豬圓環病毒2型抗原或抗體檢測試紙條的製作方法
2023-12-01 04:50:26
專利名稱：豬圓環病毒2型抗原或抗體檢測試紙條的製作方法
技術領域：
本實用新型屬於生物技術領域，涉及一種快速診斷器具，特別是涉及一種豬圓環病毒2型(PCV2)抗原或抗體檢測試紙條。
背景技術：
PCV2是引發豬斷奶仔豬多系統衰竭症候群(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，該病主要以患畜生長遲緩、進行性消瘦和多系統病理損傷為特徵。除了引發PMWS外，PCV2還與豬皮炎與腎病症候群、新生仔豬先天性腦震顫、增生性壞死肺炎以及懷孕母豬的繁殖障礙等病的發生有關。目前認為，PCV2可誘發一系列的圓環病毒病。自1996年在加拿大首次發現PMWS以來，PCV2感染引起的相關疾病已在全世界廣泛存在，我國也不例外，給世界養豬業造成了巨大的經濟損失。根據PMWS的流行病學，臨床症狀和剖檢病理變化可對PCV2感染作出初步診斷，但確診仍需要以實驗室診斷技術檢測PCV2抗原及其抗體。PCV2的衣殼蛋白是該病毒的主要免疫原，檢測PCV2衣殼蛋白抗體從而可反映PCV2的抗體水平。對豬群PCV2抗體水平進行監測，可確切了解豬體免疫水平或感染狀況，制定最適免疫程序或淘汰選育，有效預防和控制PCV2的侵襲和傳播，避免因此而引起的重大經濟損失。
目前，國內外採用的PCV2檢測技術主要有病毒分離培養，間接免疫螢光(IFA)，免疫酶單層試驗(IMPA)，原位雜交(ISH)，聚合酶鏈式反應(PCR)等等。上述技術和方法雖然可以檢測PCV2及其抗體水平，在實踐中也取得一定的效果，但均存在試驗操作複雜，耗時長，需要特定的專業技能和儀器設備等，成本昂貴，常限於實驗室內進行，很難在基層普及和推廣。因此，研製開發適用於養殖基層的快捷、簡便的PCV2抗體檢測器具，對豬群PCV2免疫水平進行實時監測，建立科學的、靈活的豬群疫病免疫程序，對疫病的預防和控制有重要意義。
發明內容
本實用新型的目的是克服上述已知技術存在的不足，提供一種豬圓環病毒2型(PCV2)抗原或抗體檢測試紙條。可有效檢測豬的PCV2抗原或抗體，用於PCV2感染的抗原、抗體診斷。
本設計的豬圓環病毒2型抗原或抗體檢測試紙條由支撐層1、反應試劑載體吸附層和覆蓋的保護膜所組成；所述支撐層為不吸水薄片層，反應試劑載體吸附層固定在支撐層上，反應試劑載體吸附層從樣品端依次為樣品纖維層2、金標纖維層3、纖維素膜層4、手柄端吸水材料層5，在纖維素膜層4上印製有條狀的檢測印跡6和條狀的對照印跡7。
所說不吸水薄片層的支撐層採用的是硬質塑膠片條，或不吸水的硬紙條，樣品纖維層採用玻璃棉，手柄端吸水材料層採用吸水紙，纖維素膜層採用硝酸纖維素膜，金標纖維層採用吸附金標蛋白的玻璃棉，在樣品纖維層與金標纖維層及手柄端吸水材料層上覆蓋有保護膜，在樣品纖維層與金標纖維層交界處的保護膜上偏向樣品纖維層一側0.5cm處印製樣品標記線。
用於抗原檢測的試紙條的所述玻璃棉吸附的金標蛋白為膠體金標記抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb1，在纖維素膜層上的檢測印跡6為抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb2，對照印跡7為山羊抗小鼠IgG多克隆抗體。
用於抗體檢測試紙條的所述玻璃棉吸附的金標蛋白為膠體金標記重組PCV2去核定位信號衣殼蛋白，在纖維素膜層上的檢測印跡6為山羊抗豬IgG多克隆抗體，對照印跡7為抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb1。
所說的重組PCV2去核定位信號衣殼蛋白為利用原核高效表達系統表達和純化的基因工程重組蛋白，可與PCV2陽性血清特異結合。
所說的抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體特異識別PCV2衣殼蛋白，與豬圓環病毒1型衣殼蛋白無交叉反應，可有效區分豬圓環病毒1型和2型病毒。
