抗ca199單克隆抗體產生的雜交瘤及化學發光免疫分析試劑盒的製備方法

2023-11-30 00:01:46 4

抗ca199單克隆抗體產生的雜交瘤及化學發光免疫分析試劑盒的製備方法
【專利摘要】抗CA199單克隆抗體產生的雜交瘤及化學發光免疫分析試劑盒的製備製備，屬於免疫分析醫學領域。本發明提供了一種特異性識別CA199的單克隆抗體，產生該單克隆抗體的雜交瘤，以及使用該單克隆抗體檢測CA199的高靈敏度的方法；還提供了CA199化學發光免疫分析檢測試劑盒及其製備方法，該試劑盒包括：CA199檢測反應板、酶結合物、發光底物、標準品、質控品、濃縮洗滌液。本發明用細胞融合和雜交瘤技術研發出靈敏度高、特異性好的抗體；同時用自主研發抗體將免疫學與化學發光技術相結合，研製出檢測範圍寬、靈敏度高、操作方便、生產成本低的試劑盒。臨床檢測人血清中CA199的含量，對胰腺癌的早期篩查提供重要參考依據。
【專利說明】抗CA199單克隆抗體產生的雜交瘤及化學發光免疫分析試劑盒的製備
【【技術領域】】
[0001]本發明涉及CA199單克隆抗體產生的雜交瘤及檢測血清中CA199含量的試劑盒，可廣泛應用在醫學和及生物化學【技術領域】。
[0002]【背景知識】
[0003]CA 199是對人結腸癌細胞株SWl 116免疫的鼠脾細胞與大鼠骨髓瘤細胞融合而成的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體1116NS1929所識別的一種糖抗原。CA199是以單涎酸神經節甙脂的形式出現在組織中，以類粘蛋白的形式出現在胰腺癌患者血清中。CA199的檢測對腫瘤，特別是消化道腫瘤有較大的診斷作用，對胰腺癌的診斷敏感性可達70%-95%，特異性為72%-90%。雖然CA199對胰腺癌的敏感性很高，但是在急慢性胰腺炎、膽道阻塞、膽囊炎、肝硬化和肝炎等疾病中，CA199同樣會出現不同程度升高的現象。胰腺癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，由於早期缺乏典型的臨床表現，臨床上90%以上的患者確診時已經屬於中晚期，失去最佳治療時機。在世界普通癌症中，男性患胰腺癌居世界第四位，女性居第五位，而且預後效果差。目前研究熱點在於探求特異性的早期診斷腫瘤標誌物，實現對胰腺癌的早期診斷，提高胰腺癌患者的生存率，在早期、更加準確的確診胰腺癌依然是治療該疾病的關鍵。
[0004]目前在臨床實驗室檢測PSA的方法主要是放射免疫分析(RIA)、免疫比濁法和酶聯免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必須用放射性元素標記，檢測設備複雜昂貴，其放射性元素的半衰期短，不能長期保存，檢測結果不穩定，同時存在放射性汙染也給實驗操作人員帶來了傷害；酶免疫分析法靈敏度低，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性。本發明採用的化學發光免疫分析方法(CLIA)靈敏度比較高，可以達到10-18mol/L，快速，發光信號在幾秒鐘就能產生，操作方便，且不使用有害的試劑，與國內的同類試劑相比，具有靈敏度很高，操作簡便，更重要的是其需要的血清量少、檢測範圍廣、發光液持續時間長的優點，更能滿足臨床的需要，本發明的試 劑與國外同類試劑相比，達到國外同類產品水平。
【
【發明內容】
】
[0005]本發明的目的在於提供一種抗CA199單克隆抗體產生的雜交瘤以及建立一種簡單且具高靈敏度的檢測CA199的方法，並將該方法應用胰腺癌的早期篩查。以解決現有的單克隆抗體檢測CA199的靈敏度不夠或價格昂貴，不適合臨床大規模的應用的缺點。
[0006]本發明的另一目的在於提供一種CA199化學發光免疫分析測定試劑盒以及該試劑盒的製備方法。利用該試劑盒分析檢測靈敏度高、特異性強。
[0007]本發明獲得了能夠產生特異性識別CA199的單克隆抗體(mAb)的雜交瘤細胞株
1-1與雜交瘤細胞株2-1，此2株細胞株分別在2014年I月8日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國.武漢.武漢大學，保藏編號為CCTCC C201405與CCTCCC201406。此外，經過鑑定，兩株單克隆抗體分別識別CA199的兩個不同表位，通過1_1與
2-1的結合建立了雙抗體夾心酶聯免疫反應方法，其是一種高靈敏度及高通量的檢測系統。[0008]因此，本發明提供了下面所述的I至7的內容:
