神經生長因子製品在製備治療視神經病變藥物中的應用的製作方法

2023-10-17 00:55:09

專利名稱：神經生長因子製品在製備治療視神經病變藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及從生物材料中提取的神經生長因子製品的用途，確切地說是從生物材料中提取的神經生長因子製品在製備治療視神經病變藥物中的應用。
背景技術：
目前，神經生長因子(NGF)可以從雄性小鼠、人胎盤腦髓、人胎盤及蛇毒等組織中提取，也可以通過基因工程的方法製備。在現有的技術中，神經生長因子是迄今為止發現的唯一不僅對中樞及外周神經的正常神經細胞有營養因子作用，而且具有調節損傷神經修復機能的生物活性分子。它能促進中樞及外周神經系統的發育和分化，維持神經系統的正常功能，加快神經系統損傷後的修復。目前研究表明中樞膽鹼能神經元和某些運動神經元在損傷(缺氧、神經毒、病毒感染、機械損傷)時，NGF可以保護、減輕傷害的程度，並且促進相應神經纖維的再生和功能的恢復。其作用的機理主要是NGF進入機體後，與末梢上相應NGF受體結合後進入軸突，再逆轉行軸漿轉運至胞體，在某些過程中引起的一系列的生物效應，如誘導突起生長、損傷神經的修復、促進某些蛋白和酶的合成。在臨床上有重大的應用價值，目前的適應症主要包括各種外周神經病、脊椎損傷、顱腦損傷、中樞神經系統缺氧和缺血造成的損傷及早老性痴呆等。但是大多數的報導和相關的試驗數據主要是介紹其在外周神經病、脊椎損傷、顱腦損傷、中樞神經系統缺氧。
公知的神經生長因子(NGF)具體提取方法如下1、頜下腺細胞的破碎與離心取60-90天齡昆明種二級小白鼠，健康雄性，頸椎脫臼法處死，局部用碘酒和75％酒精消毒後，無菌條件下迅速取下兩側頜下腺，放入無菌無熱原冰浴玻璃器皿中-20℃保存。取頜下腺在預冷注射用水中勻漿，離心收上清，重複一次，合併上清，勻漿液4℃～8℃條件貯存備用。
2、除去等電點大於6.8的雜蛋白上清對0.25mol/L的pH6.8磷酸緩衝液透析16小時後上CM-52I柱，用0.02mol/L的pH6.8磷酸緩衝液洗脫，收集波長280nm吸收值大於0.5的未吸收的蛋白組分。
3、酸化，使沉降係數為7的神經生長因子(7S NGF)解離為α、β、γ亞基。
CM-52I柱的收集液對注射用水透析16小時後，加入的pH4.0的乙酸鹽緩衝液，使pH值迅速降至4.0，再加入0.4mol/L的NaCl，這時7S NGF打開鏈解離為α、β、γ亞基，靜置後離心，收集上清。
4、過CM-52II柱，分離出沉降係數為2.5的神經生長因子(2.5S NGF)CM-52II柱，用含0.4mol/L NaCl的0.05mol/L、pH4.0的乙酸鹽緩衝液平衡，上樣後先用相同的平衡液洗脫；再用不含NaCl的0.05mol/L、pH4.0的乙酸鹽緩衝液洗柱；吸附的蛋白質用0.05mol/L、pH9.0Tris-HCl緩衝液洗脫；當流出液pH值升至8左右時，有一個淺黃色雜蛋白組分被洗脫。再用含0.4mol/L NaCl的0.05mol/L、pH9.0Tris-Hcl緩衝液洗脫下NGF組分。CM-52柱的收集液對注射用水透析16小時後，用濾膜過濾除菌。
5、過SephadexG75柱，精製2.5S NGF將上述神經生長因子(NGF)組分冷凍乾燥後，溶於1N的醋酸溶液(HAC)，經SephadexG75柱分離，平衡液體及洗脫液為1N的HAc，收集神經生長因子(NGF)活性峰，注射用水4℃透析後用濾膜過濾除菌，得神經生長因子原液製品。
神經生長因子(NGF)凍乾產品的製備。
1000ml成品分裝液各成分含量如下含有500AU～8000AU/ml神經生長因子原液製品、重量百分比為0.5％～2％的白蛋白和或0.5％～10％的甘露醇以及注射用水；神經生長因子(NGF)原液製品經檢查合格後，按上述處方配製，過濾除菌，無菌灌裝於西林瓶中，冷凍乾燥、壓塞、軋蓋即得凍幹神經生長因子(NGF)產品。

