紅細胞，即，哺乳動物無核紅細胞而獲得用於實施本發明的紅細胞組分。固定劑可以是已知用作組織穩定劑的各種物質之一，預處理方法包括將細胞與固定劑溫育足夠長的時間以交聯細胞，從而將可裂解細胞留在儀器中。一旦經預處理，將細胞與代表其它血細胞類型的組分混合而完成對照品的組成，然後在儀器中以與待分析血液樣品相同的方式加工該對照品。然後將分析結果與對照品的已知組成，即已知的血細胞分布作比較，比較結果用於核查儀器的狀況以驗證該儀器是否處於可用於實際樣品的狀況。預處理方法是有限的固定方法，不同於現有技術中典型的血液對照品的紅細胞固定方法，該方法使得細胞耐受血液學儀器所用洗滌劑的裂解作用。在本發明中，固定紅細胞的方式使得固定的細胞可在規定的儀器驗證條件下裂解，從而能視需要計數對照品中的紅細胞和白細胞以及任何其它血液組分。此種固定仍足以提供具有計數穩定性、物理穩定性(即，穩定的容積和形狀) 和顆粒完整性的紅細胞，從而防止形成可幹擾白細胞和/或血小板分析的顆粒。該方法還獲得在多種儀器技術中均能一致記錄細胞大小和計數的紅細胞，所述技術包括但不限於電學(例如，電阻率)和光學(例如，光散射)技術。發明和優選實施方式詳述可用於實施本發明的固定劑的分子結構極為不同。一組這樣的固定劑是有機二醛，優選含有由連接基團隔開的兩個末端醛基的那些固定劑，所述連接基團包含含有至少兩個碳原子的主鏈。此主鏈還可含有雜原子，例如0原子和N原子，但特別優選的主鏈是2-6 個碳原子的飽和亞烷基(即，二價烷基鏈)。連接基團還可含有與主鏈鍵合作為側鏈的支鏈基團，例如-OH、-NH2, -CH2, -OCH3和這些基團的同系物及類似物，但特別優選的連接基團是不含側鏈的直鏈亞烷基。符合後一描述的有機二醛的例子是戊二醛和丁-1，4-二醛。丁-1， 4- 二醛的來源之一是HISTOCHOICE ，美國俄亥俄州梭侖市安萊斯科公司(Amresco Inc.，Solon, Ohio, USA)的一種市售可得的組織固定劑，由其供應商鑑定，Camiener在 1995年7月4日授權的美國專利號5，429，797中公開。根據產品資料，除丁 _1，4_ 二醛外，HIST0CH0ICE的組分是乙二醛、氯化鈉和硫酸鋅。可用於實施本發明的另一組固定劑是二偶氮烷基脲、咪唑烷基脲、二羥甲基脲、二羥甲基-5，5-二甲基乙內醯脲、2-溴-2-硝基丙-1，3-二醇、季金剛石(quaternary adamantine)、4_羥甲基氮雜_3，7_ 二氧雜雙環 [3.3.0]辛烷和5-羥甲基-1-氮雜-3，7-二氧雜雙環[3.3.0]辛烷。該組中，優選二偶氮烷基脲和咪唑烷基脲。二偶氮烷基脲可購自美國內布拉斯加州拉維斯塔市斯特萊科實驗室公司(Streck Laboratories, Inc.，La Vista, Nebraska, USA)的斯特萊科組織固定劑 (Streck Tissue Fixative)，其中二偶氮烷基脲是主要活性成分，而2_溴_2_硝基丙_1， 3- 二醇、硫酸鋅和少量甲醛作為其它成分。儘管與現有技術相比，此種預處理RBC的條件通常是溫和的，但可在一定範圍內調節。當在室溫下或通常在約15°C-約25°C (59° F-77° F)的溫度範圍內作預處理，例如，固定劑濃度可以為約0. -約1.0% (重量/體積比，即克/mLX 100)，溫育時間可以是約0. 5小時-約4小時。相反，當在降低的溫度下，例如約2V -約8°C (36° F_44° F) 作預處理，固定劑濃度可以為約0. 05% -約0. 25% (重量/體積比)，溫育時間可以是約 16小時-約48小時。