[0009]1.抗CA199的雜交瘤細胞株，其保藏號分別為CCTCC C201405和CCTCC C201406。
[0010]2.抗CA199的單克隆抗體，分別由保藏號為CCTCC C201405和CCTCC C201406的雜交瘤細胞系所分泌，所述單克隆抗體命名為1-1和2-1。
[0011]3.如權利要求2所述的抗CA199單克隆抗體的應用，即利用所述的單克隆抗體的雙抗體夾心法ELISA檢測CA199，夾心法兩兩配對的抗體來源於保藏號為CCTCC C201405雜交瘤分泌的抗體1-1和保藏號為CCTCC C201406雜交瘤分泌的抗體2_1，其步驟包括:
[0012](I)以所述的兩兩配對的單克隆抗體1-1包被；
[0013](2)加入待測樣品孵育；
[0014](3)以所述的兩兩配對的HRP標記的另一株單克隆抗體2-1作為二抗，加入反應體系;
[0015](4)洗滌後加入酶反應底物，以450nm讀取OD值；
[0016](5)結果表明檢測的靈敏度很高。
[0017]4.一種檢測血清中CA199含量的試劑盒，包括:包被有抗CA199單克隆抗體1_1的不透明聚苯乙烯板；CA199抗原系列標準品；酶標記的CA199單克隆抗體2_1 ;上述酶所作用的化學發光底物A液和B液以及洗滌液。
[0018]5.如權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於:不透明聚苯乙烯板採用直接物理吸附法包被單克隆抗體1-1，包被 液是磷酸鹽緩衝液；另一株CA199單克隆抗體2-1和辣根過氧化酶偶聯形成酶標記抗體，採用的是改良的過碘酸鈉法進行標記；CA199抗原系列標準品以小牛血清為基質，加入CA 199抗原純品配置而成；發光底物A、B為HRP-Luminol發光體
系O
[0019]6.如權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於:標記抗體所用的標記酶是辣根過氧化酶，用的是高碘酸鈉氧化法，所得酶標記抗體最佳的工作濃度是1:2000 ;包被有抗CA199抗體的不透明聚苯乙烯板採用的是直接物理吸附法包被；發光液A液用硼砂7.99g，硼酸
3.46g，魯米諾0.28g，對碘苯酚0.07g,加工藝用水定容至700mL，避光保存；發光底物B液由下列成分組成:硼砂7.99g,硼酸3.46g,過氧化脲0.07g加工藝用水定容至700mL。
[0020]7.如權利要求4-6所述試劑盒的製備方法，包括以下步驟:
[0021 ] (I)標準品的配製和濃度的校正
[0022]將CA199抗原純品，加入標準品稀釋液，配製一高濃度標準品濃液，採用逐低稀釋的方法稀釋到各濃度，配製成O、10、50、100、400、1000U/mL的系列標準品，標準品用國家標準品校正。
[0023](2)包被
[0024]採用0.5mol/L, pH值為9.5的磷酸鹽緩衝液與CA199單抗混合成抗體濃度是2 μ g/mL包被液，以100 μ L/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上,4°C孵育過夜；
[0025](3)洗板
[0026]用PBS-T洗液洗板孔2次；
[0027](4)封閉
[0028]封閉液包含NaC18.00g,KC10.20g,Na2HPO4.12Η202.90g,KH2PO40.20g，蔗糖 20.0Og,proclin300 1.00mL，BSA20.00g，封閉液的PH值為7.3-7.5，150 μ L/孔封閉，溼盒放置孵育3h ；
[0029](5)乾燥
[0030]去除封閉液，過夜乾燥。
[0031](6)組裝為成品
[0032]將聚苯乙烯板子放入鋁箔袋中並放入乾燥劑，密封保存。
[0033]上述的抗CA199的單克隆抗體，是由下列的方法所製備，步驟包括:
[0034](I)用蛋白量為15KU的CA199抗原與弗氏完全佐劑混合；經15天後進行第二次相同劑量與弗氏不完全佐劑混合免疫；再15天後進行第三次相同劑量與弗氏完全佐劑混合免疫；10天後尾部取血用間接ELISA方法測血清滴度，用相同劑量的純抗原不加佐劑加強免疫；3天後取脾細胞進行融合；
[0035](2)將免疫小白鼠脾細胞與小白鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)按5:1-10:1的比例，用50%PEG作為融合劑融合；
