一種檢測附子中二萜類生物鹼在Caco-2細胞模型中吸收轉運含量的方法
2023-12-01 19:03:01
專利名稱：一種檢測附子中二萜類生物鹼在Caco-2細胞模型中吸收轉運含量的方法
技術領域：
本發明屬於中藥檢測技術領域，尤其涉及一種檢測附子中二萜類生物鹼在Caco-2細胞模型中吸收轉運含量的方法。
背景技術：
Caco-2細胞模型(the human colon carcinoma cell line)是一種人結腸腺癌細胞體外培養模型，Caco-2細胞可在培養條件下自發進行上皮樣分化並可以形成緊密聯結，分化出絨毛面AP (apical，腸腔側)和基底面BL (basolateral，腸壁側)，其形態學、標誌酶的功能表達、滲透特徵等與小腸上皮細胞相似，因此可以作為研究小腸表皮細胞的藥物轉運、吸收和代謝的體外模型。Caco-2單層細胞模型被認為是研究口服藥物在小腸吸收轉運的較好的體外模型，其與藥物在腸中的吸收具有良好的相關性、重現性及適用性，已被美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准使用進行藥物篩選。如，Artursson P等(Artursson P, Karlsson J., Correlation between oraldrug absorbtion in humanand apparent drug permeability coefficients in humanintestinal epithelialcells[J]， biochem Biophys Res Communication,1991,175(3) :880 885)用 Caco-2 細胞模型研究了屬被動擴散的20種不同結構的藥物吸收機制，通過小腸表皮細胞的吸收，測定了這些藥物的表觀通透係數(Apparentpermeability coefficient, Papp)，發現 Caco-2細胞模型所得結果與人體吸收程度的對應關係為=Papp值大於1*10_6時，藥物完全吸收；Paap值在(0. 1 1.0)*10_6之間時，藥物吸收介於 100%，Paap值小於1*10_7時，藥物吸收小於 ；Yee S(Yee S, In vitro permeability across Caco-2 cells can predictin vivo(smallintestinal)absorption in manfact or myth[J], Phamaceut Res,1997,14(6) 763 766)利用Caco-2細胞模型研究了在人體具有不同吸收程度的35種化合物，並分別測定了其Papp，發現該係數與人體吸收相關程度良好。附子(Radix Aconiti Lateralis Preparata)為毛茛科烏頭屬植物川烏頭的側根，是中醫臨床常用中藥，性味甘、辛、大熱有毒，具有鎮痛、消炎、強心和抗癌等廣泛的藥理作用，被認為是中藥中的「回陽救逆第一品」。附子的主要化學成分是二萜類生物鹼，主要包括雙酯型生物鹼、單酯型生物鹼和醇胺型生物鹼，如塔拉烏頭胺(talatizamine)、新烏寧鹼(neoline)、附子寧鹼(fuziline)、14-苯甲醯次烏頭胺(14-benzoylhypaconine)、14-苯甲醯中烏頭胺(14-benzoylmesaconine)、次烏頭鹼(hypaconitine)、去氧烏頭鹼(deoxyaconitine)、中烏頭鹼(mesaconitine)、烏頭鹼(aconitine) > 10-輕基-中烏頭鹼(10-0H-mesaconitine)和 10-羥基-烏頭鹼(lO-OH-aconitine)等。利用Caco-2細胞模型對附子中的二萜類生物鹼進行吸收轉運實驗時，需要對其吸收轉運含量進行檢測，而現有的檢測方法並不適用於含有11種以上的生物鹼的附子。
發明內容