可以在一階段或多階段中進行固定劑處理。第一階段可以，例如包括在室溫或 15-25°C的中等溫度(15°C -25°C )以極低的固定劑濃度(例如0. 001 % -0. 25 % )短期 (0. 5小時-4小時)處理；而第二階段可包括處理的接觸時間和溫度相同但濃度較高，例如 0. 1% -1. 0%，或在降低的溫度-8°C )處理較長時間(16小時-48小時)。本領域技術人員明白其它加工方法。固定劑接觸後，可以通過，例如在約2°C -約8°C，沒有固定劑存在下在模擬血漿中溫育約7天-約30天來實現細胞的條件化，諸次處理之間可用常規洗滌溶液進行洗滌步驟和用常規血漿替代品進行穩定步驟。可用於實施本發明的紅細胞通常是哺乳動物無核紅細胞，例如人、牛、綿羊、山羊和非禽類家畜的紅細胞。優選人紅細胞。此外，在實施本發明中可預處理各種紅細胞。包括A型、Bl型和B2型。如上所述，對照品的其餘組分可以是血液學對照品的常規組分，包括白細胞組分和血小板組分。白細胞組分可以是固定的脊椎動物紅細胞或非生物學顆粒，例如聚苯乙烯、 聚乙烯甲苯或苯乙烯二乙烯基苯微珠。還可使用生物來源的微粒；例子有乳膠顆粒和植物花粉。Carver等的美國專利申請公布號US2002/0022269AK2002年2月21日公布)及其引用的參考文獻公開了其它材料。血小板組分可以是獲自山羊的縮小至人血液血小板大小的紅細胞，可將山羊紅細胞懸浮在鹽濃度連續增加的一系列水性高滲鹽溶液中直至獲得所需大小。合適的鹽溶液的例子是萘酚二磺酸二鹼金屬鹽，例如2-萘酚-6，8-二磺酸二鉀鹽和2-萘酚-3，6- 二磺酸二鈉鹽的溶液。本領域已知獲得血小板組分的其它鹽溶液和其它方法，這些溶液和方法也可用於本發明。用作對照品的懸浮介質的人工或模擬血漿可以是用於該目的的各種已知液體製品。合適的製品對於哺乳動物血液是等滲的，含有與天然血漿相同或相似的組分或具有與天然血漿相同或相似的功能。這些組分包括無機鹽、有機和無機緩衝液及維持穩態的粘性材料，例如哺乳動物白蛋白或合成的替代品，如聚乙二醇。通常還包含一種或多種抗生素，例如ftx)Clin P150、阿米卡星、慶大黴素、青黴素和四環素。可由商業供應商提供的合成血漿的例子是美國德拉瓦州威爾明頓市杜邦醫藥公司(DuPont Pharmaceuticals,Wilmington, Delaware, USA)的HESPAN 、杜邦醫藥公司的PENTASPAN 、美國新澤西州皮斯卡塔韋市法瑪西亞公司(Pharmacia，Inc.，Piscataway, New Jersey, USA)的 MACRODEX 、法瑪西亞公司的RHEOMACRODEX 和美國加利福尼亞州伯克利市
生物時代公司(BioTime，Inc.，Berkeley, California, USA)的HEXTEND 。模擬血漿通常是生理濃度的電解質水溶液加上大分子膨脹劑(macromolecular oncotic agent)和生物學緩衝液。除了用作血液學對照品的懸浮介質外，人工血漿還可用作在條件化後穩定細胞的懸浮介質。在一些情形中，根據考慮的具體血液學儀器選擇具體的人工血漿，因為人工血漿可能影響儀器製造技術的特定白細胞和血小板計數區中的顆粒存在。如上所述，本領域已知不同生產商的血液學儀器採用不同的血細胞計數技術。因此，血液樣品中存在的部分降解的紅細胞或紅細胞片段可出現(並被計數)在一些儀器的白細胞讀出區、血小板區或二者中，雖然在其它儀器中，這些部分降解的細胞和片段不出現在這些區域中。