[0036](3)用含HAT (次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)的無血清培養基，在37°C，5% CO2的細胞培養箱中培養10天，常規間接ELISA方法篩選陽性孔；
[0037](4)篩選出的特異性強陽性孔用有限稀釋法克隆，獲得單抗細胞株進一步擴大培養;
[0038](5)收集培養上清液，親和層析法純化單克隆抗體，即為抗CA199單克隆抗體；
[0039](6)檢測單克隆抗 體的效價，選取效價高的一株進行HRP標記，並對標記好的單克隆抗體進行滴度測定；
[0040](7)標記好的單克隆抗體與其他未標記的單克隆抗體進行競爭ELISA反應，選取沒有競爭的一株進行夾心ELISA反應，確定最佳條件。
[0041]本發明的單克隆抗體可直接用於檢測樣品中的CA199含量，通過大量培養單抗細胞株，即可獲得大量的單克隆抗體，與多克隆抗體相比，具有純度高，專一性強、重複性好等優點。
[0042]本發明針對臨床實驗室建立了一種既可以手工操作，又可以用於標準全自動檢測儀器的檢測手段，建立了檢測人血清CA199的定量檢測方法。本發明的CA199定量檢測試劑盒(化學發光法)可以專一的檢測出人血清中的CA199的含量，從而根據其含量的多少判斷胰腺癌病情的變化和治療效果。它具有簡便、快速、靈敏、穩定的優點，本發明的試劑盒，包被的抗體1-1與酶標記的抗體2-1及被測樣品中的CA199形成「包被抗體-抗原-抗體-酶」的夾心複合物結構，所以本發明採用的是「雙抗夾心一步法」的反應模式。利用辣根過氧化酶催化發光底物，發光底物發生化學反應釋放大量的能量，產生激發態的中間體，當其回到穩定的基態時，可以發射出光子，利用發光儀器測量光量子的產額，該光量子的產額和樣品中的檢測無助的量成正比，由此建立標準曲線並計算出樣品中待測物質的含量。試劑盒檢測方法具有靈敏度高，檢測範圍寬，操作方便、對實驗人員無傷害，同時生產成本低，減輕了醫患雙方的負擔，因此更有利於臨床胰腺癌的早期篩查。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0043]圖1顯示的是本發明中的雜交瘤所產生的抗CA199單克隆抗體在ELISA方法中效價測定結果；[0044]圖2顯示的是標記HRP的抗CA199單克隆抗體滴度測量結果；
[0045]圖3顯示的是夾心法ELISA系統的檢測靈敏度；
[0046]圖4顯示的是所製備的試劑盒的標準品線形圖。
【【具體實施方式】】
[0047]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外，應理解，在闡述了本發明的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動和修改，這些等價形式同樣是本申請中權利要求書中所限定的範圍。
[0048]實施例1:動物免疫
[0049]選擇與所用的骨髓瘤細胞同源的8周齡左右的雄性Balb/C健康小鼠，抗原是蛋白量為15KU的CA199抗原與弗氏完全佐劑、PBS混合，完全乳化後，採取背部多點，及腋下、腹股溝免疫。免疫程序:經15天後進行第二次相同劑量與弗氏不完全佐劑混合免疫；再15天後進行第三次相同劑量與弗氏完全佐劑混合免疫；10天後尾部取血用間接ELISA方法測血清滴度，用相同劑量的純抗原不加佐劑加強免疫；3天後取脾細胞進行融合。
[0050]實施例2:雜交瘤的構建
[0051]1、骨髓瘤細胞株的培養及製備
[0052](I)本發明採用的是SP2/0骨髓瘤細胞，該細胞株生長及融合效率均佳，倍增時間為10-12h。融合時選擇處於對數生長期、細胞形態和活性佳的細胞。骨髓瘤細胞在融合前應先在培養基上作適應培養 ，使細胞生長到最佳的狀態(即對數生長期);
[0053](2)將培養的SP2/0吸至50mL的管中，離心，棄上清，懸起，加IOmL的培養基，吸取少量10倍稀釋後，計數。
[0054]2、脾細胞的製備
[0055]( I)將小鼠放在密封袋中，充CO2使其窒息死亡；
[0056](2)將小鼠消毒固定在解剖板上，在超淨工作檯中取脾，放在12mL培養基的培養皿中，剝掉粘連組織，研磨脾臟，直至剩白色組織為止，吸管全部吸起，再緩慢打出使組織塊粘連的管壁上，離心，棄上清，加IOmL的紅細胞裂解液裂解lOmin，再加20_25mL的培養基終止其反應，離心後，棄上清，加IOmL的培養基，吸取少量10倍稀釋後，計數。