發明內容
本發明的目的是提供一種神經生長因子製品的新用途，即在臨床上的新應用。
具體地說，本發明涉及從生物材料中提取的神經生長因子製品在製備治療視神經病變藥物中的應用。
視神經一般分為顱內段、管內段、眶內段、眼內段四個部分。
視神經病變包括視神經炎、視神經萎縮、視神經挫傷等相關臨床病症。
1.視神經炎視神經眶內段的炎症，通常為單側性。很多病例由多發性硬化引起，少數病例的病因與視乳頭炎的病因相同，但特發性病例在球後視神經炎中較之視乳頭炎者更為常見。主要症狀為視力迅速減退(與視乳頭炎相同)和眼球轉動時疼痛。眼底通常正常，不過偶見輕度視乳頭充血者。可在2～8周內自然緩解，視力恢復正常。有些病例可殘留中心暗點和視乳頭顳側蒼白。大多數病例可改善，但不可能恢復到正常。本病可復發，多發性硬化引起者尤然。每次復發使視力損害和顳側蒼白加重，並可導致視神經萎縮和永久性的視力全部喪失。
2.視神經萎縮視神經萎縮是指視神經纖維發生退行性變性和傳導功能障礙。所有造成視神經損害的疾病均可導致視神經萎縮。
此病病因較複雜，臨床上根據其發病情況將其分為下述二大類(1)原發性視神經萎縮 某些顱內佔位性病變或視神經損傷者為原發性或單純性視神經萎縮。
(2)繼發性視神經萎縮 其中包括炎性、變性或遺傳性三類。主要包括視乳頭炎或視網膜炎後的上行性萎縮。球後病變的下行性萎縮，視網膜色素變性，缺氧性視乳頭水腫，視網膜中央動脈阻塞等變性萎縮，以及遺傳性視神經萎縮。
3.視神經挫傷產生視神經挫傷有兩種主要的因素。其一為眼球受挫傷時在外力的作用下極度扭轉，導致視神經(尤其是球後段)的撕裂傷。其二是在外傷時，眼眶內容物的擠壓而損傷視神經，也可能眶後壁骨折而挫傷骨內段視神經。
視神經病變傳統的治療要點在常規的治療上早期應用可試用皮質類固醇以減輕視神經水腫，血管擴張劑、能量合劑、維生素B族、及高血氧治療；如有視神經萎縮，可靜滴腦活素。必要時作眶內或視神經開放減壓術。對於本病變的治療目前主要以糖皮質激素、維生素及其他的相關的輔助治療措施進行治療，療效不能肯定，而且會造成全身性的不可逆轉的毒副作用。
發明人在研究中發現神經生長因子對視神經挫傷等視神經病變有明顯的治療效果，隨即進行了深入的研究，即進行該藥物的臨床前和臨床的研究試驗。
發明人在臨床前和臨床試驗中做了大量的數據和試驗，結果表明對大鼠的視神經挫傷等視神經病變及人視神經挫傷等視神經病變病例的治療取得了很好的療效。
在第一個實施例中，給40隻Wistar成年大鼠腹腔注射二硫化碳、複製了視神經損害的模型，分高(NGF1000AU/KG)、中(200AU/KG)、低(20AU/KG)劑量組及對照組，每組10隻，雌雄各半。給藥組球後注射神經生長因子，每天1次，每周6次，共3周；空白對照組球後注射等量生理鹽水。於治療前、後測定了大鼠模式翻轉和閃光視覺誘發電位。試驗結果表明，高、中劑量組大鼠在治療10天和20天時各波潛伏比對照組有明顯或非常明顯的縮短，而低劑量組(除P1外)未見明顯差異。由此證實，神經生長因子注射液對大鼠視神經損害有明顯的治療作用。
在第二個實施例中，用注射用神經生長因子對93名視神經挫傷等視神經病變的病例治療的臨床試驗中表明神經生長因子對視神經挫傷等視神經病變的療效是確切的。
從以上結果，可以得出本發明的有益效果在於A、本發明對神經生長因子製品發掘了新的臨床用途，開拓了一個新應用領域。
B、本發明的神經生長因子製品，安全無毒，藥效明顯，是一種治療視神經病變的特效藥物，預示著很好的市場前景。
C、本發明的神經生長因子原料來源豐富、製備工藝成熟，可製成水針劑和凍乾粉針劑等，實現產業化。
具體實施例方式
為了更好地理解本發明的實質，下面通過實施例即用鼠神經生長因子製品的藥理試驗及結果來說明其在製藥領域中的新用途。
實施例1用二硫化碳給成年大鼠腹腔注射造成了大鼠視神經損害的模型，觀察了鼠神經生長因子對大鼠的視神經挫傷等視神經病變恢復的治療作用。
試驗藥品神經生長因子製品由安徽金大陸生物製藥有限公司生產，1000AU/ml(凍乾粉針劑)，批號950105。2-8℃保存，臨用前用生理鹽水稀釋。
按前述提取方法提取神經生長因子，按下述處方製備凍乾粉針劑。
製備方法如下處方2.4×106AU神經生長因子、10g白蛋白、50g甘露醇以及注射用水1000ml製備神經生長因子(NGF)原液經檢查合格後，按上述處方配製，過濾除菌，無菌灌裝於西林瓶中，每支0.5ml，冷凍乾燥、壓塞、軋蓋。即得凍幹神經生長因子(NGF)1000AU/支的製品。
