一種日本血吸蟲病疫苗聯合免疫方法及應用的製作方法
2023-12-01 01:31:16
一種日本血吸蟲病疫苗聯合免疫方法及應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種日本血吸蟲病疫苗聯合免疫方法及應用，屬於血吸蟲病防治領域。該免疫方案中首先採用含優化後日本血吸蟲磷酸丙糖異構酶基因(SjTPI.opt)的重組腺病毒疫苗(rAdV-SjTPI.opt)經肌肉途徑進行初次免疫，再用重組蛋白蛋白疫苗(rSjTPI)經皮下途徑進行加強免疫，免疫間隔時間為2周。該免疫方案具有預防日本血吸蟲感染的效果，免疫動物後可誘導宿主產生較高水平的體液、細胞免疫應答，保護力可到達70％的水平。同時該方案中，兩種疫苗製備簡單、免疫操作方便，具備良好的應用前景。
【專利說明】一種日本血吸蟲病疫苗聯合免疫方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及血吸蟲病防治領域，特別涉及一種日本血吸蟲病疫苗聯合免疫方法及 應用。
【背景技術】
[0002] 血吸蟲病是一種危害嚴重的被忽視熱帶病。截至2011年，血吸蟲病仍流行於全球 的78個國家和地區，感染人口達2. 43億，有約7. 79億人受到該病的威脅。感染人體的血吸 蟲主要包括埃及血吸蟲、曼氏血吸蟲、間插血吸蟲、日本血吸蟲及湄公血吸蟲，而我國是日 本血吸蟲病危害最嚴重的國家。經過多年積極有效的科學防治，血吸蟲病流行區被壓縮在 了湖區的湖南、湖北、江西、安徽、江蘇以及大山區的雲南、四川等省份，但由於日本血吸蟲 自然保蟲宿主多、中間宿主--釘螺分布廣且難以完全消滅、流行區地理條件複雜等因素， 給我國血吸蟲病的進一步防治造成了很大的困難。截至2012年底，我國仍有血吸蟲病人約 24. 06萬例，流行區受感染威脅的存欄耕牛數達119萬頭。因此，血吸蟲病在我國的流行形 勢仍然十分嚴峻。
[0003] 傳染性疾病控制經驗顯示，疫苗是目前人類可以徹底控制某一傳染病的關鍵武 器，具有長效、安全、經濟等優勢。如有可能研發高效的血吸蟲病疫苗，將可有助於進一步控 制血吸蟲病。鑑於血吸蟲在其終末宿主體內不繁殖，減少感染後宿主體內的成蟲及蟲卵負 荷，就可有效地減輕血吸蟲蟲卵對宿主肝臟造成的免疫病理損傷，減少血吸蟲蟲卵對環境 的汙染，降低血吸蟲病傳播的風險。因此，世界衛生組織提出，如果一種疫苗可使宿主體內 的蟲荷下降50%，就可有效控制血吸蟲病的傳播。近年來，日本血吸蟲病疫苗進行了較多的 研究，動物模型中發現，僅可誘導部分免疫保護作用，減蟲率低於或不能穩定的達到50%， 因此，如何進一步提高疫苗的免疫保護作用，是血吸蟲病疫苗研究的關鍵。
[0004] 近年來研究發現，採用不同種疫苗進行聯合免疫的方案可顯著提高疫苗的免疫保 護效果，顯示了廣泛的應用前景。該方案中不同種疫苗均針對同一個保護性抗原分子，但採 用不同的疫苗形式或載體，常見的有DNA疫苗初次免疫一蛋白疫苗加強免疫、兩種不同病 毒載體疫苗進行聯合免疫等。在血吸蟲病疫苗研究中，僅見有DNA疫苗和蛋白疫苗聯合免 疫、口服疫苗和蛋白疫苗聯合免疫的報導。而本發明中的免疫方案在血吸蟲病疫苗研究領 域還未見報導。
【發明內容】
