源自番茄組氨酸脫羧酶基因的果實特異性表達啟動子及其用途的製作方法

2023-12-02 03:34:56

專利名稱：源自番茄組氨酸脫羧酶基因的果實特異性表達啟動子及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及源自番茄組氨酸脫羧酶基因的果實特異性表達啟動子以及其用途。更具體地涉及源自番茄組氨酸脫羧酶基因的植物體果實特異性表達啟動子及5'非翻譯區 (untranslated region ；以下簡稱5 『 -UTR)；含有上述啟動子及5 『非翻譯區的果實特異性表達載體；用上述表達載體轉化的植物體；利用上述表達載體將外源基因進行果實特異性表達的方法，以及根據上述方法，進行果實特異性表達外源基因的轉化植物體以及其種子。
背景技術：
對最近的研究傾向進行觀察，研究的方向正在由以往的作為原核生物的細菌中的物質表達向作為真核生物的植物的物質表達改變。這是由於從真核生物的植物中獲得的物質能夠更加穩定地進行提取，並且在植物體內進行合成期間，如糖基化過程中的物質變化的概率要小於在細菌中的物質變化的概率。(Albert等，J Exp Bot. 59(10) 2673-2686. 2008年5月31日在線公開)。先前開發的35S啟動子在雙子葉植物組織的所有部位表達效率都非常好，因此能最為有效地使用在植物體表達基因上。但是，這種在希望的組織上將特定的物質進行轉化的表達，是不必要的表達，使得植物承擔的負擔非常重。因此需要進行在番茄等攝食果實的植物中，減少莖或葉中的不必要表達，使其在果實中特異性表達的研究。在植物研究方面番茄作為最好材料而受到矚目，原因在於番茄是可以攝食全部果肉的植物，能夠將一些物質超表達後，在變熟的狀態或生的狀態下攝食，並且可以作為疫苗發揮作用。基於這些優勢， 最近在經口腔應用疫苗的開發方面，番茄果實被確認為非常好的材料。(Giovanni Levia. EMBO R印.2000年11月15日；1 (5) :378-380)。實際上從最近許多關於疫苗的研究項目可知，很多研究都是利用馬鈴薯或甘薯等作物開發疫苗，並作為疫苗商品在市場上銷售。 (Mason 等，Proc Natl Acad Sci USA. 1996 年 5 月 28 日；93(11) :53；35_5340)。因此，想通過本研究，並且通過開發果實特異性超表達的啟動子，對物質的果實特異性表達進行研究。由於番茄等植物的果實需要完全成熟後才能進行攝食，因此，在剛進入成熟期的果實中，如果物質表達能夠從開始時期持續到完熟期，會有大量的物質蓄積到果實中。為了獲得這樣的效果，選出了即使在成熟過程中，表達率也能夠一直維持或逐漸增加的基因。本發明的發明人通過微陣列方法選出了從番茄果實的綠熟到紅熟時期中基因的表達逐漸增加或維持的基因，並且選出了其中表達效率最好的基因，即番茄組氨酸脫羧酶基因。在番茄果實成熟的過程中，該基因作為從破色開始就蓄積表達的基因，與番茄果實的成熟有關，因此很適合作為我們想獲得的表達效率好的啟動子。韓國專利0784165公開了一種對於辣椒植物的病原體感染的抵抗性和與辣椒果實成熟過程相關的源自辣椒植物的UDP-葡糖糖基轉移酶進行調節的啟動子，韓國專利 0574563公開了一種源自擬南芥的植物體高效率表達啟動子，以及含有該啟動子的植物體高效率表達載體，但其與本發明的啟動子不同。

發明內容
本發明要解決的技術問題本發明是根據上述要求而提出並完成。具體如下將番茄組氨酸脫羧酶基因的啟動子以及5' -UTR進行克隆後，將啟動子以及5' -UTR引入到二元載體，並導入到番茄中， 結果發現，外源基因在轉化番茄的果實組織中被特異性表達。解決技術問題的技術手段為了解決上述問題，本發明提供一種源自番茄組氨酸脫羧酶基因的果實特異性表達啟動子或5' -UTR。此外，本發明提供含有上述果實特異性表達啟動子和/或5' -UTR的果實特異性表達載體，以及用上述表達載體轉化的植物體。此外，本發明還提供如下一種在植物體內進行外源基因表達的方法在植物體果實中需要大量產出有用物質時，利用上述果實特異性表達啟動子或5' -UTR在植物體內進行外源基因表達。此外，本發明還提供根據上述方法而製得的外源基因進行果實特異性表達的轉化植物體，以及其種子。有益效果根據本發明，利用源自番茄組氨酸脫羧酶基因的果實特異性表達啟動子以及 5' -UTR，將外源基因在植物體中進行表達，結果確認所述該利用源自番茄組氨酸脫羧酶基因的果實特異性表達啟動子是能夠在植物體果實中對基因進行特異性表達的新的啟動子。


