基於兔單克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒的製作方法
2023-10-17 05:43:54 2
專利名稱：基於兔單克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及試劑盒，尤其涉及一種基於兔單克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫 吸附試劑盒。
背景技術：
氯黴素(ChloramphenicoLCAP)，化學名D-蘇式_(-)-Ν-[α-(羥基甲基)-β-羥 基-對硝基苯乙基]-2，2-二氯乙醯胺。其屬於廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌、陰性菌均有 良好的抑制作用，因而廣泛應用於畜牧、水產養殖業。但在動物性食品內殘留的CAP對人體 的健康具有潛在的危害。為此，世界上許多國家均制定了氯黴素的最高殘留標準，嚴格限制 其使用。為了適應加入WTO後的國際競爭與挑戰，必須建立起一種具有自主智慧財產權的快 速檢測方法。因此開發出一種簡單快速，適用於氯黴素殘留現場監控的痕量分析具有十分 重要的現實意義。目前對氯黴素殘留檢測的主要方法有色譜法、微生物法等。其中HPLC法、氣相色 譜以及液相色譜-串聯質譜等方法雖然具有靈敏、準確等特點，但該類方法前處理較複雜， 所需儀器昂貴，而且需要有熟練的技術人員，難以在基層工作中普及推廣。微生物檢測方法 操作簡單，費用低，但耗時長，敏感性和專一性低，易漏檢，也會出現假陽性，引起誤判，一般 用於定性檢測簡便。而免疫分析法具有一定的靈敏度和特異性，而且不需要昂貴的儀器設 備，為氯黴素提供了一個簡單實用的分析檢測途徑。適用於大量樣本的快速檢測，ELISA檢 測方法勢必成為檢測氯黴素殘留的發展趨勢。兔單克隆抗體較常規的鼠單克隆抗體具有更多優點。首先，兔子相比於小鼠能識 別更多免疫抗原的表位。其次，由於兔脾臟較大，可以進行更多的融合實驗，使得高通量篩 選融合細胞成為可能。本試劑盒應用雜交瘤技術及重組抗體技術得到氯黴素兔單克隆抗 體，開發出基於兔單克隆抗體的氯黴素間接酶聯免疫試劑盒，國內外均未見有報導。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種具有高特異性、高靈敏度的基於 兔單克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒。基於兔單克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒包括盒體和設在盒體 內的96孔酶標板以及試劑，96孔酶標板內包被有氯黴素包被抗原，盒內的試劑如下(1)洗滌濃縮液；(2)稀釋濃縮液；(3)氯黴素標準溶液；(4)氯黴素抗體； (5)辣根過氧化物酶標羊抗兔抗體；(6)底物稀釋液；(7)底物；
(8)底物顯色液；(9)反應終止液。所述的氯黴素包被抗原為氯黴素與卵清蛋白的偶聯產物，氯黴素包被抗原能與抗 氯黴素抗體特異性結合。所述的洗滌濃縮液的組成為氯化鈉7 9g、磷酸二氫鉀0. 1 0. 3g、磷酸氫二鈉 3 5g、氯化鉀0. 1 0. 3g、吐溫200. 5 Iml和去離子水。所述的稀釋濃縮液的組成為 氯化鈉7 9g、磷酸二氫鉀0. 1 0. 3g、磷酸氫二鈉3 5g、氯化鉀0. 1 0. 3g和去離子 水。所述的氯黴素抗體是兔單克隆抗體，是以兔子為免疫動物，經過雜交瘤技術以及重組抗 體技術最終得到的。所述的底物顯色液為3，3，5，5-四甲基聯苯胺配製液。所述的底物稀 釋液為PH5. 0檸檬酸緩衝液，pH5. 0檸檬酸緩衝液的組成為3 6g檸檬酸、6 9g磷酸氫 二鈉和去離子水。所述的氯黴素標準溶液的濃度為10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/ mL、0.625ng/mL或0.3125ng/mL。所述的底物為過氧化氫或過氧化脲。所述的反應終止液 為2M硫酸或鹽酸。