[0005] 為解決上述現有技術存在的問題，本發明的目的之一在於提供一種日本血吸蟲病 疫苗聯合免疫方法及應用，該方法中初次及加強免疫的疫苗分別為重組腺病毒疫苗及重組 蛋白疫苗，針對的保護性抗原均為日本血吸蟲磷酸丙糖異構酶分子；該發明方法首次建立 了以重組腺病毒疫苗初次免疫一重組蛋白疫苗加強免疫的聯合免疫方案，為血吸蟲病的防 治提供了一種新型、高效的策略。該方案中兩種疫苗免疫動物後具有較高的安全性，且可誘 導動物產生較高水平的體液、細胞免疫應答，保護力可到達70%的水平。同時該方案中，兩 種疫苗製備簡單、免疫操作方便，因此具備良好的應用前景。
[0006] 為達到上述目的，本發明的技術方案：
[0007] -種日本血吸蟲病疫苗聯合免疫方法，採用含保護性抗原的重組腺病毒疫苗和重 組蛋白疫苗分別進行初次免疫和加強免疫，聯合免疫方案為V+V+V+P ;
[0008] 所述的保護性抗原基因為密碼子優化後的日本血吸蟲中國大陸株磷酸丙糖異構 酶基因 SjTPI. opt ;
[0009] 所述的重組腺病毒疫苗為rAdV-SjTPI. opt，載體為E1、E3聯合缺失的複製缺陷型 人5型腺病毒Ad5 ;
[0010] 所述的重組蛋白疫苗為原核表達純化獲得的rSjTPI與福氏完全佐劑的乳化物。
[0011] 進一步的，所述的重組腺病毒疫苗的免疫途徑為肌肉免疫途徑，每次的免疫劑量 為 5*109pfu/kg 體重；
[0012] 所述的重組蛋白疫苗的免疫途徑為皮下免疫途徑,每次的免疫劑量為5mg/kg體 重；
[0013] 進一步的，所述的免疫方案中的免疫間隔時間為2周。
[0014] 上述任一所述的疫苗聯合免疫方法在血吸蟲病防治中的應用。其具有預防日本血 吸蟲感染的效果，該免疫方案免疫動物後，能夠誘導宿主產生較高水平的體液及細胞免疫 應答，保護力可達到70%的水平。
[0015] 相對於現有技術，本發明的有益效果為：
[0016] 本發明首次建立了以重組腺病毒疫苗初次免疫一重組蛋白疫苗加強免疫的聯合 免疫方案，為血吸蟲病的防治提供了一種新型、高效的策略。該方案中兩種疫苗免疫動物後 具有較高的安全性，且可誘導動物產生較高水平的體液、細胞免疫應答，保護力可到達70% 的水平。同時該方案中，兩種疫苗製備簡單、免疫操作方便，因此具備良好的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017] 圖1各組小鼠誘導產生的特異性IgG應答檢測結果，其中A為IgG檢測結果；B為 IgG滴度結果；C為IgG亞類檢測結果；D為IgG親和力結果；
[0018] 圖2各組小鼠脾細胞培養上清中各種細胞因子檢測結果，其中，A為IL-2、B為 IFN-γ、C為TNF，D為IL-6、E為IL-KKF為IL-17A，mock為未進行刺激的檢測結果；rSjTPI 為特異性蛋白刺激的檢測結果；
[0019] 圖3各組小鼠感染後肝臟中單個蟲卵肉芽腫面積結果。
[0020] 圖4為保護性抗原基因序列（SjTPI. opt)。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合附圖及【具體實施方式】對本發明技術方案做進一步詳細描述：
[0022] 試驗例：
[0023] 1、疫苗製備
[0024] 重組腺病毒疫苗（rAdV-SjTPI. opt)構建及製備
[0025] 重組腺病毒疫苗製備方法：
[0026] 重組腺病毒的構建
[0027] (I)SjTPI. opt基因的擴增及穿梭載體的構建以實驗室前期構建並保存的質粒 pcDNA3. 1-SjTPI. opt 為模板，根據 SjTPI. opt 基因序列，用軟體Primer Premier5. 0 設ii 對引物，在引物的5'端分別引入Sail和XhoI酶切位點：
