一種發酵乳飲料製造方法及其所應用的乾酪乳桿菌的製作方法

2023-06-11 22:38:06 2

專利名稱：一種發酵乳飲料製造方法及其所應用的乾酪乳桿菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種發酵乳飲料製造方法及其所應用的乾酪乳桿菌。
背景技術：
目前一般採用的發酵乳飲料的製作方法是將乳酸菌接種到牛奶或其他獸乳或植物乳中進行培養，在培養物中添加適量的甜味料、香料和果汁，然後再經過稀釋和均質處理後製得，其中有活菌型和培養後進行殺菌的滅菌型乳酸菌飲料兩種，目前活性乳酸菌乳飲料商品中所使用的菌株均以一般益生菌所固有的改善腸內菌群和提高免疫力為主，但是這種乳飲料存在的缺點是(I)對於牛奶蛋白過敏者無法使用，(2)且由於生產活性乳酸菌乳飲品需要很高的無菌操作技術，致使大部分國內企業還停留在生產非活性產品的地步。目前在活性乳酸菌乳飲料商品中，主要是以單一菌株或以數株乳桿菌發酵為主，還未見同時使用乳桿菌和雙歧桿菌進行發酵的產品。目前的活性乳酸菌乳飲料中均以一般益生菌所固有的改善腸內菌群和提高免疫力為主要健康訴求點，還未見尤其是對牛奶蛋白過敏兒童也可以放心飲用的商品。另外活性乳酸菌乳飲料中均以砂糖為主要糖份原料，含熱量高。目前國內市場上銷售的活性乳酸菌乳飲料商品中活菌含量太低，再加上含乳飲料國家標準設定的下限值較低，一般均在IO5個/毫升以下。(I)至今在酸奶等乳製品和乳飲料中一般均使用保加利亞菌和嗜熱鏈球菌，但該菌株不耐受胃酸和膽汁酸而不能活著到達腸道，因此也就起不到有效作用。(2)目前生產廠家所使用菌株的功能性，均以一般益生菌所固有的改善腸內菌群和提高免疫力為主要健康聲稱。在國內還未見降低牛奶蛋白抗原性的菌株。由於生產發酵型乳酸菌乳飲料需要很高的無菌操作技術，致使大部分國內企業還停留在生產發酵後滅菌型(非活性)產品的地步。一般降低了熱量的 產品其口感上很難達到消費者的要求。由於發酵工藝的差異，目前對發酵乳飲料在保質期內很難保持IO6個/毫升以上活菌數量級。

發明內容
本發明提供了一種發酵乳飲料製造方法及其所應用的乾酪乳桿菌，它不但可以存活狀態到達小腸，這樣可以改善腸內菌群和提高免疫力的功效，能夠降解牛奶中抗原性以及蛋白質的抗原性，減少牛奶中容易引起過敏性抗原蛋白質含量。本發明採用了以下技術方案一種乾酪乳桿菌Lactobacillus caseiJY68,其保藏號為 CGMCC No :3567。本發明還公開了一種發酵乳飲料製造方法，它包括以下步驟步驟一，準備乾酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養液和雙歧桿菌的菌株培養液進行活化，將活化後的乾酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養液和雙歧桿菌的菌株培養液分別接種到滅菌後的質量濃度為10-20% w/v的脫脂奶粉中進行培養；步驟二，製備原料乳在質量濃度為10-20% w/v的脫脂乳粉中添加質量濃度為2-4% w/v葡萄糖進行攪拌形成原料乳，然後對原料乳進行殺菌冷卻；步驟三，將乾酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養液添加到殺菌後的原料乳中進行培養，培養後的細菌、酵母和黴菌為零，大腸菌群為陰性；步驟四，製備調配液將發酵後的原料乳和無菌水按照1:1的比例混合加入
0.2-0. 4% w/v的食品香料中，攪拌均勻製備成調配液；步驟五，將步驟三中培養後的原料乳和步驟四中的調配液與乾酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養液進行混合攪拌後製得發酵乳製品，然後將成品進行冷藏保存。步驟一中的Lactobacillus casei JY68的菌株培養液包含有乾酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68 或包含有幹釀乳桿菌 Lactobacillus caseiJY68、嗜熱鏈球菌 Streptococcus thermophilus 和保加利亞乳桿菌 Lactobacillus bulgaricus,步驟一種的雙歧桿菌的菌株培養液為短雙歧桿菌Bifidobacterium breve、長雙歧桿菌Bifidobacterium Iongum或者短雙歧桿菌Bifidobacterium breve和長雙歧桿菌Bifidobacterium Iongum的混合,脫脂奶粉含22-30% w/v的葡萄糖,步驟一種乾酪乳桿菌Lactobacillus caseiJY68的菌株培養液接種到脫脂奶粉中培養的溫度在37°C，培養的時間為24-48小時，雙歧桿菌的菌株培養液接種到脫脂奶粉中培養的溫度在24°C，培養的時間為24-48小時。