此外，正常或異常的新鮮紅細胞或儲存紅細胞的電阻率和/或光學特性可以是完整的紅細胞或降解的細胞(例如，紅細胞影和/或片段)可因儀器設計而表現不同。例如，利用阿伯特細胞-Dyne CD4000時，異常的新鮮紅細胞可存在於WBC計數區，因為該紅細胞耐受裂解劑。利用考特爾儀器，相同的異常紅細胞不會顯示或可能具有不同的特徵(signature)(顆粒分布)。對於本發明，可依據使用對照品的儀器是要顯示完整紅細胞的電學或光學特性的任何改變還是要顯示部分降解的細胞或細胞片段(例如紅細胞以外的血液組分)的電學或光學特性的任何改變，從而在不同條件下修飾紅細胞以作為對照品。因此，可以調節固定劑的接觸時間、溫度和濃度以實現所需的修飾程度從而避免在儀器讀出中錯誤表示細胞類型的分布，但仍能按照儀器的方案裂解紅細胞組分。有技術和有經驗的血液學家不難知道各種儀器的有關操作和差異的信息，這些信息有時由生產商提供， 不難據此選擇最佳條件。通過常規研究，用在檸檬酸鹽水中洗滌並懸浮在人工血漿中的標準紅細胞懸液運行儀器，觀察讀出結果以標出任何電學或光學修飾的完整細胞或部分降解的細胞及片段出現之處也不難確定這種信息。作為本發明示例，典型的紅細胞製備過程所需的組分如下所示通常在獻血點收集的包裝人紅細胞洗滌包裝人紅細胞的液體初步固定經洗滌的包裝人紅細胞的液體洗滌初步固定的細胞的液體懸浮經洗滌的初步固定細胞的液體任選的用於次級固定經洗滌的初步固定細胞的液體，和用於洗滌次級固定細胞的液體用於保存初步(或次級)洗滌的固定細胞的液體提供以下實施例只是出於說明目的，其中所有百分比依據重量/體積。
實施例以下實施例說明了用於商業血液對照品的A型紅細胞組分的製備，該產品在多種血液學技術平臺上均能提供均勻一致的紅細胞值。本實施例所用的方法獲得的對照品不會在非RBC區(即，白細胞和血小板分析區)中因散射顆粒而產生幹擾。本實施例採用拜爾(以前的泰克尼康公司(TechniconDHl-E儀器的示例性分布為用於拜爾5-組分儀器作了優化。該方法防止在下部血小板計數區中形成顆粒物，但在儀器類型之間仍能提供具有一致RBC參數的血液對照品的紅細胞組分。這對於拜爾儀器是重要的特徵，因為這些儀器採用獨特的方法來評估RBC容積、分布寬度和細胞血紅蛋白含量。該方法如下所示1.將獻血點包裝的RBC加入IL離心瓶，加入等滲的平衡檸檬酸洗滌溶液至(紅細胞)計數為 2 X IO6/μ L-4 X IO6/μ L，優選 3 X IO6/μ L。2.以2，000-4, 000RPM，優選3，000RPM離心10-30分鐘，優選20分鐘，吸棄上清液，
注入檸檬酸洗滌溶液至(紅細胞)計數為2 X IO6/μ L-4 X IO6/μ L，優選3 X IO6/μ L。3.重複檸檬酸洗滌步驟，用檸檬酸洗滌溶液重懸至(紅細胞)計數為2Χ IO6/ μ L-4 X IO6/μ L，優選 3 X IO6/μ L。4.將重懸的RBC傾倒入含有足夠戊二醛的第二個IL瓶中，至濃度等於戊二醛儲備液的1%。5.室溫下固定0. 5-4小時，優選2小時。6.如上所述用檸檬酸洗滌溶液洗滌。7.在人工血漿中重懸12-20小時，優選16小時。8.以2，000-4, 000RPM，優選3，000RPM離心10-30分鐘，優選20分鐘，吸棄上清液， 注入人工血漿溶液至紅細胞計數為2 X IO6/ μ L-5 X IO6/ μ L，優選2 X IO6/ μ L。 9. 2-8°C，以 1 X IO6/ μ L_3 X IO6/ μ L，優選 2 X IO6/ μ L 保存 7-30 天，優選 21 天使細胞條件化。10.