圖1示出了 SOL基因網絡資料庫的微陣列數據。(B)為根據番茄成熟過程(A)以及SOL基因網絡資料庫(http://www.sgn.cornell.edu)的微陣列數據，對在果實中特異性表達的基因表達程序進行的概要分析。圖中DAP為受粉後的天數；MG為綠熟期(Mature green stage) ；B(Breaking stage)。圖2示出了有關SlHD-I啟動子區域分離的基因組步移PCR。圖中，A_D為從1泳道至4泳道的各自的基因組步移PCR產物；E為全長940bp的SlHD-I啟動子的PCR產物。 (M, size marker ； 1_4，各為用 EcoRV，DraI，PvuII，StuI 處理的番茄基因組 DNA 文庫)圖3為轉錄開始部位(+1)的5'側翼區域上遊的SlHD-I啟動子序列。圖中UTR 為非翻譯區域。圖4為啟動子活性分析載體的模式圖。圖中，pCAM-2300HD(SlHD)是用於全長啟動子的載體；PCAM-2300HD Δ 630 ( Δ SlHD6J 以及 pCAM-2300 Δ 310 ( Δ SlHDmi)為部分缺失的啟動子；pCAMBIA 1302 (35S)是為了在番茄中瞬時表達的陽性對照組；N0S_t為NOS終止子(NOS terminator) ；35S，CaMV35S啟動子；GFP為綠色螢光蛋白編碼基因；組氨酸標記，6
組氨酸殘基。圖5示出了番茄組織的S1HD-2基因表達。番茄組織以及不同的果實發育階段的 SlHD-I基因表達水平，實時PCR結果(A)值為在葉子上將肌動蛋白設定為1時的相對的SlHD-I表達水平。(B)為葉子(1)、根(2)、種子(3)、花(4)、0· 5cm的綠色果實(5) ,MG(6)、 黃色果實(7)、紅色果實(8)的RT-PCR結果。陽性對照組為番茄肌動蛋白基因。圖6示出了 Southern印跡雜交。將由番茄植物分離的基因組DNA的DNA斑點與 500bp SlHD-I啟動子探針進行雜交。在泳道1及泳道2顯示的箭頭為SlHD-I啟動子-特異性條帶。各泳道含有IOug基因組DNA，被HindIII (泳道1)及EcoRI (泳道2)切斷。圖7為S1HD-2啟動子活性分析結果。通過農桿菌侵染的瞬時表達顯示出，具有 SlHD-I啟動子的GFP表達的相對水平與番茄組織中的CaMV 35S啟動子不相上下。(A)值為把35S-GFP設定為1. 00時的相對GFP表達水平。(B)值表示平均。圖8顯示了，根據農桿菌侵染法的瞬時表達中，利用了 S1HD-2全長啟動子以及 AS1HD630、AS1HD310部分缺失的啟動子的GFP表達水平與番茄紅熟期的果實中的CaMV 35S啟動子不相上下。值表示平均，對各構建體反覆取樣3次。(GFP，綠色螢光蛋白；TSP， 總可溶性蛋白質；mg，番茄果實的綠熟期)
具體實施例為了實現本發明的目的，本發明提供包括圖3的序列(Seq ID No. 1)中的1至 784(轉錄開始部位到-784至-1部位)的鹼基序列的果實特異性表達啟動子。與現有技術中廣為使用的源自花椰菜的花葉病毒的CaMV35S啟動子在整個組織中對被導入的基因進行表達相比，上述本發明的果實特異性表達啟動子能夠將轉化植物體中被導入的基因進行果實特異性表達。為了實現本發明的目的，本發明提供含有圖3序列(Seq ID No. 1)中的785至 940 (轉錄開始部位到+1至+156部位)的鹼基序列的5' -UTR。