本實用新型有益的積極效果是PCV2抗原或抗體檢測試紙條操作簡單，人人都可操作，能較好滿足不同層次人員的需要，如疫病監測、海關檢疫、衛生防疫、集約化養殖到個體養殖等，易於大範圍推廣應用，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。PCV2抗原或抗體檢測試紙條具有下列各項優點(1)特異性強，敏感性高。PCV2抗原或抗體檢測試紙條以抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體或重組表達的PCV2去核定位信號衣殼蛋白為基礎製備而成；單克隆抗體為高親和力的抗PCV2衣殼蛋白特異性均質抗體，特異識別PCV2衣殼蛋白，與PCV1無交叉反應；重組去核定位信號衣殼蛋白蛋白為非全病毒抗原、安全性好，不含無關雜蛋白，具有良好抗原性，因此具有很高的特異性和敏感性。
(2)操作簡便快速。使用PCV2抗原或抗體檢測試紙條檢測PCV2抗原或抗體時，無需另配其它試劑，在2-10分鐘內即可判定檢測結果。
(3)顯示檢測結果形象、直觀準確。PCV2抗原或抗體檢測試紙條以一條紅棕色條狀印跡和兩條紅棕色條狀印跡作為檢測的陰性和陽性標記，即在纖維素膜上顯示一條棕紅色「|」印跡表示在被檢測樣品液中PCV2病毒或抗體為陰性，兩條棕紅色「||」印跡表示在被檢樣品中PCV2病毒或抗體為陽性，結果判定形象、直觀、準確，簡單明了，不易出現假陰性和假陽性誤判。
(4)成本低，投資少。PCV2抗原或抗體檢測試紙條可在檢測現場完成操作，檢測一步到位，成本低廉，投資少，見效快。
圖1是PCV2抗原及抗體檢測試紙條側視結構示意圖；圖2是PCV2抗原及抗體檢測試紙條俯視結構示意圖，圖中支撐層1，樣品端纖維層2，金標玻璃棉3，纖維素膜層4，手柄端吸水材料層5，檢測印跡6，對照印跡7，樣品端保護膜8，標記線9，手柄端保護膜10。
具體實施方式
本實用新型的技術方案是一種PCV2抗原或抗體檢測試紙條，具有支撐層1，反應試劑載體吸附層，支撐層為不吸水薄片層，吸附層固定在支撐層上，吸附層從樣品端依次為纖維層2，金標纖維層3，纖維素膜層4，手柄端為吸水材料層5，在纖維素膜層4上印製有檢測印跡「|」6和對照印跡「|」7，其排列組合為「||」。不吸水的支撐層薄片層用硬質塑膠片條，或不吸水的硬紙條，纖維層用玻璃棉，吸水材料層用吸水紙，纖維素膜層用硝酸纖維素膜，金標纖維層用吸附金標蛋白的玻璃棉，在玻璃棉與金標玻璃棉及吸水紙層上覆蓋有保護膜，在玻璃棉與金標玻璃棉交界處對應的保護膜偏向玻璃棉一側0.5cm處印製樣品標記線。
PCV2抗原檢測試紙條的金標蛋白為膠體金標記抗PCV2 dCap蛋白單克隆抗體mAb1，在纖維素膜層上的檢測印跡6為抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb2，對照印跡7為山羊抗小鼠IgG多克隆抗體，PCV2抗體檢測試紙條的金標蛋白為膠體金標記PCV2重組去核定位信號衣殼蛋白，在纖維素膜層上的檢測印跡6為山羊抗豬IgG多克隆抗體，對照印跡7為抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb1。
PCV2抗原或抗體檢測試紙條的實施結構PCV2抗原或抗體檢測試紙條實施結構參見圖1，圖2。圖中，1為支撐層用不吸水薄片條，實施中可採用塑膠薄片條或採用不吸水的硬質紙片材，反應試劑載體吸附層由2，3，4，5，組合而成，從樣品端2開始，到手柄端5依次粘貼在支撐層1上面；其中2為樣品端纖維層，實施中可使用玻璃纖維棉簡稱玻璃棉，3為吸附金標蛋白的纖維層，可採用精製玻璃纖維棉，簡稱為金標玻璃棉，4為纖維素膜層，實施中可採用硝酸纖維素膜，5為手柄端吸水材料層，採用吸水紙，如濾紙或其它吸水紙均可，試紙條總長8cm，寬度0.4cm，6為用抗PCV2dCap單克隆抗體mAb2或山羊抗豬IgG多克隆抗體在硝酸纖維素膜上印製的檢測印跡「|」，7為用山羊抗小鼠IgG多克隆抗體或抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb1在硝酸纖維素膜上印製的對照印跡「|」，在纖維素膜層上的檢測印跡和對照印跡組合排列為「||」。