新穎類單醣的甘胺酸化糖醇組成物在設計與開發抗糖尿病藥物上的使用方法與流程

2023-10-09 23:26:59 2

林希龍(亞凱迪亞，加州)，林羿秀(亞凱迪亞，加州)，林怡彣(爾灣，加州)，以及張欽次(喜瑞都，加州)。

優先權：

本發明要求以2014年1月26日提交的申請號為61/931,650，標題為「用於體外及生物體內遞送核酸系藥物的糖醇系複合物的組成及配方」的美國臨時申請案為其優先權。本發明還要求以2014年9月13日提交的申請號為62/050,107，標題為「用於糖尿病治療的新穎類單醣的甘胺酸化糖醇組成物」的美國臨時申請案為其優先權。本發明還要求以2014年8月12日提交的申請號為14/457,829，標題為「用於生物體內及體外遞送核酸系藥物的新穎糖醇系組成物」的美國申請案為其優先權。本發明還要求以2014年9月25日提交的申請號為62/054,981，標題為「用於糖尿病治療的新穎類單醣的甘胺酸化糖醇組成物」的美國申請案為其優先權。

技術領域

本發明是關於一種新穎似糖的化學組成物以及其在糖尿病治療上的使用方法。具體而言，本發明教示以類單醣的經修飾的糖醇組成物取代病患吸收的糖類的使用方法，並由以處理糖尿病。該些新穎糖醇組成物透過一稱「甘胺酸化」的反應修飾為甘胺酸化糖醇以模擬單醣。因此，本發明提供以該些甘胺酸化糖醇降低人類腸內的糖攝取的新穎使用方法，並因此預防糖尿病患者於餐後發生的高血糖症狀。此外，本發明首次教示似糖醇及糖的化學化合物可經甘胺酸化修飾，由以降低其在糖尿病患者體內的病理效應。因此，本發明不僅包含一新穎似糖的化學組成物及其在治療糖尿病上的使用方法，並包含透過甘胺酸化生產此新穎組成物的最佳步驟與方法學。

背景技術：

第一型糖尿病(Diabetes mellitus(DM))，又稱diabetes，為一類代謝疾病，其在人類以及其他哺乳類例如小鼠身上發生長期高血糖症狀。此高血糖症狀包含高血糖水平(即＞140mg/dL)、頻尿、易口渴及飢餓，以及更嚴重者為酮酸中毒(diabetic ketoacidosis)及高滲壓昏迷(hyperosmolar coma)。長期高血糖症狀常導致心臟疾病、中風、腎衰竭、四肢潰瘍、眼損傷以及肥胖症。糖尿病有兩種類型：第一型糖尿病(type-I DM)起因於胰腺不足量胰島素的生產(或稱胰島素依賴性糖尿病(IDDM))，以及第二型糖尿病(type-II DM)起因於身體無法對胰島素產生反應(或稱胰島素阻抗；非胰島素依賴性糖尿病；NIDDM)。在治療上，第一型糖尿病(type-I DM)透過胰島素注射來處理；第二型糖尿病(type-II DM)不一定透過胰島素處理，而是再依據胰島素阻抗的病理原因。

目前針對第二型糖尿病的藥物治療可分為五類：第一類藥物可提增胰腺的胰島素產生，例如磺醯尿素類(Sulfonylureas)、美格替耐(Meglitinides)以及Stitagliptin；第二類藥物降低肝臟的糖生成，例如為Metformin；第三類藥物增加經由尿液的糖分排洩，例如為Canagliflozin；第四類藥物降低脂肪組織以及肌肉中的胰島素阻抗，例如為噻唑烷二酮類(Thiazolidinediones)；最後一類藥物延遲及/或降低腸內的糖吸收，例如為α-葡萄糖苷酶抑制劑(alpha-glucosidase inhibitors)。然而，由於這些藥物針對某些天然代謝路徑的動力學性質，其常常呈現不同程度的副作用包含低血糖(磺醯尿素類、美格替耐、Stitagliptin以及α-葡萄糖苷酶抑制劑)、腎衰竭(Metformin以及Canagliflozin)、心臟衰竭(Metformin以及噻唑烷二酮類)、腸胃道問題(Metformin以及α-葡萄糖苷酶抑制劑)、以及水腫與貧血(噻唑烷二酮類)。在某些較為糟糕的情況下，甚至有死亡的報導出現。