並且，上述啟動子序列或5' -UTR序列的變體包含在本發明的範圍內。變體的鹼基序列雖然變化，但是其鹼基序列的功能特性與序列號1的鹼基序列類似。具體地，上述啟動子序列以及5' -UTR序列能夠包括與序列號1的鹼基序列同一性超過70%以上的鹼基序列，優選為80%以上，更優選為90%以上，最優選能夠達到95%以上。對於多核苷酸的「序列同一性的％ 」通過兩個最佳排列的序列和比較區域進行比較來確認，與兩個序列的最佳序列的參考序列(不包括添加或缺失)相比，在比較區域中的多核苷酸序列的一部分能夠包括添加或缺失(即，缺口)。為了實現本發明的另外一個目的，本發明提供含有上述植物體果實特異性表達啟動子和/或5' -UTR的果實特異性表達載體。本發明的果實特異性表達載體僅含有上述本發明的啟動子或也可以將本發明的 5' -UTR跟類似於CaMV35S的一般植物體表達啟動子組合使用，但優選為包括上述本發明的啟動子和5' -UTR，以便有利於在植物體中將導入基因進行果實特異性表達。本發明的果實特異性表達載體能夠用作瞬時表達載體，在導入了外源基因的植物體內能夠進行瞬時表達，也可用作在導入外源基因的植物體內進行永久表達的植物表達載體。能夠用於本發明的二元載體與根癌土壤桿菌的Ti質粒同時存在時，可以成為能夠將植物體進行轉化的含有T-DNA的右側序列和左側序列的任一種二元載體，優選為本領域經常使用的 pBI101(Cat# :6018-1, Clontech，美國)、pBmi9(Genbank 登錄號為 U09365)、pBI121、pCAMBIA 等載體。根據本發明的一個具體例的果實特異性表達載體可以為圖4所示的 PCAM-2300HD，但並不限於此。將本發明的啟動子插入到具有GFP基因的用於分析啟動子的二元載體(pCAMBIA 1391Z)中，製備pCAM_2300HD (圖4)，並用於利用農桿菌 (Agrobacterium)的植物轉化當中。能夠將上述GFP報導基因替換為其它目的的外源基因， 這一點是本領域人員公知的。術語「載體」用於指定向細胞內傳遞的DNA片段、核酸分子。載體複製DNA，並能夠在宿主細胞中獨立再生產。術語「運載體」經常與「載體」互換使用。「表達載體」表示重組 DNA分子，該重組DNA分子含有適當核酸序列，所述適當核酸序列對於目標編碼序列的表達以及在特定宿主生物中使可操作連接的編碼序列進行表達所必須的。真核細胞中可以利用的啟動子、增強子、終止信號及聚腺苷酸化信號是公知的。植物表達載體的優選例為當存在於根癌土壤桿菌等適當的宿主內時，能夠將其本身的一部分，所謂T-區域向植物細胞轉移的Ti-質粒載體。其它類型的Ti-質粒載體(參照EP O 116 718B1號)用於向原生質體轉移雜種DNA序列。所述原生質體為將現在的植物細胞，或雜種DNA適當地插入到植物的基因組內的能夠產生新植物的原生質體。Ti-質粒載體的最優選形態為如EPO 120 516B1及美國專利4，940，838請求保護的所謂二元(binary) 載體。能夠將本發明的基因導入到植物宿主內的其它適合的載體可從來源於雙鏈植物病毒 (如Ca MV)以及單鏈植物病毒、雙粒病毒等的病毒載體中選擇，例如可以選自缺陷植物病毒載體。這樣的載體的使用特別利於很難將植物宿主適當進行轉化的情況。表達載體優選為包括一個以上的選擇性標記。上述標記通常為具有能夠用化學方法選擇的特性的核酸序列，能夠將轉化的細胞從非轉化的細胞中區分開的所有基因都相當於所述標記。例如有草甘膦(glyphosate)或草丁膦等除草劑抗性基因、卡那黴素、G418、博來黴素(Bleomycin)、潮黴素(hygromycin)、氯黴素(chloramphenicol)等而 抗生素病毒， 但並不僅限於此。根據本發明的一個具體例中的植物表達載體中，可以使用一般的終止子，例如有胭脂鹼合酶(NOS)終止子、水稻α-澱粉酶RAmyl A終止子、菜豆鹼(phaseoline)終止子、 根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的章魚鹼(Octopine)基因的終止子等，但並不限於這些。