本發明在氯黴素檢測中，IC5tl值為1.06ng/mL，抑制率曲線線性擬合方程y = 39. 705x+48. 946，檢測範圍在0. 19-6. 05ng/mL之間，最低檢測限是0. 10ng/mL。試劑盒中抗 氯黴素抗體具有較高的特異性，除了和琥珀氯黴素酸鈉，甲碸黴素，氟甲碸黴素交叉反應率 分別為2. 09%, 18. 10%,12. 45%外，和其他喹諾酮類以及磺胺類藥物均無交叉反應。本發明適用於牛奶、蜂蜜等樣品中氯黴素殘留的檢測。該試劑盒能同時檢測大批 量樣本，方便又快速，對現場監控痕量分析具有十分重要的現實意義；同時使檢測成本大大 降低，具有潛在的經濟價值。
圖1是以PBS緩衝液為基質的氯黴素單抗間接競爭ELISA標準曲線；圖2是以牛奶為基質的氯黴素單抗間接競爭ELISA標準曲線。具體的實施方式本發明基於兔單克隆抗體開發氯黴素殘留分析的間接酶聯免疫吸附試劑盒，該試 劑盒基於免疫反應和酶促反應，能夠檢測牛奶及蜂蜜等樣本中的氯黴素的殘留。基於兔單 克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒包括盒體和設在盒體內的96孔酶標板以 及試劑。96孔酶標板內包被有氯黴素包被抗原，盒內的試劑如下(1)洗滌濃縮液；(2)稀 釋濃縮液；(3)氯黴素標準溶液；(4)氯黴素抗體；(5)辣根過氧化物酶標羊抗兔抗體；(6) 底物稀釋液；(7)底物；(8)底物顯色液；(9)反應終止液。所述的氯黴素包被抗原為氯黴素與卵清蛋白的偶聯產物，氯黴素包被抗原能與抗 氯黴素抗體特異性結合；所述的洗滌濃縮液的組成為氯化鈉7 9g、磷酸二氫鉀0. 1 0. 3g、磷酸氫二鈉3 5g、氯化鉀0. 1 0. 3g、吐溫200. 5 Iml和去離子水。所述的稀釋 濃縮液的組成為氯化鈉7 9g、磷酸二氫鉀0. 1 0. 3g、磷酸氫二鈉3 5g、氯化鉀0. 1 0. 3g和去離子水。所述的氯黴素抗體是兔單克隆抗體，是以兔子為免疫動物，經過雜交瘤 技術以及重組抗體技術最終得到的。所述的底物顯色液為3，3，5，5-四甲基聯苯胺配製液。 所述的底物稀釋液為PH5. O檸檬酸緩衝液，pH5. O檸檬酸緩衝液的組成為3 6g檸檬酸、 6 9g磷酸氫二鈉和去離子水。所述的氯黴素標準溶液的濃度為10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、0. 625ng/mL或0. 3125ng/mL。所述的底物為過氧化氫或過氧化脲。所述的 反應終止液為2M硫酸或鹽酸。盒內的試劑設置(1)洗滌濃縮液1瓶，25 35mL/瓶，內含有氯化鈉7 9g、磷酸二氫鉀0. 1 0. 3g、磷酸氫二鈉3 5g、氯化鉀0. 1 0. 3g、吐溫200. 5 1ml，為正常使用濃度的30 40倍；(2)稀釋濃縮液1瓶，25 35mL/瓶，內含有氯化鈉7 9g、磷酸二氫鉀0. 1 0. 3g、 磷酸氫二鈉3 5g、氯化鉀0. 1 0. 3g，為正常使用濃度的30 40倍；(3)氯黴素標準溶 液(10ng/mL、5ng/mL、lng/mL、0. 5ng/mL、0. lng/mL、0. 05ng/mL)各 1 瓶，ImL/瓶；(4)氯黴素 抗體1管，25 50 μ 1/管，使用時2000 3000倍稀釋；(5)辣根過氧化物酶標羊抗兔抗體 (酶標二抗)1管，50-100 μ 1/管，使用時1000 2000倍稀釋；(6)底物稀釋液1瓶，25 35mL/瓶，內含3 6g檸檬酸，6 9g磷酸氫二鈉，為正常使用量的30-40倍；(7)底物1 瓶，1 5mL/瓶，其為過氧化氫或過氧化脲；(8)底物顯色液為四甲基聯苯胺配製液1瓶， 2 5mL/瓶，配製方法為IOmgTMB溶於2mLDMS0中；(9)反應終止液1瓶，15 20mL/瓶， 其為2mol/L硫酸或鹽酸。實施例1 氯黴素免疫抗原及包被抗原的合成具體操作步驟如下取CAP小分子80mg，溶於1. 5mL無水乙醇中，加入12mL Imo 1/ L鹽酸。加入鋅粉65mg，70°C水浴加熱50min。冷卻後，在4°C，pH 1_2條件下逐滴加入 0. 