[0028] P1:5，-GTCGACATGAGCAGCAGCCGGAAGTTC
[0029] P2:5，-CTCGAGTCACTGCCGGGCCTTGCAGAT
[0030] 以Pl和P2為上下遊引物擴增出了 SjTPI. opt的全基因序列，大小為759bp，通過 雙酶切將該基因克隆入穿梭載體PShuttle-CMV中，經酶切及PCR鑑定後獲得含SjTPI基因 的穿梭質粒 pShuttle-CMV/SjTPI. opt ;
[0031] (2)含SjTPI基因的穿梭載體（PShuttle-CMV)與腺病毒骨架載體（pAdEasy-1)同 源重組鑑定好的上述穿梭質粒經PmeI線性化後與腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι經電轉化方 法轉化入大腸桿菌BJ5183,並發生同源重組，經100 μ g/ml卡那黴素篩選及酶切鑑定獲得 含SjTPI. opt基因的重組腺病毒質粒；
[0032] (3)重組腺病毒疫苗的包裝鑑定成功的上述重組腺病毒質粒，PacI線性化後，經 脂質體法轉染293細胞，重組腺病毒質粒在其內完成包裝獲得重組腺病毒rAd-SjTPI. opt ;
[0033] 重組腺病毒疫苗的製備
[0034] 1)收毒：當轉染的細胞出現特徵病變（局部細胞變圓、脫落，成網狀）或細胞狀態 不足以維持時，反覆凍融細胞，一 20°C凍存收穫病毒；
[0035] 2)重組腺病毒的擴增
[0036] 用上述方法收穫的病毒反覆感染293細胞，擴增該重組病毒，當細胞出現病變效 應後，收集細胞培養上清，用於重組病毒的純化；
[0037] 3)重組腺病毒的純化
[0038] 按Adeno-X? Virus Purification Kit (BD Biosciences, Clontech)的步驟純化重 組腺病毒，並測定病毒的滴度。
[0039] 保護性抗原基因序列（SjTPI. opt)如圖4所示。
[0040] 重組蛋白疫苗（rSjTPI)製備，實驗室前期已成功構建了含目的基因的原核表達 質粒PGEX-4T-3/S jTPI，按照文獻2報導的方法進行誘導表達，用GST標籤蛋白純化試劑盒 (GE公司）純化融合蛋白，並用凝血酶（40U，Sigma公司）切割去除GST標籤後，獲得目的 蛋白rS jTPI，無菌PBS調整濃度至lmg/ml，加入等體積的福氏佐劑進行乳化，形成"油包水" 的狀態，即為重組蛋白疫苗。
[0041] 重組蛋白疫苗（rSjTPI)誘導表達具體操作如下：挑取單個菌落（含PGEX-4T-3/ 3奵卩1的乩21)接種5011111^培養基（含氨苄10(^8/1111)，371：，200印111培養過夜，次日1 :20 轉種至IOOOmlLB培養基中（含氨苄100 μ g/ml)，繼續培養至0D600約0. 8,加入終濃度為 0. ImM的IPTG25°C誘導，3. 5h，收集細菌6000g離心15min，菌體用PBS洗滌2次後用50ml 細菌裂解液重懸細菌，37°C水浴裂解30min後，進一步超聲破碎細菌（超聲條件：300W，超聲 10S，間隔20S，6次），4°C條件下，15000g離心30min收集上清，用於蛋白純化；