處理第二型糖尿病並預防腎衰竭以及心臟衰竭等致命問題最好的方式為延遲及降低腸內糖的吸收；然而，在不失去能量提供的條件下。目前例如α-葡萄糖苷酶抑制劑此類的抗糖尿病藥物，具有抑制腸內將碳水化合物轉換為單醣的酵素的功能，並因此阻礙腸內的糖吸收。然而，未經消化的碳水化合物可能與結腸細菌反應，並引發腸胃道方面的問題如脹氣以及腹瀉。就好的一方面來說，此副作用有助於減少肥胖，然而，阻斷糖的吸收也意謂身體失去能量的供應。因此，α-葡萄糖苷酶抑制劑過量可以導致糖尿病患者的急性低血糖。

近來，糖類及糖類代替物如人工甜味劑惡化糖尿病患者的糖不耐受性的情況已受到進一步注意(Suez et al.,(2014)Nature in press,doi:10.1038/nature13793)。

總而言之，目前在處理第二型糖尿病方面尚無安全的藥劑/物或糖類代替物，其同時能維持正常的身體能量供應。因此，有需要發展一新穎抗糖尿病組成物，其不但能減低腸內糖的吸收，並提供身體另一能量來源。

技術實現要素：

幹細胞如同藏寶盒，含有各種有效成分可用於設計及開發美容、藥學以及治療性藥物及/或應用。所述藥物及/或應用包含但不限於引發及增進生物體細胞/組織/器官再生、修復/癒合受傷組織與器官、更生老化細胞/組織/器官、處理退化性疾病(即癌症、糖尿病、骨質疏鬆、帕金森氏症與阿茲海默症……等等)，以及避免腫瘤/癌症發生、發展及/或轉移。基於這些潛質，發明人於2008上半年開發一生產以微型核糖核酸誘發的多能性幹細胞(iPSCs)的新穎技術(Lin等人，2008，2010及2011)且成功使用該iPSCs作為篩選、鑑定、分離以及生產潛在可用於臨床測試及使用的藥物原料(Chen與Lin，(2013)Recent Patents on Regenerative Medicine 3,5-16)。

糖醇(sugar alcohols)為一種衍生自糖的多元醇(polyol alcohols,polyhydric alcohol,polyalcohol,glycitol)的通類；糖醇在iPSCs的早期也發現有大量甘胺酸化的發生。依據化學上對於聚合物的定義，多元醇(polyol)為具有數個活性的可參與有機反應的氫氧基的化合物，其中聚合的多元醇(polymeric polyols)常具有聚醚或聚酯的態樣。大部分的糖醇為白色、水溶性的自然發生的物質，且常用於美容、藥學以及食品工業，作為保溼劑、增稠劑以及甜味劑。糖醇一般以化學式H(HCHO)n+1H表示，其化學式異於糖的H(HCHO)nHCO。再者，糖醇不像糖，後者傾向形成環狀結構。然而，糖醇能夠經脫水形成環狀醚，例如山梨糖醇經脫水形成異山梨酯(isosorbide)。糖醇具有不同的鏈長且鏈的每一碳分子連接有一氫氧基(OH)。糖醇進一步因其氫氧基的相對方位(立體化學)而有分別；舉例來說，甘露糖醇和山梨糖醇為異構物，享有相同的化學式C6H8(OH)6，但第二碳原子(C2)上的氫氧基的方位相異。屬於常見類型的糖醇包含但不限於醛醣醇(alditol)、阿拉伯糖醇(arabitol)、赤藻糖醇(丁四醇)(erythritol)、海藻糖醇(fucitol)、半乳糖醇(galactitol)、甘油(丙三醇)(glycerol,glycerin)、艾杜糖醇(iditol)、肌醇(inositol)、異麥芽酮糖醇(巴糖醇)(isomalt)、乳糖醇(lactitol)、麥芽糖醇(maltitol)、甘露糖醇(mannitol)、聚葡糖醇(氫化葡萄糖)(polyglycitol)、山梨糖醇(sorbitol)、蘇糖醇(threitol)、庚七醇(volemitol)，以及木糖醇(xylitol)。