[0057]3、細胞融合
[0058]細胞融合是雜交瘤技術的中心環節，基本步驟是取處於對數生長期的Sp2/0細胞與脾細胞1:10混和，通過聚乙二醇(PEG)法以獲得雜交瘤細胞，命名為1-1和2-1。所獲得的雜交瘤細胞懸浮在含有飼養細胞的HAT培養基中，然後加入到96孔板中，在37°C，5% CO2的培養箱中封閉培養12天；
[0059]實施例3:單克隆抗體的製備及篩選
[0060]1、單克隆抗體的製備
[0061]從實施例2中所獲得的雜交瘤細胞的孔格中回收培養基的上清液，選取在ELISA方法中與抗原多肽反應的單克隆抗體。
[0062]2、單克隆抗體的篩選
[0063](I)將IOOuL濃度為10U/ml的CA 199到96孔板的每個孔格中，於4 °C過夜後使其固定於固相；
[0064](2)用150uL濃度為1%的牛血清白蛋白進行封閉2h ；
[0065](3)將IOOuL雜交瘤細胞的培養基上清液加入到每個孔格中，於37°C反應2h，然後加入稀釋10000倍的辣根過氧化物酶偶聯的羊抗鼠抗體於37°C反應Ih ；
[0066](4)使用四甲基聯苯胺微孔過氧化物酶底物(TMB)作為底物進行顯色20min ；
[0067](5)添加50uL濃度為0.2N的硫酸終止反應後，測量450nm的吸光度；
[0068](6)選出吸光度大約為3的1-1和2-1，並通過有限稀釋法進行亞克隆。
[0069]3、單克隆抗體的大量製備及和純化
[0070]將亞克隆後的細胞用細胞培養轉瓶進行擴大培養，約20天後，收集上清，用葡萄球菌A蛋白(Protein A)進行親和層析純化。得到的單克隆抗體分別命名為1_1與2_1。
[0071]4、單克隆抗體效價的測定
[0072]所篩選出的2株單克隆抗體的效價通過ELISA方法來測定。分別加入1_1、2_1(10ug/mL)，在反應後，使用辣根過氧化物酶偶聯的抗-小鼠抗體與TMB進行顯色，結果如圖1所示兩株單克隆抗體的效價達到10_9以上。
[0073]實施例4:單克隆抗體的標記及滴度的測定
[0074]將純化出的抗體按常規方法進行HRP標記，標記好的單克隆抗體的滴度通過下面的方法測定，將濃度為10U/mL的CA199固定在96孔微板上(IOOuL/孔)。使用1%的牛血清白蛋白進行封閉2h，加標記 的單克隆抗體(第一孔100倍稀釋)，從第二孔開始4倍稀釋，於室溫下反應lh。添加TMB後，反應在室溫下進行20min，用0.2N的硫酸中止反應。測量在450nm的吸光度，HRP標記的單克隆抗體的滴度結果如圖2所示。
[0075]實施例5:雙抗體夾心ELISA檢測CA199方法的建立
[0076](I)以所述的兩兩配對的單克隆抗體1-1包被，2ug/ml的單克隆抗體以IOOuL/孔加到微孔板上，於4°C孵育24h固定於固相；
[0077](2)微孔板使用含有0.l%Tween-20的pH值為1.4的20mM PBS以200uL/孔的量洗2次。以150uL/孔的量加入1%牛血清白蛋白進行封閉2h。
[0078](3)微孔板用PBST以200uL/孔的量洗4次，加入由起始濃度10ug/ml連續4倍稀釋CA199，於室溫溫育2h，然後加入標記HRP的另一株抗體2_1 (1:5000 ;100uL/孔)並於
室溫溫育2h。
[0079](4)添加TMB後，反應在室溫下進行20min，加入0.2N的硫酸中止反應並測量450nm的吸光度。
[0080]( 5 )檢測結果見附圖3所示。
[0081]實施例6:製備本發明的CA199定量測定試劑盒(化學發光法)
[0082](一)高碘酸鈉氧化法標記辣根過氧化酶
[0083]( I)酶的氧化(全過程避光)
[0084]稱取3_5mg HRP 溶解於 600 μ L ddH202 中；
[0085]b、加入新鮮配製的 150uL 0.1M 高碘酸鈉(NaIO4) (MW:213.89g/mol，取 0.22g 溶解於IOmL IOmM pH7.0磷酸鈉緩衝液中)；
[0086]C、混勻，室溫,避光孵育20min ;
[0087]d、將溶液用透析管透析,3000rpm/min,4°C, 20min,溶液為1.0mM pH4.0醋酸鈉緩衝液，換3-4次；
[0088]e、最後透析至800 μ L，至EP管中；
[0089](2)抗體的準備和標記(避光)
[0090]a、取準備好的3mg單抗，用離心管濃縮成500 μ L-1000 μ L體積，吸出於新的15mL離心管中；