試驗動物Wistar健康成年大鼠120隻，體重240-340g，雌雄各半，購自中國醫學科學院試驗動物繁育場，動物生產合格證京動字01-3008。
儀器英國Medlec公司生產的MS92a型肌電圖儀、ST10型感覺誘發電位儀。
試劑丙烯醯胺 廣州化學試劑廠生產二硫化碳 北京52952化工廠生產戊巴比妥鈉 購自醫藥公司分組說明因為目前國內、外尚無療效確切或公認的治療視神經損害的已知藥物，故本研究中未設陽性對照組。
試驗方法1、分組 取Wistar大鼠40隻，雌雄各半，體重240-340g，隨機分為高、中、低劑量給藥組和空白對照組，共4組，每組10隻。
2、給藥量 臨用前用生理鹽水將神經生長因子稀釋至實驗所需濃度的注射液。高劑量組，給大鼠球後注射NGF1000AU/KG；中劑量組球後注射NGF200AU/KG；空白對照組球後注射等量的生理鹽水。
3、視覺誘發電位的測定方法3.1先將40隻大鼠在戊巴比妥鈉(30mg/kg，2％溶液)麻醉後，暴露顱骨，按下屬部位埋入自製的不鏽鋼螺紋電極(1mm)；引導電極位於前滷後6mm，矢狀壯縫右側旁3.5mm處；參考電極位於前滷2mm，矢狀壯縫左側旁開2mm處；地電極位於前滷2mm，矢狀壯縫左側旁開2mm處。埋入電極後，用自凝牙託粉固定在顱骨上。
3.2給大鼠手術後兩周描記下述兩種視覺誘發電位(FEP和PREP)。然後按300mg/kg劑量腹腔注射二硫化碳油溶液三周，至出現視覺誘發電位潛伏時限明顯延長。
3.3將視神經受損大鼠隨機分為4組，給高、中、低三個劑量組大鼠分別按上述劑量球後注射NGF；而空白對照組，球後注射等量生理鹽水，每天1次，每周6次，共治療3周。於治療10天和20天分別記錄視覺誘發電位，判斷治療效果。
閃光視覺誘發電位(FEP)測定方法將清醒已埋好電極的大鼠進行固定，置於視覺信號發生器螢光屏前20cm處，給以閃光頻率1次/S，刺激時程10ms，分析時間500ms，平均疊加100次，濾波2-100Hz。
模式翻轉誘發電位(PREP)測定方法其視覺刺激信號為寬9cm的垂直條柵、黑百轉換2次/S，其他條件同FEP。
FEP和PREP潛伏時係指一刺激信起始至出現N1、P1、N2或P2峰所需的時間(ms)，來表示各波的潛伏時。對所測結果用F檢驗和t檢驗進行統計分析，觀察神經生長因子對受損神經的治療作用。
4、試驗的結果治療前、後大鼠體重和一般狀況無明顯變化。從球後注射神經生長因子的大鼠模式翻轉視覺誘發電位測定結果(表1)中表明，高劑量組治療10天時P1波潛伏時比對照組明顯縮短(P＜0.05)，N2波潛伏時比比對照組明顯縮短(P＜0.01)，而治療20天時N1、P1和N2波潛伏時則有非常明顯的縮短(P＜0.01)；中劑量組大鼠治療10天和20天時P1和N2潛伏時的變化與高劑量組的基本相同；低劑量組大鼠各波潛伏時與對照組無顯著差別。
從NGF注射液對受損視神經大鼠閃光誘發電位(FEP)的影響結果(表2)看來，高劑量組大鼠在治療10天時N1、P2波潛伏時與對照組比較，有明顯縮短(P＜0.05)，而N2波的潛伏時則有明顯縮短(P＜0.01)，治療20天時N2、P2和N2波的變化與治療10天相似，但P1波潛伏時比對照組出現顯著的縮短(P＜0.05)；中劑量組在治療10天時僅有P2和N2波潛伏時明顯縮短(P＜0.05)，於治療20天時P2和N2波潛伏時有明顯縮短(P＜0.05)，而N2波為非常明顯縮短(P＜0.01)；然而低劑量組大鼠僅在治療20天時P1波潛伏時比對照組有明顯縮短(P＜0.05)。
5、結論二硫化碳可致視神經損害，二硫化碳染毒大鼠的視神經屬腫大，充滿結構破壞的微絲；微絲和肌動蛋白轉運加速等病理變化。視覺誘發單位可以反映視神經傳導徑路完整性和受損狀況，因而採用PREP和FEP兩種視覺誘發電位各波潛伏時反應視神經的功能變化。從神經生長因子注射液的治療中，可以看見高、中劑量組兩種視覺誘發電位各波潛伏時有顯著好轉，顯示受損視神經功能的恢復、在治療20天時低劑量組大鼠個別波潛伏時也有顯著縮短。
球後注射NGF10天和20天時，經視覺誘發電位測定表明，高、中劑量組可明顯改善視神經功能，低劑量組呈現某些治療作用，並具有一定劑量-反應關係。由此表明NGF對視神經損害有較好治療作用。神經生長因子作為治療視神經挫傷等視神經病變藥物的新用途。
表1 NGF注射液對視神經受損大鼠模式翻轉誘發電位(PREP)的影響