有鑑於此，本發明要解決的技術問題在於提供一種檢測附子中二萜類生物鹼在Caco-2細胞模型中吸收轉運含量的方法，本發明提供的檢測方法能夠檢測附子中11種生物鹼在Caco-2細胞模型中的吸收轉運含量，操作簡便、檢測結果準確、靈敏度高。本發明提供了一種檢測附子中二萜類生物鹼在Caco-2細胞模型中吸收轉運含量的方法，包括以下步驟a)提取附子中的二萜類生物鹼，得到生物鹼提取物；b)將所述生物鹼提取物溶解於Hanks平衡鹽緩衝液中，將得到的溶液作為供給側、Hanks平衡鹽緩衝液作為接收側在Caco-2細胞模型中進行吸收轉運，自接收側取樣，得到待測樣品；C)以利血平為內標物，採用超高效液相色譜儀和質譜儀對所述待測樣品進行分離檢測，得到質譜圖；d)根據所述質譜圖和預先建立的標準工作曲線得到各生物鹼在Caco-2細胞模型中的吸收轉運含量。優選的，所述步驟a)具體包括將附子粉末浸泡於乙醇中，超聲提取並濃縮後，得到浸膏；將所述浸膏溶解於乙醇中，抽濾，將得到的濾液真空乾燥後得到生物鹼提取物。優選的，所述超聲提取的溫度為20°C 30°C。優選的，所述超聲提取的時間為Ih 池。優選的，所述Hanks平衡鹽緩衝液的pH值為7 8。優選的，所述步驟b)具體包括以下步驟bl)將Caco-2細胞接種於培養板上，培養後得到Caco-2細胞模型；b2)將所述生物鹼提取物溶解於Hanks平衡鹽緩衝液中，得到生物鹼提取物溶液；b3)向所述Caco-2細胞模型的絨毛面加入所述生物鹼提取物溶液作為供給側，同時向所述Caco-2細胞模型的基底面加入Hanks平衡鹽緩衝液作為接收側；或者，向所述Caco-2細胞模型的基底面加入所述生物鹼提取物溶液作為供給側，同時向所述Caco-2細胞模型的絨毛面加入Hanks平衡鹽緩衝液作為接收側；b4)將步驟b3)得到的Caco-2細胞模型置于振蕩培養箱中，於培養20min、40min、60min、90min和120min時自接收側取樣，冷凍乾燥後得到待測樣品；每次取樣結束後，補加等量的Hanks平衡鹽緩衝液。優選的，所述振蕩培養箱的溫度為35°C 40°C。優選的，所述振蕩培養箱的振蕩速度為1轉/s 3轉/S。優選的，所述步驟C)具體包括以下步驟cl)將所述待測樣品溶解於甲醇、乙腈和水的混合溶液中，得到待測溶液；c2)向所述待測溶液中加入利血平，然後採用超高效液相色譜儀和質譜儀進行分離檢測，得到質譜圖。優選的，所述步驟d)中的標準工作曲線按照以下方法建立dl)提取附子中的二萜類生物鹼，得到生物鹼提取物；d2)以經過Caco-2細胞孵育的Hanks平衡鹽緩衝液為溶劑，配製不同濃度的生物鹼提取物溶液，以利血平為內標物，採用超高效液相色譜儀和質譜儀分別對所述生物鹼提取物溶液進行分離檢測，獲得質譜圖；d3)根據所述生物鹼提取物溶液的濃度和所述質譜圖建立各生物鹼的標準工作曲線。與現有技術相比，本發明首先提取附子中的生物鹼，得到生物鹼提取物；然後將所述生物鹼提取物溶解於Hanks平衡鹽緩衝液中，將得到的溶液作為供給側、Hanks平衡鹽緩衝液作為接收側在Caco-2細胞模型中進行吸收轉運，自接收側取樣，得到待測樣品；以利血平為內標物，採用超高效液相色譜儀和質譜儀對所述待測樣品進行分離檢測，得到質譜圖；根據所述質譜圖和預先建立的標準工作曲線得到各生物鹼在Caco-2細胞模型中的吸收轉運含量。其中，超高效液相色譜儀對複雜樣品的分離效果較好，而質譜儀則具有較高的靈敏度和精確性，不受指紋圖譜、無機鹽等因素的幹擾，使得檢測結果更為準確。實驗結果表明，本發明提供的方法能夠檢測附子中11種生物鹼在Caco-2細胞模型中吸收轉運的含量，而且檢測靈敏度高、結果準確，不受五味子、乾薑等提取物的影響。根據對附子中11種生物鹼在Caco-2細胞中吸收轉運含量的測定結果，可以判斷附子中各生物鹼在人體內的吸收情況，從而提高對附子的利用率。
圖1為對本發明實施例1提供的20min時獲取的待測樣品進行分離檢測的總離子流圖；圖2為本發明實施例1提供的待測樣品中次烏頭鹼的含量與時間的曲線圖。
具體實施例方式本發明提供了一種檢測附子中二萜類生物鹼在Caco-2細胞模型中吸收轉運含量的方法，包括以下步驟a)提取附子中的二萜類生物鹼，得到生物鹼提取物；b)將所述生物鹼提取物溶解於Hanks平衡鹽緩衝液中，將得到的溶液作為供給側、Hanks平衡鹽緩衝液作為接收側在Caco-2細胞模型中進行吸收轉運，自接收側取樣，得到待測樣品；c)以利血平為內標物，採用超高效液相色譜儀和質譜儀對所述待測樣品進行分離檢測，得到質譜圖；d)根據所述質譜圖和預先建立的標準工作曲線得到各生物鹼在Caco-2細胞模型中的吸收轉運含量。本發明將超高效液相色譜儀和質譜儀聯用對附子中的二萜類生物鹼在Caco-2細胞模型中吸收轉運的含量進行檢測，其中，超高效液相色譜儀的分離效果較好，本發明中，能夠分離得到11種二萜類生物鹼；將生物鹼分離後，採用靈敏度和精確度較高的質譜儀對其進行分析，分析結果較為準確，而且不受無機鹽等離子或五味子提取物、乾薑提取物等藥物的影響。首先提取附子中的二萜類生物鹼，得到生物鹼提取物，優選按照以下方法提取將附子粉末浸泡於乙醇中，超聲提取並濃縮後，得到浸膏；