[0091]b、加入500 μ L 0.2Μ ρΗ9.5碳酸鹽緩衝液，混勻，檢測pH值在9.0~9.5 ;
[0092]C、立即將透析好的HRP溶液與單抗溶液混合，室溫搖晃2h，避光；
[0093]d、加入 80 μ L 新鮮配製的 NaBH4 (4.0mg/mL,取 40mg 溶解於 IOmL ddH202 中)；
[0094]e、混勻(避光)，4°C孵育 1.5h ;
[0095]f、用PBS透析至體積為2mL ；
[0096]g、加入等體積甘油，ImL/管，_20°C保存
[0097](二)酶標抗體工作液的配製
[0098](I)酶標稀釋液的配製
【權利要求】
1.抗CA199的雜交瘤細胞株，其保藏號分別為CCTCCC201405和CCTCC C201406。
2.抗CA199的單克隆抗體，分別由保藏號為CCTCCC201405和CCTCC C201406的雜交瘤細胞系所分泌，所述單克隆抗體命名為1-1和2-1。
3.如權利要求2所述的抗CA199單克隆抗體的應用，即利用所述的單克隆抗體的雙抗體夾心法ELISA檢測CA199，夾心法兩兩配對的抗體來源於保藏號為CCTCC C201405雜交瘤分泌的抗體1-1和保藏號為CCTCC C201406雜交瘤分泌的抗體2_1，其步驟包括: (O以所述的兩兩配對的單克隆抗體1-ι包被； (2)加入待測樣品孵育； (3)以所述的兩兩配對的HRP標記的另一株單克隆抗體2-1作為二抗，加入反應體系； (4)洗滌後加入酶反應底物，以450nm讀取OD值； (5)結果表明檢測的靈敏度很高。
4.一種檢測血清中CA199含量的試劑盒，包括:包被有抗CA199單克隆抗體1_1的不透明聚苯乙烯板；CA199抗原系列標準品；酶標記的CA199單克隆抗體2_1 ;上述酶所作用的化學發光底物A液和B液以及洗滌液。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於:不透明聚苯乙烯板採用直接物理吸附法包被單克隆抗體1-1，包被液是磷酸鹽緩衝液；另一株CA 199單克隆抗體2-1和辣根過氧化酶偶聯形成酶標記抗體，採用的是改良的過碘酸鈉法進行標記；CA199抗原系列標準品以小牛血清為基質，加入CA 199抗原純品配置而成；發光底物A、B為HRP-Luminol發光體系。
6.如權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於:標記抗體所用的標記酶是辣根過氧化酶，用的是高碘酸鈉氧化法，所得酶標記抗體最佳的工作濃度是1:2000 ;包被有抗CA199抗體的不透明聚苯乙烯板採用的是直接物理吸附法包被；發光液A液用硼砂7.99g，硼酸3.46g，魯米諾0.28g，對碘苯酚0.07g,加工藝用水定容至700mL，避光保存；發光底物B液由下列成分組成:硼砂7.99g,硼酸3.46g,過氧化脲0.07g加工藝用水定容至700mL。
7.如權利要求4-6所述試劑盒的製備方法，包括以下步驟: (1)標準品的配製和濃度的校正 將CA199抗原純品，加入標準品稀釋液，配製一高濃度標準品濃液，採用逐低稀釋的方法稀釋到各濃度，配製成O、10、50、100、400、1000U/mL的系列標準品，標準品用國家標準品校正。 (2)包被 採用0.5mol/L,pH值為9.5的磷酸鹽緩衝液與CA199單抗混合成抗體濃度是2 μ g/mL包被液，以100 μ L/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上，4°C孵育過夜； (3)洗板 用PBS-T洗液洗板孔2次； (4)封閉
封閉液包含 NaC18.00g, KC10.20g, Na2HPO4.12H202.90g, KH2PO40.20g,蔗糖 20.0Og,proclin300 1.00mL，BSA20.00g，封閉液的PH值為7.3-7.5，150 μ L/孔封閉，溼盒放置孵育3h ； (5)乾燥 去除封閉液，過夜乾燥。(6)組裝為成品將聚苯乙烯板子放入鋁箔袋中並放入乾燥劑， 密封保存。
【文檔編號】G01N33/577GK103773737SQ201410016531
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】藍興國, 李玉花, 李曉嶼, 張天沛, 曹領改 申請人:東北林業大學, 東北林業大學大慶生物技術研究院, 李玉花