吸棄上清液至最終血液對照品所需的RBC計數，其範圍依據目標值為約 0. 5-7 X IO6/ μ L0例如，1級可以是0. 5-4X IO6/ μ L，2級可以是2-5 X IO6/ μ L，3級可以是 3-7 X IO6/μ Lo11.加入固定的脊椎動物白細胞形式的白細胞組分(WBC)，固定的脊椎動物RBC形式和/或其它顆粒形式(如乳膠顆粒和花粉)的WBC類似物。12.加入血小板組分，例如用抗凝劑製備的天然哺乳動物血小板或從動物來源製備的血小板類似物。優選的血小板組分是動物來源的，例如Hunt在美國專利號US 4，179，398中公開的山羊紅細胞。13.按照生產具有正常和異常血液學狀態的血液對照品所需調節細胞計數和細胞大小。為進行比較，將戊二醛用作組織固定的固定劑的現有技術條件包括使組織與濃度約為的戊二醛接觸約M小時。將上述方法產生的對照品用於拜爾Hl-E和阿達維 (Advia) 120儀器，不會在下部血小板區形成顆粒。該對照品在阿伯特⑶4000上的光學血小板區產生月牙形顆粒分布，在⑶4000WBC散射圖中產生碎片。這在⑶4000中看導致WBC(白細胞)和RBC (紅細胞)系統誤差。用6種商業血液學儀器檢驗本實施例所用對照品的紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白 (HGB)和平均細胞容積(MCV)，還用相同的6種儀器檢驗新鮮血液樣品。新鮮血液的結果示於表I，對照品的結果示於表II。表 I
權利要求
1.一種血液對照品，其包含相對量已知的懸浮在模擬血漿中的紅細胞組分、白細胞組分和血小板組分，所述紅細胞組分由Bl型哺乳動物無核紅細胞構成，而該哺乳動物無核紅細胞已通過在2°C-8°C的溫度下用0.05%-2. 5% (重量/體積)固定劑濃度的丁 _1，4-二醛溫育16小時-48小時作了預處理從而交聯所述紅細胞同時將可裂解的所述紅細胞留在血液學儀器中。
2.如權利要求1所述的血液對照品，其特徵在於，與所述固定劑進行所述溫育後，所述哺乳動物無核紅細胞在沒有固定劑存在下，在2°C _8°C通過在模擬血漿中溫育7天-30天作進一步預處理。
3.一種血液對照品，其包含相對量已知的懸浮在模擬血漿中的紅細胞組分、白細胞組分和血小板組分，所述紅細胞組分由B2型哺乳動物無核紅細胞構成，而該哺乳動物無核紅細胞已通過在15°C _25°C的溫度下用0. 001% -0. 25% (重量/體積)濃度的戊二醛溫育 0. 5小時-4小時，然後在2V -8°C的溫度下用0. 05% -2. 5% (重量/體積)濃度的丁 -1， 4- 二醛溫育16小時-48小時作了預處理從而交聯所述紅細胞同時將可裂解的所述紅細胞留在血液學儀器中。
4.如權利要求3所述的血液對照品，其特徵在於，所述血液對照品不含裂解促進劑。
5.如權利要求3所述的血液對照品，其特徵在於，與所述固定劑進行所述溫育後，所述哺乳動物無核紅細胞在沒有固定劑存在下，在2°C _8°C通過在模擬血漿中溫育7天-30天作進一步預處理。
全文摘要
處理脊椎動物的紅細胞使之成為血液學對照品的有效組分，該對照品可用於檢測所有血細胞組分，包括白細胞和血小板。該處理包括在濃度和接觸時間有限的條件下利用固定劑，得到的紅細胞穩定但可在血液學儀器中裂解且形成顆粒的傾向性降低。
文檔編號G01N33/96GK102213725SQ20111011806
公開日2011年10月12日 申請日期2007年7月16日 優先權日2006年7月17日
發明者F·J·卡弗, L·格拉尼耶 申請人:生物輻射實驗室股份有限公司