步驟三中培養的溫度為35-37°C，培養的時間為7天。步驟五中冷藏保存的溫度為2-7 °C。本發明具有以下有益效果本發明的發酵乳製品中含有乾酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68和短雙歧桿菌,幹釀乳桿菌LactobaciIIus casei JY68不但可以存活狀態到達小腸，這樣可以改善腸內菌群和提高免疫力的功效，而且可以具有高耐酸性，強繁殖性，並且能夠降解牛奶中抗原性以及蛋白質的抗原性，減少牛奶中容易引起過敏性抗原蛋白質含量，另外熱量降低一半，保持爽口不膩的口感，滿足了糖尿病患者或渴望低熱量食品的消費者的需求 ，在保質期內的活菌數能維持在108CFU/毫升以上，大大高於現在市場上的商品含量。為使益生菌在保質期內能保持活菌數在108CFU/毫升以上的高數量級並且能以存活狀態到達腸內，本發明中採用三段式發酵技術，其中大型發酵時間也從168小時發酵。同時在生產線上設定多個關鍵控制點，生產前後都對每個關鍵控制點進行細緻的人工洗淨和酸鹼殺菌，使用高度的無菌操作技術進而預防了二次汙染的發生。該專利產品屬於低熱量商品，使用甘素等零熱量糖類代替部分白砂糖和葡萄糖。使對攝取砂糖有牴觸感的人群也能放心飲用。


圖1為本發明的利用MEGA3.1生物學軟體構建的系統發育樹
具體實施例方式本發明為一種乾酪乳桿菌,分類名稱為乾酪乳桿菌Lactobacillus casei,參據的生物材料(株)JY68，該菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101，其保藏編號為CGMCC No. 3567，保藏日期為2010年I月12日，結果是存活。乾酪乳桿菌Lactobacillus caseiJY68的菌株發酵後的產品其抗原價能減低到發酵前的1/1000,它是通過以下實驗製得的一、乳酸菌株蛋白酶活性和肽酶活性試驗首先從日本購買4個菌株lactobacillus casei subsp.casei L—14,Streptococcus lactis subsp. cremoris H—61,Streptococcus lactis subsp. lactis 527 !Streptococcus thermophilus 510 ；又從Hansen 公司購買的 4 個菌株lactobacillus bulgaricus C2, lactobacillus helveticusCl, lactobacillus lactis Cl, Streptococcus thermophilus Cl;以及分離自新疆傳統發酵乳的 2 個菌株Lactobacillus casei JY68, Streptococcus diacetylactis Fl 菌株的蛋白酶活性和肽酶活性使用Forin法進行了測定。以對Glu-pNA等8種合成基質及酪蛋白的分解程度作為活性判斷指標，發現Lactobacillus casei JY68和Streptococcusdiacetylactis Fl菌株有較大的蛋白酶活性和肽酶活性。二、降低0乳球蛋白抗原性試驗接著將蛋白酶活性和肽酶活性較高的兩個菌株接種至10%的滅菌脫脂乳中，對培養液中P乳球蛋白的抗原性利用ELISA法進行測試。酵液脫苦效果的感官評價試驗。三、然後將具有P乳球蛋白抗原性低減效果的2個菌株Lactobacillus caseiJY68, Streptococcus diacetylactis Fl添加到10%脫脂乳蛋白酶水解液中，以0. 04%咖啡因的苦度為對照，對其脫苦效果進行了感官評價試驗。通過以上試驗，優選出不但具有較強的蛋白酶和肽酶活性，而且可以降低P乳球蛋白抗原性以及其發酵液不呈現苦味的幹釀乳桿菌 Lactobacillus caseiJY68 菌株。乾酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的分離方法以新疆採取的傳統發酵乳分離樣品，取ImL上述樣品放入滅菌小試管中，接種於IOmL石蕊牛乳培養基中，置於37°C恆溫培養箱中增菌培養至酸化凝固並呈現粉紅色時取出，用滅菌接種環挑取劃線接種於含有IOppm放線菌酮和IOppm硫酸粘菌素的BL瓊脂培養基中，將其放入厭氧培養罐中，置於37°C條件下培養48小時，形成菌落後，用接種環挑取菌落，接種於MRS培養液中，置於37°C條件下培養24小時，待菌株生長好後，再次劃線接種於BL瓊脂培養集中，37°C下厭氧培養48小時，記錄觀察菌 落形態和革蘭氏染色細胞形態特徵，並進行過氧化氫酶試驗，分離出在所述試驗中呈陰性的桿菌，所述桿菌為乳桿菌。