為了實現本發明的另一目的，本發明提供用本發明的果實特異性植物表達載體轉化的大腸菌(E. coli)或根癌土壤桿菌。為了達成本發明的另一目的，本發明提供用本發明的果實特異性植物表達載體轉化的植物體以及其種子。不管是雙子葉或單子葉植物，本發明的果實特異性表達載體能夠轉化任何植物體，但在本發明中是在番茄中進行了轉化。根據本發明的一個具體例的上述植物體可以是番茄、擬南芥、馬鈴薯、茄子、煙、辣椒、牛蒡、茼蒿、萵苣、桔梗、菠菜、葉用甜菜、番薯、芹菜、 胡蘿蔔、六瓣合葉子、西芹、白菜、捲心菜、蘿蔔、西瓜、香瓜、黃瓜、南瓜、葫蘆、草莓、大豆、綠豆、四季豆或豌豆等雙子葉植物。植物的轉化是指將DNA轉移到植物的任意方法。這種轉化方法沒有必要一定具有再生及(或)組織培養期。植物種的轉化現在不僅是對於雙子葉植物，對於包括雙子葉植物和單子葉植物兩者的植物種是常見的。原則上，任意的轉化方法能夠適用於將本發明的雜種DNA導入到適當的先祖細胞。方法可以從對於原生質體的鈣/聚乙烯乙二醇法 (1(儀118，卩^等，1982』&忉儀 296,72-74 ；Negrutiu I.等，June 1987，Plant Mol. Biol. 8， 363-373)、原生質體的電穿孔法(Shillito R. D.等，1985Bio/Technol. 3，1099-1102)、作為植物要素的顯微注射法(Crossway A.等，1986，Mol. Gen. Genet. 202，179-185)、各種植物元件的(DNA或RNA-包被的)微粒轟擊法(Klein Τ. Μ.等，1987，Nature 327，70)、植物的浸潤或成熟花粉或小孢子的轉化引起的根癌農桿菌屬介導的基因轉移中(缺陷)病毒的感染 (EP O 301 316號)等中進行選擇。本發明的優選方法包括由農桿菌屬介導的DNA傳遞。 特別優選為如記載於EP A 120 516號及美國專利第4，940，838號的利用所謂二元載體的技術。用於植物轉化的「植物細胞」可以是任何植物細胞。植物細胞可來自培養細胞、培養組織、培養器官或植物整體，優選為培養細胞、培養組織或培養器官，以及更優選為培養細胞的任何形態。「植物組織」為分化或未分化的植物組織，但並不限於這些，例如包括果實、莖、葉子、花粉、種子、瘤組織及用於培養的多種形態的細胞，即單一細胞、原生質體、芽及愈傷組織。植物組織可以為植物或器官培養、組織培養或細胞培養狀態中的組織。為了達成本發明的另一目的，本發明提供將外源基因在轉化植物體中進行果實特異性表達的方法。該方法包括在本發明的果實特異性表達載體上重組外源基因的步驟；以及將上述重組的果實特異性表達載體轉化到植物體上的步驟。上述外源基因可以為希望在植物體果實中表達的任何基因，在本發明的果實特異性表達載體中位於上述啟動子的後面，並可根據需要與報導基因融合進行表達。將上述重組果實特異性表達載體轉化到植物體上的方法可以按照前面所述的方法實施。在本發明的一個具體例中的方法中，上述植物體可以是番茄、擬南芥、馬鈴薯、茄子、煙、辣椒、牛蒡、茼蒿、萵苣、桔梗、菠菜、葉用甜菜、番薯、芹菜、胡蘿蔔、六瓣合葉子、西芹、白菜、捲心菜、蘿蔔、 西瓜、香瓜、黃瓜、南瓜、葫蘆、草莓、大豆、綠豆、四季豆或豌豆等雙子葉植物。為了實現本發明的另一目的，本發明提供由上述方法製得的外源基因進行果實特異性表達的轉化植物體及其種子。上述轉化植物體能夠由果實特異性表達啟動子和/或 5' -UTR將外源基因進行果實特異性表達。下面，通過具體實施例，對本發明更加詳細地說明。這些實施例僅是為了例示本發明，本發明的範圍並不能解釋為僅限於這些實施例。材料及方法1、植物材料番茄(Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom)植物體在培養室中保持的溫度。