[0042] 蛋白純化採用GST融合蛋白純化試劑盒進行，具體操作如下：過濾柱中加入2ml 床體積充分懸浮的穀胱甘肽樹脂（Glutathione reisn)，用10倍柱體積的4°C預冷的PBS 洗柱，將收集的細菌裂解上清過柱，流速控制在l〇_15cm/h，待完全過柱後，用20倍柱體 積的4°C預冷的PBS洗柱，然後將樹脂充分懸浮於預冷的PBS中加入凝血酶（10U/mg蛋 白）25°C水浴，切割作用16h，收集濾液獲得重組目的蛋白（rSjTPI)。將純化後的重組蛋 白加入透析袋中，4°C於2000ml PBS中透析12-16h，中間換液2-3次；透析袋預處理：先 用含2% NaHC03, IOmM EDTA溶液（pH8. 0)煮沸lOmin，去離子水清洗透析袋，再用含ImM EDTA(pH8. 0)溶液煮沸lOmin，去離子水清洗後方可使用。透析後的rSjTPI經蛋白濃度測 定試劑盒（BCA法）測定其濃度。重組蛋白用無菌PBS調整濃度至lmg/ml，加入等體積的福 氏佐劑進行乳化，形成"油包水"的狀態，即為重組蛋白疫苗。
[0043] 將獲得的重組腺病毒顆粒用無菌的PBS(0.01mol/L)調整濃度至l*109pfu/ ml，-130°C保存備用；
[0044] 2、實驗動物分組及免疫
[0045] 6周齡的雌性BALB/c小鼠，隨機分成5組，分別為空白對照組（Control)、腺病毒 載體對照組（Ad vector, i. m.)、腺病毒疫苗肌肉免疫組（rAdV-SjTPI. opt, i. m.)、蛋白疫苗 皮下免疫組 CrSjTPI，s. c.)和聯合免疫組（rAdV-SjTPI. opt i. m. +rSjTPI s. c.)，每組 16 只小鼠；
[0046] 免疫流程：聯合免疫組初次免疫3次，加強免疫1次，其他免疫組共免疫3次，免疫 間隔2周；
[0047] 免疫方法及劑量：
[0048] 肌肉免疫時，小鼠需進行麻醉，麻醉劑為1%的戊巴比妥溶液（購自Merck公司）， 麻醉劑量按照60mg/kg小鼠體重進行，麻醉後，於小鼠兩後腿股四頭肌位置分別接種50 μ 1 的病毒疫苗；
[0049] 皮下免疫時，每鼠經背部皮下多點接種200μ 1的蛋白疫苗（含100μ 1的rSjTPI 和100 μ 1的佐劑）；
[0050] 3、免疫後特異性IgG應答水平的檢測
[0051] 分別於首次免疫前及末次免疫後2周，經小鼠尾靜脈採血，並分離血清用於特異 性IgG應答水平檢測，包括IgG及其亞類水平、IgG親和力及IgG滴度；
[0052] IgG及其亞類水平檢測：
[0053] 採用間接ELISA法，包被抗原為5 μ g/mL的重組蛋白（rSjTPI)，血清1:100稀釋， 二抗分別為HRP標記的羊抗兔IgG、IgGl及IgG2a(均購自Southern Biotech公司），TMB 顯色液（購自KPL公司）顯色，2M硫酸終止反應後，測定0D450 ;
[0054] IgG親和力檢測：
[0055] 檢測方法同樣採用ELISA法，不同之處在於，每份血清做雙復孔，孵育後，一份用 含6M尿素的洗液洗板3次，每次10分鐘，另一份用常規洗液洗板3次，加入二抗及顯色後， 同時測定兩份中每孔的0D450值，計算IgG親和力指數（尿素處理後的0D450值/未處理 的 0D450 值）；
[0056] IgG滴度測定：
[0057] 檢測方法同上，不同之處在於每份待檢血清檢測時進行倍比稀釋，二抗孵育及顯 色後，測定各樣本不同稀釋度的0D450值，當該0D450值>免疫前血清0D450值的2. 1倍時 的稀釋度即為該樣本的滴度；
[0058] 檢測結果如圖1所示，聯合免疫組的IgG、IgG親和力及IgG滴度顯著高於重組腺 病毒疫苗免疫組，且IgGl和IgG2a均有顯著升高，IgG2a水平最高；
[0059] 4、免疫後特異性細胞因子水平檢測