5mol/L NaNO2數滴，避光攪拌，直至澱粉碘化鉀試紙呈灰藍色(溶液I)；稱取BSA 150mg, 溶於12mL磷酸緩衝液(PBS，pH 7.4)中，冷卻。(溶液II)。然後將I液邊攪拌邊緩慢加入 II液中，同時加入0. 2mol/L的NaOH溶液，使pH始終保持在7_8左右。4°C攪拌12h，反應 產物用PBS透析5d。包被抗原OVA-CPFX同法製備，用於包被酶標板。氯黴素與載體蛋白的偶聯原理如下 實施例2 氯黴素兔單克隆抗體的產生1、兔子的免疫初免將500μ g的免疫抗原與等量弗氏完全佐劑混合，完全乳化後，採用背部皮下 5點注射白兔(ImL/只)；三周後用200yg的免疫抗原與弗氏不完全佐劑混合後同法進 行第二次免疫；以後每兩周免疫一次，共免疫3 7次後，血清效價達到64000以上時，用 500 yg的免疫抗原耳緣靜脈注射，4天後頸動脈採全血，無菌取脾臟，準備細胞融合。
5
2、兔單克隆抗體的製備將兔子脾淋巴細胞與處於對數生長期的240E細胞進行融合，融合劑為50%的 PEG。融合後的細胞用HAT作為選擇性培養基，分裝於加有飼養細胞的2X20塊96孔細胞 培養板中，置37°0、5%0)2培養箱內培養。2周後預檢，發現背景高，換液。一周後，用間接 ELISA法篩選出陽性克隆72個，將初檢陽性的雜交瘤細胞轉移至24孔細胞培養板中。一周 後，採用間接ELISA法、間接競爭ELISA法篩選出分泌抗體親和力強，細胞生長狀態良好的 雜交瘤細胞9-3。將該雜交瘤細胞在液氮中保存一份，一份用於細胞裂解，提取mRNA，構建 質粒，生產抗體。從9-3雜交瘤細胞中分離mRNA，分別克隆其重鏈和輕鏈基因。基因經酶切 後與質粒連接，塗板挑取克隆。大腸桿菌過夜培養提取質粒，重鏈輕鏈質粒配對轉染至293T 細胞進行表達。無菌收集細胞，離心後取上清。小轉後獲得了 6株CAP單抗質粒。通過間 接競爭ELISA試驗、ELISA夾心法確定CAP 9-3H1/L2質粒進入大轉生產。採用Protein A 純化方法純化並收集CAP單克隆抗體，共得IOmL CAP單抗，IgG濃度為1. 23mg/mL。實施例3 酶標板的包被氯黴素包被抗原用pH9. 6,0. 05mol/L碳酸鹽緩衝液(含2. 93g碳酸氫鈉和1. 59g 碳酸鈉，溶於雙蒸水或超純水1L)稀釋成0. 2 μ g/mL，在酶標板的每孔加50 μ L，4°C包被12h 或37°C包被2h，傾去包被液體，用PBST洗滌3 5次，拍幹，然後在每孔中加入250 μ L 3% 脫脂乳，37°C封閉1小時，取出後洗滌3 5次，乾燥封膜後保存。實施例4 試劑盒的測定原理首先將氯黴素與大分子載體蛋白偶聯製成複合物作為包被抗原，並使包被抗原結 合到某種固相載體表面。然後加入氯黴素標準溶液或待測的樣本(含待測的稀釋樣本)及 氯黴素兔單克隆抗體，氯黴素標準溶液或待測樣本與氯黴素的包被抗原競爭性結合氯黴素 抗體，與包被抗原結合的抗體在加入酶標二抗後可以顯現出顏色，與游離的氯黴素小分子 結合的抗體在洗滌時被除去。最後加入底物顯色，氯黴素標液或樣本中氯黴素含量越多，與 固相抗原結合的抗體就越少，最後的發色反應減弱，抵制率就越高；反之，則發色反應增強， 抑制率減低，因而先根據已知量氯黴素的標準溶液獲得抑制率與氯黴素含量之間的半對數 關係作圖即得到標準曲線，再根據樣本的抑制率來推出待測樣本的濃度。實施例5 待測樣本的前處理A、牛奶檢測樣品的前處理新鮮牛奶，於4°C下5000r/min離心20min，棄去上層脂肪，取下層清液，加入 0. 3yL 17%的鐵氰化鉀溶液，搖勻後再加入0.3μ L 52%的硫酸鋅溶液，迅速搖勻。5000r/ min離心15min，取上清液用PBS做一定稀釋待用。B、豬尿樣品的前處理豬尿高速離心lOmin，取上層清夜，5倍稀釋，待用。實施例6 檢測氯黴素試劑盒的使用(1)試劑配製A、稀釋濃縮液試劑盒中稀釋濃縮液用超純水或蒸餾水稀釋30 40倍後使用。B、洗滌濃縮液試劑盒中洗滌濃縮液用超純水或蒸餾水稀釋30 40倍後使用。C、底物稀釋液試劑盒中底物稀釋液用超純水或蒸餾水稀釋30 40倍後使用。(2)試劑盒操作過程如下