注與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01表2 NGF注射液對視神經受損大鼠模式閃光誘發電(FEP)的影響


注與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01實施例2神經生長因子(NGF)的II期臨床試驗的對視神經損傷患者的治療效果分析，用以證明神經生長因子作為治療視神經挫傷等視神經病變藥物的新用途。
試驗藥品鼠神經生長因子由安徽金大陸製藥有限公司生產，含量1000AU/支(凍乾粉針劑)。4℃保存，臨用前用生理鹽水稀釋。
鼠神經生長因子的製備方法按具體實施例1的方法製備試驗用藥品。
一、各中心計劃病例數與完成病例數

其中用以進入統計分析的有效病例為93例。
二、各有關療效指標評分綜合療效的判斷

總有效率比較

從上述統計分析的結果可以看出在組間的比較上差異很大，特別是高劑量組的有效率佔的比率很高，而低劑量組的療效也非常的確切，而對照組的有效率就很低。其中在總有效率中高劑量組的有效率三周為62.96％，而到六周是達到64.29％；低劑量組有效率三周為44.12％，六周時已上升到61.76％；因此證明神經生長因子具有作為治療視神經挫傷等視神經病變藥物的新用途。
1、分三組比較高劑量組為2000AU/支、低劑量組為1000AU/支、對照組為空白安慰劑。目前無陽性對照，故不設陽性對照組。
總分

療效等級

權利要求
1.神經生長因子製品在製備治療視神經病變藥物中的應用，其特徵在於神經生長因子製品在製備治療視神經病變藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及神經生長因子製品的新用途，具體地說是神經生長因子製品在製備治療視神經病變藥物中的應用。本發明對神經生長因子製品發掘了新的臨床用途，開拓了一個新應用領域。本發明製品，安全無毒，藥效明顯，是一種治療視神經病變的特效藥物，其原料來源豐富、製備工藝成熟，可製成水針劑和凍乾粉針劑等，實現產業化。
文檔編號A61P25/00GK1824297SQ20051009734
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月30日 優先權日2005年12月30日
發明者陳薇, 陳萬象, 黃小楓, 徐曉紅 申請人:安徽金大陸生物製藥有限公司