糖醇可分為三類：單甘胺醯甘油(monoglycylated glycerol,MGG)、雙甘胺醯甘油(diglycylated glycerin,DGG)，以及三甘胺醯甘油酯(triglycylated glyceride,TGG)。使用高效能液相層析法，吾人可分離出並收集純的MGG及部分混合的DGG與TGG(圖1)。進一步的立體化學分析顯示MGG的結構類似單醣類如葡萄糖、果糖，以及半乳糖；DGG與TGG的結構則與雙醣類相似。由於結構上的相似，MGG或許可取代單醣而幹擾以及減低糖尿病患者的糖吸收。

本發明最先識別及揭示此新穎的似糖(sugar-like)的甘胺酸化糖醇化合物可用於處理糖尿病。進一步而言，本發明的目的在於提供甘胺酸化糖或甘胺酸化糖醇組成物在治療糖尿病的高血糖症狀和肥胖症的問題上的使用方法；該方法包含投予一含有甘胺酸化糖或甘胺酸化糖醇的組成物，其中該甘胺酸化糖或甘胺酸化糖醇來自經甘胺酸化反應修飾的至少一糖醇或至少一糖；其中該至少一糖醇具有H(HCHO)n+1H的化學式，而該至少一糖具有H(HCHO)nHCO的化學式。

本發明提供一種組成物，用於開發糖尿病的高血糖症狀和肥胖症的治療。該組成物包含一甘胺酸化糖或一甘胺酸化糖醇，其中該甘胺酸化糖或甘胺酸化糖醇來自經甘胺酸化反應修飾的至少一糖醇或至少一糖；其中該糖醇具有H(HCHO)n+1H的化學式，而該糖具有H(HCHO)nHCO的化學式。

附圖說明

圖示及實施例的特別參照僅作為說明的用途但不為限制。

圖1示意以高效能液相層析法分離DGG/TGG與MGG；

圖2A示意中度脫水的甘胺酸化的化學反應及其所生成的單甘胺酸化糖醇(單甘胺醯糖醇)(monoglycylated sugar alcohols MGG)，其中該單甘胺酸化糖醇包含1-單甘胺醯甘油、3-單甘胺醯甘油，以及2-單甘胺醯甘油。單甘胺醯甘油的化學式依pH狀態為NH2CH2CO(HCHO)3H或NH3+CH2CO(HCHO)3H。

圖2B與2C示意高度脫水的甘胺酸化及所生成的雙甘胺酸化糖醇(DGG)及三甘胺酸化糖醇(TGG)。以甘油(丙三醇)的甘胺酸化為例，會有兩種高甘胺酸化產物：其一為雙甘胺醯甘油(2B；DGG)，另一為1,2,3-三甘胺醯甘油酯(2C；TGG)。

圖3示意甘胺酸化糖醇如MGG在細胞內的代謝的概念圖。舉例來說，由於結構上的相似性，MGG透過GLUT2-介導的攜帶式輸送或胞飲作用吸收。由細胞攝取後，MGG經由類似於糖解作用的機轉處理為丙酮酸；丙酮酸在其他重要的生物代謝例如克式循環(Krebs cycle)及糖質新生上有作用。

圖4示意含有甘胺酸化糖醇的抗糖尿病藥物在患糖尿病小鼠的高血糖症狀上的生物體內治療效果。(小鼠：雄性，8周大C57BL/6J，共6隻)

圖5示意甘胺酸化糖醇在具有飲食所致肥胖症的小鼠身上在體重變化上的效果。(小鼠：雄性，8周大C57BL/6J，共6隻)