2、為了得知番茄基因組(genomic) DNA分離及5'-上遊區域的基因組步移PCR為了提取番茄基因DNA，利用液氮將番茄葉組織磨細，根據DNeasy plant小型試劑盒Oiiagen，德國)的標準操作規程進行提取。然後將2. 5ug的基因組DNA利用80單位的DraI,EcoRV,PvuII, StuI在37°C下處理16小時以上，以使得生成鈍(blunt)端，然後用苯酚三氯甲烷(1 1)進行純化，用100%乙醇進行回收，然後溶於20ul的滅菌蒸餾水中。 將其中的4ul與基因組步移接頭(Genome walker Adaptor)片段(clontech，USA)進行連接，將接頭(Adaptor)弓丨物I(APl)和SlHD基因特異性引物1 (GSPl)進行1次PCR，其反應組成如下。DNA 聚合酶緩衝液，1. 5mM Mg(OAc)2，各 2. 5mM dNTP (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)，各 IOpm引物(API及S1HDGSP1)；模板為Iul連接DNA及0. IU DNA聚合酶，並且，1次PCR反應條件為在94°C下25sec ；72°C下，反應3min，共實施7次循環，之後在94°C，2k ；67°C，反應 3min，共實施32次循環，追加地，在67°C下反應7min，共進行一次，然後將溫度降至4°C，結束反應。將1次PCR反應得到的產物稀釋至1/50，然後用AP2和GSP2進行2次巢式PCR反應，反應組成同1次PCR反應組成，2次巢式PCR反應為在94°C下2 ；72°C下，反應3min， 共實施5次循環，在94°C，25s ；67°C，反應3min，共實施20次循環，追加地，在67°C下反應 7min，共進行一次，然後將溫度降至4°C，結束反應。用於上述PCR反應的引物序列如表1中所示。為了確認PCR的結果，用瓊脂糖凝膠中進行電泳實驗。3、DH5 α /E. coli感受態細胞的製備及轉化將E. coli菌株DH5 α接種到3ml的LB培養基中(蛋白腖10g/L，酵母提取液5g/ L，NaCl 10g/L, pH7. 2)，在37°C下振蕩培養18小時以上後，在100ml的LB液體培養基中進行再培養，直至在600nm處的0. D值為0. 4 0. 45。將培養液在冰上放置15分鐘後，在 4°C，4000rpm轉速下離心分離20分鐘進行回收。用冰冷的80mM MgCl2-20mM CaCl2溶液對回收得到的Ε. coli進行處理。然後放置於冰上15min，然後在4°C，4000rpm轉速下離心分離 20分鐘，然後用2ml的冰冷的0. IM CaCl2溶液處理後用於轉化。當需要立即使用時，在冰上放置30分鐘後使用，與此相反，當不需要立即使用時，添加15 20%丙三醇後，於-70°C 下保存。在感受態細胞中混入DNA後，在冰上放置30分鐘，然後在42°C下放置90s進行熱衝擊後，加入Iml的不含有抗生素的LB液體培養基，於37°C下培養1小時。然後塗布到含有抗生素的LB培養基上，選出轉化的菌落。培養選出的菌落，用Accup prep.小型試劑盒 (Bioneer，Korea)分離質粒後，採用限制性內切核酸酶進行確認。4、農桿菌感受態細胞的製備及轉化將農桿菌屬接種於5ml的YEP(酵母提取液10g/L，蛋白腖10g/L，NaCl 5g/L， pH7. 2)液體培養基中，於下振蕩培養後，將培養得到的Iml放置到50ml的YEP液體培養基中進行再培養，直至在600nm處的0. D值為0. 6-1. 0。然後將其在冰上放置30分鐘後， 在4°C，4000rpm轉速下離心分離20分鐘後，在冰冷的0. 15M NaCl中再懸浮後，在冰上放置 10分鐘。然後在4°C，4000rpm轉速下離心分離20分鐘，然後將再次回收得到的沉澱懸浮於 Iml的20mM CaCl2中，分別按照50ul進行加入。然後在液氮中急速冷凍，於_70°C下保存。在保存的感受態細胞中加入Iug的DNA混合後，在液氮中冷凍2分鐘，在37°C下進行5分鐘熱衝擊處理，輕輕地混合，然後再次重複上述步驟。