A、試劑盒使用前需要室溫穩定半小時以上。B、取出酶標板，加入50 μ L標樣或待處理樣本加入到各自孔中，標樣和樣本同時 做2-4個重複，然後加入50 μ L稀釋好的氯黴素抗體，37°C孵育1小時。C、倒出孔中的液體，將微孔板倒置於吸水紙上拍打，以保證完全除去孔內的液體， 用300 μ L洗滌液洗滌3 5次，拍幹。D、加入稀釋好的酶標二抗100 μ 1，反應50分鐘。Ε、取底物顯色液200 μ L加於底物緩衝液IOmL中，再加入0. 02%底物過氧化氫，振 蕩均勻後，每孔加入100 μ L以上配製好的顯色溶液，輕微振板，37°C暗處孵育15min。F、加入50 μ L終止液，測定OD45tl值判定結果。G、根據不同濃度標樣的OD值計算抑制率，繪製ELISA標準曲線。H、根據樣本測定的OD45tl值和稀釋倍數，通過標準曲線計算樣本中氯黴素的測定 含量ng/mL(即ppb，以ImL液體為Ig計算)。樣本中氯黴素含量=分析濃度X稀釋倍數
(ppb) ο實施例7 =ELISA試劑盒測定結果1、ELISA標準曲線及靈敏度以標準品濃度對數值為橫坐標，相對的BZiBciX 100%值為縱坐標繪製線性標準曲 線(Btl 標準品濃度為Ong/mL所對應的吸光值；B 其它各濃度所對應的吸光值)。曲線上測 得達到50%抑制率時所對應的氯黴素小分子的濃度值即為靈敏度。從圖1氯黴素ELISA平 均測定的標準曲線中可知該曲線在0.3125 lOng/mL之間有良好的線性，達到10%抑制率 氯黴素的濃度值為0. lOng/mL，有較理想的靈敏度，IC5tl值為1. 06ng/mL。2、ELISA 的特異性採用間接競爭ELISA法，將與氯黴素結構相似的藥物，如氯黴素琥珀酸鈉、甲碸黴 素、氟甲碸黴素以及一些常見的喹諾酮類藥物和磺胺類藥物與氯黴素兔單克隆抗體同時加 入到96孔酶標板中，以抑制率為縱坐標，各樣品濃度對數為橫坐標繪製標準曲線，分別計 算各自的IC5tl值。再根據氯黴素兔單克隆抗體相對氯黴素小分子的IC5tl值與氯黴素兔單克 隆抗體相對各種競爭物的IC5tl值的比值即得到交叉反應率(CR% )。對其它藥物的交叉率 結果見表1 表3。CR% = IC50氯黴素/IC5tl其他競爭小分子X 100%表1與結構相似藥物的交叉反應性 表2與部分喹諾酮類藥物的交叉反應性
表3與部分磺胺類藥物交叉反應性 3、ELISA的精確度與準確度測定添加氯黴素到牛奶中使其濃度為lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL每個濃度設 四個重複進行測定；在豬尿中添加氯黴素使其濃度為2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL，每個濃度設 四個重複分別進行測定。由於用PBS緩衝體系建立的標準曲線在檢測牛奶時回收率不理想，因此本實驗 建立了以牛奶為基質，添加氯黴素標準液的標準曲線。從圖2中可以看出，小分子濃度在 0. 5ng/mL-20ng/mL間曲線線性擬合良好，R2 = 0. 9883。用外標法對對間接ELISA法測定牛 奶樣品的準確度進行了檢測。結果(表4)表明，回收率在75.40%-117.00之間，變異係數 介於5. 57% -16. 39%，滿足檢測需要。 表4牛奶ELISA準確性試驗結果 應用外標法，以PBS緩衝液建立的標準曲線為依據，對間接ELISA法測定豬尿樣品 的準確度進行了試驗。結果(表5)表明，將豬尿稀釋5倍並添加氯黴素標準液使其濃度達到8ng/mL，4ng/mL，2ng/mL的平均回收率分別為79. 38%,89. 50%和114. 50%，變異係數分 別為9. 76%，6. 98%，1. 75%。回收率和變異係數均滿足ELISA檢測要求。表5豬尿中ELISA準確性試驗結果 846.35±0.6279.389.76 443.58士0.2589.506.98 242.29±0.0權利要求