具體實施方式

圖2A-2C所示為一新穎化學反應-糖醇的甘胺酸化；經由該化學反應生產MGG、DGG以及TGG的。先前僅觀察到胺基酸間甘胺酸化的發生，然未曾於糖醇或糖當中發現此一反應。如此處所作的定義，甘胺酸化(甘胺醯化)為糖醇或糖的氫氧基(HO-)由甘胺酸的甘胺醯基(NH2CH2COO-或NH3+CH2COO-)取代的一化學反應；此反應且在該糖/糖醇的氫氧基移掉的碳原子與該甘胺醯基(glycyl group)之間形成醚鍵(R-O-R)。此反應包含脫水發生的縮合反應。在以甘油(丙三醇)為糖醇的甘胺酸化當中，將有三種甘胺酸化產物：其一為1-、2-、或3-單甘胺醯甘油(MGG；圖2A)，另一為1,2-、或2,3-、或1,3,-雙甘胺醯甘油(DGG；圖2B)，以及最後1,2,3-三甘胺醯甘油酯(TGG；圖2C)。在此例中，甘胺酸化可為部分或完全反應；舉例來說，MGG及DGG為部分甘胺酸化的產物，而TGG為完全甘胺酸化的產物。由於MGG、DGG以及TGG在酸性條件下如腸胃道系統(GI)內帶負電，因此對於吸收糖進入細胞的葡萄糖轉運子(GLTU)具有高親和力。因此，MGG/DGG/TGG與GLUT的結合防止糖通過GLUT吸收進入體內，特別是GI系統內。同樣的，相似於糖醇，單糖等包含葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖以及乳糖也得以經甘胺酸化修飾，而用於降低糖尿病患者的糖攝取。

如同天然的糖，該些甘胺酸化糖醇能經由葡萄糖轉運子(GLUT)及/或GLUT調控的內吞作用吸收進入人類細胞。舉例來說，圖3表示在人類肝細胞HepG2中，大部分MGG經由GLUT2[又稱溶質載體家族2(促葡萄糖轉運子)成員2(SLC2A2)]，透過蛋白質構形變化以及轉運機制所吸收。然而，一些MGG以及大部分的DGG以及TGG與GLUT2因高親和力結合，因此阻礙糖流入需要的構形變化。在其他途徑中，細胞活化另一內吞機制，隨著GLUT2與MGG/DGG/TGG的結合攝入GLUT2，導致細胞表面上GLUT2的減少以及降低腸胃道(GI)細胞的糖吸收。

細胞內甘胺酸化糖醇詳細的代謝「甘胺醯甘油解(glycylglycerolysis)」表示於圖3。在吸收進到細胞內後，甘胺酸化的糖醇例如MGG將首先經處理為二羥丙酮磷酸鹽(dihydroxyacetone phosphate(DHAP))，接著變成其異構體D-甘油醛-3-磷酸(D-glyceraldehyde-3-phosphate(GADP))。之後，甘油醛磷酸脫氫酶(GADPH)將GADP轉變為D-1,3-雙磷酸甘油酸(D-1,3-bisphosphoglycerade(1,3-BGP))，後者接著由磷酸甘油酸激酶(PGK)催化為3-磷酸甘油酸(3-PG)，再經磷酸甘油酸變位酶(PGM)轉變為2-磷酸甘油酸(2-PG)，接著再由烯醇酶轉變為磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。最後，在PEP經由一激酶(PK)轉換為丙酮酸後，終產物：丙酮酸最後能由細胞利用來產生能量(透過克氏循環或檸檬酸循環)，生產糖(透過糖質新生)，並且參與其他細胞代謝。因此，該些甘胺酸化糖醇不僅能降低糖尿病患者血中糖的水平，並可作為另一能量來源，由以預防常見於過量抗糖尿病藥物如α-葡萄糖苷酶抑制劑的急性低血糖症。

由於甘胺酸化糖醇透過降低人類腸胃系統內的糖吸收來發揮功能，以口服方式投予為遞送此類藥物的最佳方法。此外，生產甘胺酸化糖醇的原料為糖醇及甘胺酸，一方面兩者為膳食來源，且此類藥物經過測試，顯示在小鼠(四十分之一的身體重)體內劑量達1克時沒有毒性或低血糖的徵象。然而在高劑量(＞0.65克/每隻小鼠)組別，當中15％～20％的小鼠可在餐後觀察到輕度至中度的腹瀉。為進一步測試其在處理糖尿病及肥胖症上的藥效，發明人在餐前餵食每隻飲食所致糖尿病C57BL/6J小鼠(n＝3)1毫升的1毫克純化的MGG；此外，另以1毫升雙蒸水餵食控制組C57BL/6J小鼠(n＝3)。在投予藥物後，每隻小鼠每餐餵食混合有4毫克葡萄糖及2克Kaytee小鼠飼料的高碳水化合物餐食。接著，於餐後0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5及4小時，以Bayer Contour Next USB系統測全血糖水平。在全長4小時的測量期間停止水的攝取。