然後，在冰上放置30分鐘後， 加入Iml的YEP液體培養基，在下培養2小時後，塗布到含有Rif50mg/L、Km 50mg/L的 YEP固體培養基上，選出轉化的菌落。5、SlHD啟動子區域的重組載體SlHD啟動子區域通過基因組步移PCR確定了 11Λ區域，將其用SlHD F引物和SlHD R引物進行PCR反應，為了將其重組到pCAMBIA1391Z上，用HindIII和BamHI酶進行切割，通過jM連接酶在下進行3小時連接，轉化到DH5 α /E. coli感受態細胞上，在LB+Km 50mg/L的瓊脂板上進行挑選，將其用HindIII和BamHI酶進行切割確認，並從而提取了質粒。將提取到的質粒轉化到農桿菌LBA4404菌株感受態細胞上，在YEP+Rif 50mg/L+Km 50mg/L的瓊脂板上進行挑選，然後將其用於利用了農桿菌侵染的植物轉化中。為了進行番茄瞬時表達試驗，採用上述方法，在PCAMBIA2300上融合有GFP的載體上重組了 SlHD啟動子區域，並轉化到農桿菌LBA4404感受態細胞上。此外，為了確認順式作用元件的作用和表達水平進行了缺失試驗。為了進行缺失試驗，將SlHD啟動子區域分別用-480/+156區域和-155/+156進行重組。首先將各個區域在全長中，將Δ S1HD630引物和Δ S1HD310引物同SlHD反向引物一起進行PCR反應，用Hind III和BamH I酶進行切割， 重組到pCAMBIA2300-GFP載體上，將其轉化到農桿菌LBA4404感受態細胞上。用於克隆的引物序列如表1中所示。6、RNA提取及實時PCR為了用於實時PCR進行了 RNA提取。利用TRI REAGENT取番茄的0. 5cm直徑的青果、綠熟、破色(breaking)、紅熟(red ripe)時期的果實和葉子，分別取50mg試樣磨細後使用。首先用TRI試劑將50mg的番茄組織進行均質處理後，加入Iml的TRI試劑。進行漩渦震蕩(voltexing)處理後在室溫下放置5分鐘。加入0. 2ml三氯甲烷後劇烈混合。在室溫下放置15分鐘後，在4°C，12000rpm的轉速下進行15分鐘離心分離。將0. 5ml水相移至新的試管中，加入0. 5ml的異丙醇充分混合。在室溫下放置10分鐘後，在4°C，12000轉速下進行15分鐘離心分離。去除上清液，僅將RNA粒狀沉澱(pellet)用0. 5ml的75% EtOH 洗淨。然後將該沉澱充分溶於含有DEPC的20ul水中。RT-PCR採用上面提取得到的RNA。定量lug RNA,分別與引物混合後進行實驗。使用了 SYBR Green Master Mix試劑盒(QuantiiTect SYBR Green PCR Handbook. WWW. QIAGEN. COM)。實時PCR方法是在94°C下進行15分鐘熱變性處理後，將循環條件設定為94°C下1 分鐘、52°C下1分鐘、72°C下30s，進行40次循環。引物採用SlHD外顯子和3 『 -UTR製備的特異性引物組進行的，在PCR反應後，作為陽性對照組使用了番茄肌動蛋白基因的引物。7、Southern 印跡雜交使用了 20ug番茄基因組DNA。S1HD_2基因啟動子是利用Southern印跡DIG探針合成試劑盒(Rochi)，並利用已知的基因，用DIG探針合成試劑盒對新獲得的長度為360bp的 5 『-上遊的DNA進行PCR反應。確定了該產物後，進行了 Southern印跡試驗。在進行DNA 上樣之前，利用之前製備好的引物合成DIG探針備用。然後從番茄的葉子中提取整體基因組DNA，分別用Hind IILEcoR I對20ug的DNA處理後，加樣到0. 8%瓊脂糖凝膠中。在25V 下進行5小時電泳處理。電泳結束後，採用真空方法，將凝膠的DNA轉移到纖維素膜(Hybond N+, Amersham)上進行雜交，並觀察結果。在真空裝置上將膜(Hybond N+, Amersham)和凝膠疊加後，啟動裝置，在凝膠上傾倒30ml的0. 