8，10為保護膜，覆蓋在玻璃棉及金標玻璃棉的保護膜為8，在玻璃棉和金標玻璃棉交界處對應位置的白色保護膜上偏向玻璃棉一方0.5cm處的保護膜上印有一條標記線9，在標記線9右邊印有箭頭和Max字樣，覆蓋在吸水層濾紙上的保護膜為10，保護膜可用黃色或其它顏色，2，3，4，5各層彼此之間交界處纖維互相交叉滲透。
PCV2抗原或抗體檢測試紙條實施檢測反應原理PCV2抗原檢測試紙條檢測反應原理為PCV2抗原檢測試紙條樣品端插入待檢測樣品溶液後，待檢溶液通過虹吸帶動待檢抗原與金標蛋白一起向硝酸纖維素膜擴散，並最終滲透到濾紙層中，在擴散過程中待檢抗原與金標蛋白相結合，形成金標蛋白-抗原複合物，該複合物可與檢測印跡中的抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb2相結合，生成紅棕色「|」標記，部分未與抗體結合的金標蛋白不能與檢測印跡結合而繼續擴散，在纖維膜上與對照印跡中的山羊抗小鼠IgG多克隆抗體結合，生成紅棕色標記「|」兩種標記組合疊加，形成兩條紅棕色陽性標記「||」，反之只有金標蛋白與對照印跡相結合，沒有金標蛋白-抗原複合物形成，不能與檢測印跡結合，則生成陰性標記「|」。如果纖維素膜上沒有紅棕色標記顯示，則表明試紙條已失效。
PCV2抗體檢測試紙條檢測反應原理為PCV2抗體檢測試紙條樣品端插入待檢測樣品溶液後，待檢溶液通過虹吸帶動待檢抗體與金標蛋白一起向硝酸纖維素膜擴散，並最終滲透到濾紙層中，在擴散過程中待檢抗體與金標蛋白相結合，形成金標蛋白-抗體複合物，該複合物可與檢測印跡中的山羊抗豬IgG多克隆抗體相結合，生成紅棕色「|」標記，部分未與抗體結合的金標蛋白不能與檢測印跡結合而繼續擴散，在纖維膜上與對照印跡中的抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb1結合，生成紅棕色標記「|」兩種標記組合疊加，形成兩條紅棕色陽性標記「||」，反之只有金標蛋白與對照印跡相結合，沒有金標蛋白抗體複合物形成，不能與檢測印跡結合，則生成陰性標記「|」。如果纖維素膜上沒有紅棕色標記顯示，則表明試紙條已失效。
PCV2抗原或抗體檢測試紙條檢測實例操作方法檢測樣品溶液的製備採集待檢豬淋巴結，脾，肺或血清，以樣品稀釋液或生理鹽水1∶5，1∶10，1∶20倍比稀釋，製備梯度稀釋樣品溶液。
PCV2抗原或抗體檢測試紙條檢測實例操作方法將PCV2抗原或抗體檢測試紙條樣品端分別插入梯度稀釋待檢測樣品液中，插入深度不超過標記線9，約10秒後取出檢測試紙條，水平放置約2分鐘，觀察結果，在纖維素膜上顯現兩條紅棕色標記「||」表示檢測結果呈陽性，顯現一條標記「|」為陰性，檢測試紙條呈陽性的樣品最大稀釋度為待檢樣品的抗原或抗體滴度，如果檢測試紙條在待檢樣品各個稀釋度均呈陰性，則表明待檢樣品中不含PCV2病毒或抗體，如果檢測試紙條沒有標記顯示，則表明試紙條失效。
實施例1 PCV2抗原檢測試紙條使用PCV2抗原檢測試紙條檢測豬PCV2感染時，採集待檢豬肉樣或病變組織，充分研磨後，以生理鹽水1∶10或1∶20稀釋，製備待檢樣品溶液，將PCV2抗原檢測試紙條樣品端插入待檢測樣品液中，插入深度不超過標記線9，約10秒後取出檢測試紙條，水平放置約2分鐘，觀察結果，在纖維素膜上顯現兩條紅棕色標記「||」的樣品為PCV2陽性，表明待檢樣品感染PCV2，顯現一條標記「|」為PCV2陰性，則表明待檢樣品沒有PCV2感染，如果檢測試紙條沒有標記顯示，則表明試紙條失效。