圖4示意血糖水平的變化結果。以MGG處理的小鼠，血中葡萄糖經測量在餐後0小時為85、91、77mg/dL(平均值84.3±7.0mg/dL)；在餐後0.5小時為135、147、121mg/dL(平均值134.3±13.0mg/dL)；在餐後1小時為157、151、147mg/dL(平均值151.7±5.5mg/dL)；在餐後1.5小時為155、131、158mg/dL(平均值148±13.4mg/dL)；在餐後2小時為129、137、133mg/dL(平均值133±4.0mg/dL)；在餐後2.5小時為97、121、101mg/dL(平均值106.3±12.0mg/dL)；在餐後3小時為91、89、88mg/dL(平均值89.3±1.5mg/dL)；在餐後3.5小時為93、85、83mg/dL(平均值87±5.0mg/dL)以及餐後4小時的88、93、85mg/dL(平均值88.7±4.0mg/dL)。基於所測得的數據可相比於從常人身上測得的數據，發明人推論出以甘胺酸化糖醇如MGG處理，顯然可以在患糖尿病的個體攝取高碳水化合物的餐食後，維持個體接近/似正常的血糖水平。另一方面，未處理的控制組小鼠，血中葡萄糖經測量在餐後0小時為73、79、88毫克/公合(平均值80±7.5毫克/公合)；在餐後0.5小時為255、167、315毫克/公合(平均值245.7±74.0毫克/公合)；在餐後1小時為375、267、415毫克/公合(平均值345.7±74.0毫克/公合)；在餐後1.5小時為315、281、379毫克/公合(平均值325±49.0毫克/公合)；在餐後2小時為295、285、311毫克/公合(平均值297±13.0毫克/公合)；在餐後2.5小時為264、284、315毫克/公合(平均值287.7±25.5毫克/公合)；在餐後3小時為171、222、299毫克/公合(平均值230.7±64.0毫克/公合)；在餐後3.5小時為157、199、285毫克/公合(平均值213.7±64.0毫克/公合)以及餐後4小時的143、166、213毫克/公合(平均值173.7±35.0毫克/公合)。發明人進一步比較從經MGG處理的小鼠獲得的數據與從未經處理小鼠身上獲得的數據，發現以甘胺酸化糖醇處理得以顯著降低葡萄糖吸收以及血糖值，因此成功地防止患糖尿病的動物身上的高血糖症狀。

此外，在MGG處理的小鼠身上亦觀察到體重損失；相較之下，控制組沒有體重的損失。如圖5所示，糖尿病C57BL/6J小鼠(n＝3)在每餐(每日三次高碳水化合物餐食)前以1毫克MGG處理(溶於1毫升雙蒸水)約一個月，之後，在小鼠身上觀察到約16％～30％(平均值23％)體重的損失；相較之下，僅以1毫升雙蒸水處理的控制組小鼠(n＝3)獲得平均超過49％的體重。此結果明顯指出甘胺酸化糖醇對生物體另一潛在的在治療肥胖症上的用途，特別是與糖尿病相關的肥胖症的用途。

基於上述實驗結果，發明人證實本發明的新穎甘胺酸化糖醇組成物不僅能用於治療糖尿病的高血糖症狀以及肥胖症的問題，亦可預防常見於其他抗糖尿病藥物的低血糖風險。因此，此透過與單醣類競爭而阻礙或減少腸胃道系統內糖攝取的新藥可為糖尿病患者帶來一更安全以及更有效的治療。值得注意的是，由於所有用於製造甘胺酸化糖醇組成物的原料全然沒有毒性且根據食品與藥物管理局(FDA)的規定，是安全的，此新穎抗糖尿病藥物亦能作為膳食補充品，用於糖尿病患者的每日照護。

A.定義

為增進對本發明的了解，將數個名詞定義如下：

處理的細胞：單一或多個人類或動物細胞，選自由體細胞、組織細胞、幹細胞、生殖腺細胞、腫瘤細胞、癌細胞及其組合組成的群。

甘胺酸化(甘胺醯化)：一化學反應，其中糖醇或糖的氫氧基(-OH)由甘胺酸或甘胺醯胺基酸的甘胺醯基(NH2CH2COO-或NH3+CH2COO-)取代，且在該糖醇/糖的移掉氫氧基的碳原子與該甘胺酸及/或甘胺醯胺基酸的甘胺醯基(glycyl group)之間形成醚鍵(R-O-R)。