25M HC1，反應10分鐘。傾倒50ml變性溶液 (0. 4N NaOH)反應20分鐘。傾倒50ml的中和溶液(0. 2M Tris-HCl pH7. 5)，反應20分鐘。 然後，轉移步驟以每30分鐘充填一次轉移液(Transfer solution)的方式實施2小時。使用DIG探針抗體檢出後，採用顯色法進行了實驗。雜交是在雜交溶液6XSSC，0.02% SDS， 0. N-月桂醯肌氨酸鈉鹽，阻斷劑)中進行1小時預雜交。然後去除預雜交溶液，加入25ml的用DIG進行標記的DNA探針溶液。24小時後去除探針溶液，在常溫下，用hSSC，0. 1% SDS溶液清洗5分鐘。將試劑更換為hSSC，0. 5% SDS溶液(20ml)，在和預雜交步驟相同的溫度下，清洗15分鐘，清洗兩次。在免疫檢出步驟中採用清洗緩衝液(0. IM馬來酸，0. 15M NaCl pH 7. 5,0. 3%吐溫20)在常溫下清洗5分鐘。將IOx封閉液(封閉試劑， 馬來酸緩衝液)和馬來酸緩衝液(0. IM馬來酸，0. 15M NaCl，用NaOH調節成pH7. 5)按照 1 9混合後，在常溫下孵育30分鐘。在按照1 9混合的封閉緩衝液中加入抗-洋地黃毒-AP (當為20ml封閉緩衝液時為4ul抗-洋地黃毒-AP)，在常溫下反應30分鐘。反應結束後用IOOml清洗緩衝液在常溫下清洗15分鐘，清洗兩次。然後，用20ml的檢測緩衝液 (0. IM Tris-HCl,0. IM NaCl)在常溫下處理5分鐘。然後在該檢測緩衝液中加入200ul的 NBT/BCIP(200ulNBT/BCIP/檢測緩衝液IOml)。在常溫下反應16小時以上。8、瞬時表達試驗為了進行瞬時表達試驗先預培養農桿菌LBA4404菌株，然後在20ml的含有200uM 乙醯丁香酮的YEP液體培養基中再培養，直至0. D = 0. 7後，在4°C、4500rpm轉速下進行 20分鐘離心分離，然後將回收的細胞再懸浮於20ml的添加了 200uM乙醯丁香酮的1/2MS培養基(MS 2.2g，2%蔗糖，pH5.7)中，利用注射器注射到番茄種子中，使種子感染農桿菌，並滲入到葉和果實中。2. 5天後取試樣，將其與蛋白質提取緩衝液(PEB) —起研磨後，在4°C、 15000rpm轉速下進行30分鐘離心分離，進行準備，通過利用組氨酸標記的單克隆抗體的 ELISA方法確認了表達量。以農桿菌自身表達的⑶S表達量為基準進行了歸一化。9、ELISA (酶聯免疫吸附測定)將試樣與蛋白質包被緩衝液(PCB，3. 3g/L Na2CO3,6. 0g/LNaHC03 pH9. 6) 一起粉碎後，在4°C、15000rpm轉速下進行離心分離，將上清液在96孔微孔板上加入IOOul，然後將其在常溫下放置2小時。然後用蛋白質提取緩衝液(PEB, 1. 16g/L Na2HPO4,0. lg/L KC1，0. lg/ L K3PO4,4. Og/L NaCl, ρΗ7· 4)清洗，加入200ul封閉緩衝液(5%脫脂乳)後，在常溫下放置2小時。然後，將其用PEB進行2次清洗，加入50ul的稀釋成10_7的1次抗體(novagen， Germany)，在常溫下放置2小時，以使得希望相互作用的蛋白質間充分作用。然後用PEB清洗4次以上，將2次組氨酸標記的單克隆抗體(sigma，USA)以1 2000的比例用PEB稀釋， 加入50ul。放置於室溫下反應了 1小時，將其用PEB清洗4次後，加入50ul基質溶液(BD bioscience，USA)，在常溫下放置30分鐘，加入50ul停止液(2. 5M H2SO4)，結束反應。測其 450nmMi_^Sjfeit{t。 (Konrad Birkhaug. Am J Public Health Nations Health. 1950 年 5 月；40(5) :545-554)。實施例1果實特異性表達基因組選取在SOL基因網絡資料庫(http://www. sgn. Cornell, edu)中的番茄微陣列結果中，選取了隨著果實的成熟，表達增加的共11個基因(圖1)。