將所述乳桿菌進一步純化培養，並進行低溫保存。乾酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的鑑定方法一、生理生化鑑定參照伯爵氏細菌鑑定系統，對被試菌體的形態以及生理生化特性進行鑑定，採用梅裡埃API 50CHL鑑定試劑盒對其生理生化特性進行鑑定。二、16S rRNA 序列鑑定1、採用的試劑Taq酶、dNTP、DNAmarker、溶菌酶、蛋白酶K、CTAB, SDS(購自北京寶傑羅生物科技有限公司)GoldVieW(購自北京塞百盛基因技術有限公司)。2、PCR引物16S rRNA序列擴增引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列如下L1:5』 -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』L2 :5』 -CGGCTACCTTGTTACGACTT-3』3、菌體培養將送檢樣品在平板上劃線分離，培養24_30h後挑取單菌落接種到20ml液體培養基中，30°C 200rpm培養20_24h。4、基因組DNA提取基因組DNA提取參照文獻。
用SDS-蛋白酶K裂解，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)沉澱細胞碎片和多糖，再用異丙醇沉澱來提取總DNA(Wilson，1987)。(I)取單菌落接種於5ml相應的培養基中，在37°C下培養24h ； (2)取1. Oml菌液於1. 5ml離心管中，13, OOOrpm離心2min,棄上清；
(3)沉澱重懸於1. Oml 0. 85% NaCl中。(4)室溫13, OOOrpm離心2min,棄上清；(5)沉澱重懸於 550iillXTE 中；(6)加 17iil 溶菌酶(35mg/ml)，37°C 溫育 30min ； (7)加 3 yl 蛋白酶 K(20mg/ml)，37°C 溫育 30min ； (8)加 30 yl 10% SDS，37°C 溫育 30min ； (9)加 IOOu I5M NaCl充分混勻；(10)加80 ill CTAB/NaCl溶液，混勻，65°C水浴IOmin ； (11)加等體積(0. 7-0. 8ml)氯仿/異戊醇(24 I)，輕輕振蕩混勻；(12)室溫，13，OOOrpm離心IOmin ；
(13)將上清液轉移到一新1.5ml離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 :1)輕輕振蕩混勻；(14)重複第12)步；(15)將上清液轉移到一新1. 5ml離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24 I)輕輕振蕩混勻；(16)重複第12)步；(17)將上清液轉移到一新1. 5ml離心管中，加入0. 6體積異丙醇，混勻後4°C靜置30min ； (18) 20°C 13，OOOrpm離心7min ；
(19)棄上清，加500 ill 70%乙醇，輕輕顛倒數次(洗鹽)；(20) 4 0C 15，OOOrpm離心7min ;
(21)重複洗鹽兩次；(22)倒置離心管，乾燥DNA沉澱7min。DNA沉澱溶於lOOyl I X TE緩衝液，_20°C保存備用。5、PCR 擴增反應體系為100 ii1:Taq (5U/ U 1)0. 8u I ；10XPCR Buffer (Mg2+Plus) 10 U I ；dNTP Mixture (2. 5mM/each)8u I ；模板 DNA 2. 5ng ；引物 27F(10mol/L) 2 y 1，引物1541R(10umol/L)2u I ;ddH20 補足到 IOOu I0