藥學及治療上的應用：生物醫學方面的使用，用於診斷的處理方法、裝置及/或設備，幹細胞產生，幹細胞研究及/或治療開發，組織/器官修復及/或再生，傷口癒合處理，腫瘤抑制，癌症治療及/或預防，疾病處理，糖尿病與肥胖處理，藥物生產，及以上的組合。

原核細胞：一單細胞生物，該單細胞生物缺乏明顯膜包圍(membrane-bound)的細胞核，且其遺傳物質以DNA的連續鏈(continuous strand)的形式存在；該單細胞生物例如為細菌、古細菌。

真核生物或真核細胞：一單細胞或多細胞生物，該單細胞或多細胞生物的細胞含有有膜包圍的細胞核及其他構造(胞器)；該單細胞或多細胞生物例如為酵母菌、植物、動物。

B.組成物及應用

本發明揭露一新穎的甘胺酸化糖醇組成物及其在治療糖尿病的高血糖症狀和肥胖症的問題上的使用方法，其中該甘胺酸化糖醇組成物含有經甘胺酸化反應修飾的至少一糖醇或至少一糖。

此外，本發明亦教示一新穎甘胺酸化的方法及其在製造帶正電糖醇與糖的化合物上的使用方法，其中該帶正電糖醇與糖的化合物能透過靜電親合力(electrostatic affinity)及/或結構相似性(structural similarity)幹擾帶負電的物質如細胞表面受器及穿膜轉運子。

本發明所揭露的甘胺酸化糖醇/糖組成物、以及糖醇與糖的甘胺酸化反應首次於本申請案所主張美國優先權案(申請號14/457,829，申請日2014年8月12日，發明名稱「用於生物體內及體外遞送核酸系藥物的新穎糖醇系組成物」)。進一步來說，此甘胺酸化糖醇及/或糖在治療糖尿病以及肥胖症上的使用方法全然新穎且先前未曾報導過的。此外，於本發明中首次揭露的關於甘胺酸化糖醇的代謝，有助開發治療相關代謝疾病例如糖尿病與肥胖症的醫藥及/或膳食補充品。

實施例

在以下的實驗揭露中，所用的簡稱如下：M(莫耳，molar)；mM(毫莫耳，millimolar)；μm(微莫耳，micromolar)；mol(摩耳，moles)；pmol(微微摩耳，picomole)；gm(公克，grams)；mg(毫克，milligrams)；μg(微克，micrograms)；ng(毫微克，nanograms)；L(公升，liters)；ml(毫升，milliliters)；μl(微升，microliters)；℃(攝氏度，degrees Centigrade)；RNA(核糖核酸，ribonucleic acid)；DNA(去氧核糖核酸，deoxyribonucleic acid)；dNTP(去氧核糖核苷三磷酸，deoxyribonucleotide triphosphate)；PBS(磷酸鹽緩衝液，phosphate buffered saline)；NaCl(氯化鈉，sodium chloride)；HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸，N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid)；HBS(HEPES緩衝液，HEPES buffered saline)；SDS(十二烷基硫酸鈉，sodium dodecylsulfate)；Tris-HCl(三羥甲基胺基甲烷-氯化氫，tris-hydroxymethylaminomethane-hydrochloride)；ATCC(美國菌種保存中心，American Type Culture Collection，Rockville，MD)；hESC(人類胚胎幹細胞，human embryonic stem cells)；以及iPSC(誘髮型多能性幹細胞，induced pluripotent stem cells)。