實施例2 PCV2抗體檢測試紙條使用PCV2抗體檢測試紙條檢測豬血清PCV2抗體水平時，採集待檢豬血液，分離血清，以生理鹽水1∶10，1∶20，1∶40倍比稀釋，製備梯度稀釋樣品溶液，將PCV2抗體檢測試紙條樣品端分別插入梯度稀釋待檢測樣品液中，插入深度不超過標記線9，約10秒後取出檢測試紙條，水平放置約2分鐘，觀察結果，在纖維素膜上顯現兩條紅棕色標記「||」的樣品為PCV2抗體陽性，顯現一條標記「|」為PCV2抗體陰性，PCV2陽性的樣品最大稀釋度即為待檢血清樣品的PCV2抗體滴度，如果檢測試紙條在待檢血清各個稀釋度均呈陰性，則表明待檢血清不含PCV2抗體，如果檢測試紙條沒有標記顯示，則表明試紙條失效。
權利要求1.豬圓環病毒2型抗原或抗體檢測試紙條，其特徵在於它由支撐層(1)、反應試劑載體吸附層和覆蓋的保護膜所組成；所述支撐層為不吸水薄片層，反應試劑載體吸附層固定在支撐層上，反應試劑載體吸附層從樣品端依次為樣品纖維層(2)、金標纖維層(3)、纖維素膜層(4)、手柄端吸水材料層(5)，在纖維素膜層(4)上印製有條狀的檢測印跡(6)和條狀的對照印跡(7)。
2.根據權利要求1所述豬圓環病毒2型抗原或抗體檢測試紙條，其特徵在於所說不吸水薄片層的支撐層採用的是硬質塑膠片條，或不吸水的硬紙條，樣品纖維層採用玻璃棉，手柄端吸水材料層採用吸水紙，纖維素膜層採用硝酸纖維素膜，金標纖維層採用吸附金標蛋白的玻璃棉，在樣品纖維層與金標纖維層及手柄端吸水材料層上覆蓋有保護膜，在樣品纖維層與金標纖維層交界處的保護膜上偏向樣品纖維層一側0.5cm處印製樣品標記線。
3.根據權利要求1或2所述的豬圓環病毒2型抗原或抗體檢測試紙條，其特徵在於用於抗原檢測的試紙條的所述玻璃棉吸附的金標蛋白為膠體金標記抗豬圓環病毒2型衣殼蛋白單克隆抗體mAb1，在纖維素膜層上的檢測印跡(6)為抗豬圓環病毒2型衣殼蛋白單克隆抗體mAb2，對照印跡(7)為山羊抗小鼠IgG多克隆抗體。
4.根據權利要求1或2所述的豬圓環病毒2型抗原或抗體檢測試紙條，其特徵在於用於抗體檢測試紙條的所述玻璃棉吸附的金標蛋白為膠體金標記重組豬圓環病毒2型去核定位信號衣殼蛋白，在纖維素膜層上的檢測印跡(6)為山羊抗豬IgG多克隆抗體，對照印跡(7)為抗豬圓環病毒2型衣殼蛋白單克隆抗體mAb1。
5.根據權利要求3或4所述的豬圓環病毒2型抗原或抗體檢測試紙條，其特徵在於所說的重組豬圓環病毒2型去核定位信號衣殼蛋白為利用原核高效表達系統表達和純化的基因工程重組蛋白，可與豬圓環病毒2型陽性血清特異結合。
6.根據權利要求3或4所述的豬圓環病毒2型抗原或抗體檢測試紙條，其特徵在於所說的抗豬圓環病毒2型衣殼蛋白單克隆抗體特異識別豬圓環病毒2型衣殼蛋白，與豬圓環病毒1型衣殼蛋白無交叉反應，可有效區分豬圓環病毒1型和2型病毒。
專利摘要本實用新型提供一種豬圓環病毒2型(PCV2)抗原或抗體檢測試紙條。本設計的檢測試紙條由不吸水薄片的支撐層、反應試劑載體吸附層和覆蓋的保護膜所組成。反應試劑載體吸附層從樣品端依次為採用玻璃棉的樣品纖維層、吸附金標蛋白(抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb1或去核定位信號衣殼蛋白)的纖維層、印製檢測印跡(抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb2或山羊抗豬IgG多克隆抗體)和對照印跡(山羊抗小鼠IgG多克隆抗體或抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb1)的纖維素膜層、手柄端吸水材料層，在樣品纖維層與金標纖維層交界處的保護膜上印製樣品標記線。本實用新型用於PCV2抗原或抗體檢測操作簡單，能較好滿足不同層次人員的需要。
文檔編號G01N33/558GK2911690SQ20062010442
公開日2007年6月13日 申請日期2006年6月7日 優先權日2006年6月7日
發明者周繼勇, 郭軍慶, 商紹彬, 申會剛 申請人:浙江大學