PCR 反應條件94°C for4min ;94°C for lmin, 58°C for lmin,72°C forlmin30sec,30cycles ；72°C for 5min ；4°C save, end。6、電泳檢測用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA，用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。顯色劑為GoldView。7、序列測定純化後的PCR產物採用ABI3730基因測序儀測序。測序工作由上海生工技術有限公司完成。8、序列分析與系統樹的構建採用序列圖譜軟體Chromas ,參照正、反向序列圖譜,對序列人工校對。從GenBank核酸序列資料庫中下載戈登氏菌屬相關模式菌株的16S rRNA基因序列，與所測的RR和RY菌株序列一起，用Clustal X軟體進行序列比對(alignment);然後利用MEGA3.1生物學軟體構建系統發育樹，採用Neighbor-Joining法進行系統發育分析，並進行1000次重複的Bootstraps統計學檢驗。三結果與分析1、生理生化鑑定結果經生理生化試驗初步鑑定，JY68細胞呈杆狀，革蘭氏染色陽性，接觸酶陰性能在15°C和45°C條件下生長，能利用葡萄糖和果糖，初步鑑定為乾酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)其生理生化特性見表I。表I生理生化特徵
權利要求
1.一種乾酪乳桿菌 Lactobacillus casei JY68，其保藏號為 CGMCCNo :3567。
2.一種發酵乳飲料製造方法，它包括以下步驟 步驟一,準備乾酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養液和雙歧桿菌的菌株培養液進行活化，將活化後的乾酪乳桿菌Lactobacillus caseiJY68的菌株培養液和雙歧桿菌的菌株培養液分別接種到滅菌後的質量濃度為10-20% w/v的脫脂奶粉中進行培養； 步驟二，製備原料乳在質量濃度為10-20% w/v的脫脂乳粉中添加質量濃度為2-4%w/v葡萄糖進行攪拌形成原料乳，然後對原料乳進行殺菌冷卻； 步驟三,將乾酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養液添加到殺菌後的原料乳中進行培養，培養後的細菌、酵母和黴菌為零，大腸菌群為陰性； 步驟四，製備調配液將發酵後的原料乳和無菌水按照1:1的比例混合加入0. 2-0. 4% w/v的食品香料中，攪拌均勻製備成調配液； 步驟五，將步驟三中培養後的原料乳和步驟四中的調配液與乾酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養液進行混合攪拌後製得發酵乳製品,然後將成品進行冷藏保存。
3.根據權利要求2所述的發酵乳飲料製造方法,其特徵是步驟一中的Lactobacilluscasei JY68的菌株培養液包含有乾酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68或包含有乾酪乳桿菌 Lactobacillus casei JY68、嗜熱鏈球菌 Streptococcus thermophilus 和保加利亞乳桿菌Lactobacillus bulgaricus,步驟一種的雙歧桿菌的菌株培養液為短雙歧桿菌Bifidobacterium breve、長雙歧桿菌Bifidobacterium Iongum或者短雙歧桿菌Bifidobacterium breve和長雙歧桿菌Bifidobacterium Iongum的混合,脫脂奶粉含22-30% w/v的葡萄糖,步驟一種乾酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養液接種到脫脂奶粉中培養的溫度在37°C，培養的時間為24-48小時，雙歧桿菌的菌株培養液接種到脫脂奶粉中培養的溫度在24°C，培養的時間為24-48小時。
4.根據權利要求2所述的發酵乳飲料製造方法，其特徵是步驟三中培養的溫度為35-37°C，培養的時間為7天。
5.根據權利要求2所述的發酵乳飲料製造方法，其特徵是步驟五中冷藏保存的溫度為2-7。。。
全文摘要
本發明公開了一種乾酪乳桿菌Lc JY68，其保藏號為CGMCC No3567。本發明還公開一種發酵乳製品的製造方法，一，準備乾酪乳桿菌Lc JY68的菌株培養液和雙歧桿菌的菌株培養液進行活化、培養；二，製備原料乳；三，將乾酪乳桿菌Lc JY68的菌株培養液添加到殺菌後的原料乳中進行培養，培養後的細菌、酵母和黴菌為零，大腸菌群為陰性；四，製備調配液；五，將步驟三中培養後的原料乳和步驟四中的調配液與乾酪乳桿菌Lc JY68的菌株培養液進行混合攪拌後製得發酵乳製品，然後將成品進行冷藏保存。
文檔編號A23C9/127GK103060219SQ201210124099
公開日2013年4月24日 申請日期2012年4月26日 優先權日2012年4月26日
發明者趙景陽 申請人:常州康樂優生物技術有限公司