1.甘胺酸化糖醇組成物的製造

雖然糖/糖醇的甘胺酸化的天然機制尚未清楚，但發明人已開發人工生成甘胺酸化糖醇及甘胺酸化糖的化學步驟與方法。首先，準備一含有1.0M濃度甘油或果糖，以及0.9％(w/v)氫氧化鈉的雙蒸水溶液。接著，將甘胺酸加入到該溶液中以及混合；甘胺酸並於該溶液達到0.05～0.3M(這部分並依據想達到的最終甘胺酸化糖醇/糖濃度調整)的最終濃度。經過在4℃、持續攪動下隔夜保存，將加入有甘胺酸的溶液加熱至高於45℃，且較佳大於94℃，直到所含水分近完全蒸發。此乾式脫水(dry-style dehydration)步驟通常產生約35％的MGG，以及約65％的DGG/TGG。在使用前，可透過加入預期體積的滅菌雙蒸水，溶解該幹反應的產物，以及調整該甘胺酸化糖醇的最終濃度。另一方面，為了提升MGG的生產率，發明人進一步設計一使用高壓滅菌器的溼式脫水步驟；其中，與前述相異，在混合甘胺酸以及甘油與氫氧化鈉溶液後，將此混合物放置於高壓滅菌器，並以大約121℃以及100kPa進行一乾式滅菌循環。在滅菌周期結束後，反應物將含有大約78％的MGG以及約22％的DGG/TGG。在使用前，可透過加入預期體積的滅菌雙蒸水調整該甘胺酸化糖醇的最終濃度。MGG、DGG以及TGG的化學結構表示於圖2A～2C。

2.人類細胞處理以及培養

來自ATCC的人類肝細胞株HepG2，依據廠商的建議，培養於37℃以及5％CO2的環境。

3.高效液相層析法(HPLC)分析

依據MGG與DGG及TGG之間電荷的不同，本發明採用逆向HPLC(reverse-phase HPLC)法將MGG自DGG與TGG分離。其中使用Ultimate 3000高效液相層析(HPLC)儀(Thermo Scientific)以及DNA Pac PA-100管柱(BioLC Semi-Prep 9x250mm)，並以3.6毫升/分鐘的流速進行。起始緩衝液(starting buffer)為50mM的Tris-HCl(pH 7.6)，移動緩衝液(mobile buffer)為50mM的Tris-HCl(pH 7.6)以及500mM過氯酸鈉。以UV偵測儀於260nm的波長量測帶不同電荷的甘胺酸化糖醇的訊號。結果表示於圖1。

4.以甘胺酸化糖醇處理的糖尿病小鼠的活體評估

為測試MGG在治療糖尿病上的藥效，發明人以1毫克純化的MGG，1毫升，在餐前分別處理每隻飲食所致糖尿病C57BL/6J小鼠(雄性，8周大，n＝3)。控制組C57BL/6J小鼠(雄性，8周大，n＝3)餵食1毫升雙蒸水。在投予藥物後，每隻小鼠每餐餵食混合有4毫克葡萄糖及2克Kaytee小鼠飼料的高碳水化合物餐食。接著，於餐後0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5及4小時，以Bayer Contour Next USB系統測全血糖水平。在處理前4小時以及餐後4小時期間停止提供水及食物。然而，在每餐之間，每隻小鼠各再給予2毫升雙蒸水。結果示於圖4。

5.以甘胺酸化糖醇處理的肥胖症小鼠的活體評估

為測試MGG在治療肥胖症上的藥效，發明人以1毫克純化的MGG，1毫升，分別在餐前處理每隻飲食所致糖尿病C57BL/6J小鼠(雄性，8周大，n＝3)。控制組C57BL/6J小鼠(雄性，8周大，n＝3)餵食1毫升雙蒸水。在投予藥物後，每隻小鼠每餐餵食混合有4毫克葡萄糖及2克Kaytee小鼠飼料的高碳水化合物餐食。在大約1個月的期間內，每隻小鼠每日處理及餵食三次。雙蒸水無限提供。結果示於圖5。

6.統計分析

任何超過10％的訊號強度變化即被視為一陽性結果，該等結果被分析後以平均值±標準差(mean±SE)表示。資料的統計分析是以單因子變異數分析(one-way ANOVA)來計算。當主要效應顯著時，使用杜納的事後比較(Dunnett’s post-hoc test)來鑑別與控制組有顯著差異的群。在兩處理組之間進行配對比較時，使用雙尾司徒頓t檢驗(two-tailed student t test)。對於包含超過兩處理組的實驗，則在ANOVA後進行一事後多變域測驗(post-hoc multiple range test)。機率值p<0.05被認為是具有統計上的意義。所有p值由雙尾檢定來決定。

文獻

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