製作了能夠將選出基因的 3' UTR部分和外顯子部位進行擴增的引物，為了測定實際上果實中的表達率是否良好，使用RT-PCR對mRNA的表達率進行調查的結果為從綠熟期到紅熟期(red ripe stage)，番茄組氨酸脫羧酶-1、-2(S1HD-1，S1HD-2)及脂肪氧化酶、鳥苷酸結合蛋白beta亞基(GBB) 基因的表達率漸漸增加。實施例2染色體步移(Genome Walking)對微陣列找到的11個基因都進行了用基因組步移PCR得知啟動子部位的實驗。首先利用已知的基因情報製作了基因特異性引物GSPl和GSP2。在基因組步移程序庫中利用
10該引物和在基因組步移試劑盒上的接頭特異性引物AP1、AP2進行了 PCR反應。由S1HD-1、 S1HD-2、GBB基因中分離出了約11Λ以上的推定的啟動子。採用瞬時表達分析方法，在番茄果實中，對由預實驗分離得到的putative啟動子的活性進行確認的結果為，只有S1HD-2 顯示出了果實特異性表達的上漲。用於S1HD-2基因的基因組步移PCR的引物組如表1中所示。表1中，將GSP及AP引物用於基因組步移PCR中，將SlHD Fwd/Rvs、AS1HD630、 Δ S1HD310引物用於擴增全長及部分缺失的啟動子區域上，將Fwd/Rvs引物用於瞬時PCR分析上。表1為了 SlHD-I啟動子分離而使用的引物
權利要求
1.含有kqID No. 1中的1至784(-784至_1部位)的鹼基序列的植物果實特異性表達啟動子。
2.含有kqID No. 1中的785至940(+1至+156)的鹼基序列的5' -UTR0
3.含有權利要求1的果實特異性表達啟動子或權利要求2的5'-UTR，或含有權利要求1的果實特異性表達啟動子及權利要求2的5' -UTR的果實特異性植物表達載體。
4.根據權利要求3所述的果實特異性植物表達載體，其特徵在於，其為如圖4所示的 PCAM-2300HD。
5.用權利要求3或權利要求4的果實特異性植物表達載體轉化的根癌土壤桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)0
6.用權利要求3或權利要求4的果實特異性表達載體轉化植物體。
7.根據權利要求6所述的轉化植物體，其特徵在於，所述植物體為雙子葉植物。
8.一種將外源基因在轉化植物體中進行果實特異性表達的方法，其包括在權利要求3 或權利要求4中的果實特異性植物表達載體上重組外源基因的步驟；以及將所述重組植物表達載體轉化到植物體上的步驟。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述植物體為雙子葉植物。
10.根據權利要求8的方法製備的外源基因進行果實特異性表達的轉化植物體。
全文摘要
本發明涉及源自番茄組氨酸脫羧酶-2(Solanum lycopersicum histidine decarboxylase-2；SlHD-2)基因的植物果實特異性表達啟動子以及5′非翻譯區(untranslated region；5′-UTR)，還涉及含有上述啟動子和5′非翻譯區的果實特異性表達載體，以及利用上述表達載體特異性表達外源基因的方法，還涉及用上述表達載體轉化的植物體及其種子。與現有技術中廣泛使用的可在所有組織中誘導外源基因表達的花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動子相比，本發明的啟動子能夠在轉化植物體中將導入的基因進行果實組織特異性表達。此外，本發明能夠有效地應用到轉化植物體開發當中，以達到在果實中生產有用物質的目的。
文檔編號C12N15/11GK102317456SQ201080007674
公開日2012年1月11日 申請日期2010年2月11日 優先權日2009年2月12日
發明者李相協, 鄭瑛姬, 金兒榮 申請人:全南大學校產學協力團