一種基於兔單克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒，其特徵在於包括盒體和設在盒體內的96孔酶標板以及試劑，96孔酶標板內包被有氯黴素包被抗原，盒內的試劑如下(1)洗滌濃縮液；(2)稀釋濃縮液；(3)氯黴素標準溶液；(4)氯黴素抗體；(5)辣根過氧化物酶標羊抗兔抗體；(6)底物稀釋液；(7)底物；(8)底物顯色液；(9)反應終止液。
2.根據權利要求1所述的基於兔單克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒， 其特徵在於所述的氯黴素包被抗原為氯黴素與卵清蛋白的偶聯產物，氯黴素包被抗原能與 抗氯黴素抗體特異性結合。
3.根據權利要求1所述的基於兔單克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒， 其特徵在於所述的洗滌濃縮液的組成為氯化鈉7 9g、磷酸二氫鉀0. 1 0. 3g、磷酸氫二 鈉3 5g、氯化鉀0. 1 0. 3g、吐溫20 0. 5 Iml和去離子水。
4.根據權利要求1所述的基於兔單克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒， 其特徵在於所述的稀釋濃縮液的組成為氯化鈉7 9g、磷酸二氫鉀0. 1 0. 3g、磷酸氫二 鈉3 5g、氯化鉀0. 1 0. 3g和去離子水。
5.根據權利要求1所述的基於兔單克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒， 其特徵在於所述的氯黴素抗體是兔單克隆抗體，是以兔子為免疫動物，經過雜交瘤技術以 及重組抗體技術最終得到的。
6.根據權利要求1所述的基於兔單克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒， 其特徵在於所述的底物顯色液為3，3，5，5-四甲基聯苯胺配製液。
7.根據權利要求1所述的基於兔單克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒， 其特徵在於所述的底物稀釋液為PH5. 0檸檬酸緩衝液，pH5. 0檸檬酸緩衝液的組成為3 6g檸檬酸、6 9g磷酸氫二鈉和去離子水。
8.根據權利要求1所述的基於兔單克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫吸附試劑 盒，其特徵在於所述的氯黴素標準溶液的濃度為10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、 0. 625ng/mL 或 0. 3125ng/mL。
9.根據權利要求1所述的基於兔單克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒， 其特徵在於所述的底物為過氧化氫或過氧化脲。
10.根據權利要求1所述的基於兔單克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫吸附試劑 盒，其特徵在於所述的反應終止液為2M硫酸或鹽酸。
全文摘要
本發明公開了一種基於兔單克隆抗體的氯黴素殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒。它包括盒體和設在盒體內的96孔酶標板以及試劑，96孔酶標板內包被有氯黴素包被抗原，盒內的試劑如下(1)洗滌濃縮液；(2)稀釋濃縮液；(3)氯黴素標準溶液；(4)氯黴素抗體；(5)辣根過氧化物酶標羊抗兔抗體；(6)底物稀釋液；(7)底物；(8)底物顯色液；(9)反應終止液。本發明適用於牛奶、豬尿等樣本中氯黴素殘留的檢測。該試劑盒能同時檢測大批量樣本，方便又快速，對現場監控痕量分析具有十分重要的現實意義；同時使檢測成本大大降低，具有潛在的經濟價值。
文檔編號G01N33/577GK101915840SQ20101023170
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月20日 優先權日2010年7月20日
發明者倪庚, 劉娜, 鄭曉冬, 陸蕾 申請人:浙江大學