[0060] 末次免疫後2周，每組隨機取4隻小鼠，無菌條件下取脾臟，製備單個脾細胞懸液， 調整細胞濃度至6*106個/ml，加入濃度為10 μ g/ml的重組蛋白（rTPI)進行刺激培養，培 養條件為37°C，5 % C02,用1640完全細胞培養液作為空白對照，刀豆蛋白A (ConA，5 μ g/mL) 作為陽性對照。細胞培養72h後，收集細胞培養上清，用於特異性細胞因子水平測定。細胞 因子測定採用Thl/Th2/Thl7Cytokine Kit(購自BD公司），操作按照說明書進行。
[0061] 實驗結果顯示，聯合免疫組誘導小鼠產生了較廣譜的細胞免疫應答，表現為脾細 胞上清中IL-2、IFN- γ、TNF等Thl型細胞因子，IL-6、IL-10等Th2型細胞因子及IL-17A 的水平均有明顯升高，具體結果見圖2。
[0062] 5、免疫保護效果的觀察
[0063] 於末次免疫後2周，所有小鼠經腹部貼片攻擊感染40條日本血吸蟲尾蚴，感染後 6周，剖殺小鼠，計數每隻小鼠體內的成蟲數，按照以下公式計算小鼠的減蟲率：
[0064] 減蟲率=(1 一實驗組成蟲數/對照組成蟲數）X 100%
[0065] 每隻小鼠摘取肝臟稱重，剪碎後加入5%氫氧化鉀溶液37°C消化24h，計算每克肝 髒組織中的蟲卵數，按以下計算減卵率：
[0066] 肝臟減卵率=(1 一實驗組每克肝臟蟲卵數/對照組每克肝臟蟲卵數）X 100%
[0067] 每隻小鼠的肝臟組織，進行石蠟切片HE染色後顯微鏡下觀察每隻小鼠肝臟中單 個蟲卵肉芽腫大小並計算其面積。
[0068] 實驗結果顯示，聯合免疫組小鼠體內的成蟲數、雌蟲數及肝臟蟲卵數顯著低於其 他各組，減蟲率、減雌率及肝臟減卵率可分別達到72. 09%、72. 73%及72. 13%，肝臟切片 觀察結果顯示，聯合免疫組小鼠肝臟內單個蟲卵肉芽腫面積顯著縮小，具體見圖3、表1及 表2。
[0069] 表1各組小鼠體內的成蟲及雌蟲結果
[0070]
[0071] ~表2各組小鼠肝臟中蟲卵結果^
【權利要求】
1. 一種日本血吸蟲病疫苗聯合免疫方法，其特徵在於，採用含保護性抗原的重組腺病 毒疫苗和重組蛋白疫苗分別進行初次免疫和加強免疫，聯合免疫方案為V+V+V+P ; 所述的保護性抗原基因為密碼子優化後的日本血吸蟲中國大陸株磷酸丙糖異構酶基 因 SjTPI. opt ; 所述的重組腺病毒疫苗為rAdV-SjTPI. opt，載體為El、E3聯合缺失的複製缺陷型人5 型腺病毒Ad5 ; 所述的重組蛋白疫苗為原核表達純化獲得的rSjTPI與福氏完全佐劑的乳化物。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的重組腺病毒疫苗的免疫途徑為肌 肉免疫途徑，每次的免疫劑量為5*109pfu/kg體重； 所述的重組蛋白疫苗的免疫途徑為皮下免疫途徑，每次的免疫劑量為5mg/kg體重。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述的免疫方案中的免疫間隔時間為2 周。
4. 上述任一權利要求所述的疫苗聯合免疫方法在血吸蟲病防治中的應用。
【文檔編號】A61P33/12GK104306994SQ201410581970
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月27日 優先權日:2014年10月27日
【發明者】戴洋, 王曉婷, 趙松, 唐建霞 申請人:江蘇省血吸蟲病防治研究所