將所述浸膏溶解於乙醇中，抽濾，將得到的濾液真空乾燥後得到生物鹼提取物。將附子研磨成粉，浸泡於乙醇中進行超聲提取，所述乙醇優選為90% 95%的乙醇，所述乙醇的體積優選為附子粉末體積的6 8倍。進行超聲提取時，超聲提取的溫度優選為20°C 30°C，更優選為25°C ；超聲提取的時間優選為Ih 3h，更優選為池。優選將所述附子提取兩次，並將提取液合併，濃縮成浸膏。將所述浸膏溶解於乙醇中，抽濾除去不溶物質，真空乾燥後得到生物鹼提取物。所述乙醇優選為無水乙醇，所述乙醇與所述浸膏的體積比優選為2 15 1，更優選為5 10 1。將所述浸膏多次溶解於乙醇中，抽濾、真空乾燥，得到純度較高的生物鹼提取物。得到生物鹼提取物後，將所述生物鹼在Caco-2細胞模型中進行吸收轉運實驗，以便獲得待測樣品，具體包括以下步驟bl)將Caco-2細胞接種於培養板上，培養後得到Caco-2細胞模型；b2)將所述生物鹼提取物溶解於Hanks平衡鹽緩衝液中，得到生物鹼提取物溶液；b3)向所述Caco-2細胞模型的絨毛面加入所述生物鹼提取物溶液作為供給側，同時向所述Caco-2細胞模型的基底面加入Hanks平衡鹽緩衝液作為接收側；或者，向所述Caco-2細胞模型的基底面加入所述生物鹼提取物溶液作為供給側，同時向所述Caco-2細胞模型的絨毛面加入Hanks平衡鹽緩衝液作為接收側；b4)將步驟b3)得到的Caco-2細胞模型置于振蕩培養箱中，於培養20min、40min、60min、90min和120min時自接收側取樣，冷凍乾燥後得到待測樣品；每次取樣結束後，補加等量的Hanks平衡鹽緩衝液。得到生物鹼提取物後，將所述生物鹼提取物溶解於Hanks平衡鹽緩衝液中，得到生物鹼提取物溶液。所述Hanks平衡鹽緩衝液的pH值優選為7 8，更優選為7. 4。本發明對所述生物鹼提取物溶液的濃度沒有特殊限制，優選為0. 2mg/L 0. 5mg/L。在進行吸收轉運實驗前，本發明優選以0. 22 μ m的無菌過濾器對所述溶液進行過濾除菌。將Caco-2細胞接種於培養板上，培養後得到Caco-2細胞模型。所述接種密度優選為l*105/mL 6*105/mL，更優選為2*105/mL 5*105/mL ；所述培養板優選為12孔Transwel 1 (NO. 3401 ；Costar，Corning, NY)培養板；所述培養時間優選為20天 25天，更優選為21天。培養完畢後得到Caco-2細胞模型，利用本領域技術人員熟知的方法對所述細胞模型進行評價，評價合格的Caco-2細胞模型即可用於吸收轉運實驗。Caco-2細胞模型可以用於吸收轉運實驗，也可用於外排轉運實驗當用於吸收轉運實驗時，向所述Caco-2細胞模型的絨毛面(AP)加入所述生物鹼提取物溶液作為供給側，同時向所述Caco-2細胞模型的基底面(BL)加入Hanks平衡鹽緩衝液作為接收側；當用於外排轉運實驗時，向所述Caco-2細胞模型的基底面(BL)加入所述生物鹼提取物溶液作為供給側，同時向所述Caco-2細胞模型的絨毛面(AP)加入Hanks平衡鹽緩衝液作為接收側。在進行吸收轉運實驗或排外轉運實驗時，所述基底面(BL)加入的溶液的體積與所述絨毛面(AP)加入的溶液的體積比優選為2 4 1，更優選為3 1。向所述Caco-2細胞模型中加入所述生物鹼提取物溶液後，將所述Caco-2細胞模型置于振蕩培養箱中，於培養20min、40min、60min、90min和120min時自接收側取樣，冷凍乾燥後得到待測樣品；每次取樣結束後，補加等量的Hanks平衡鹽緩衝液。所述振蕩培養箱的溫度優選為35°C 40°C，更優選為37°C;所述振蕩培養箱的振蕩速度優選為1轉/s 3轉/s，更優選為1轉/S。在振蕩培養的過程中，待測溶液中的生物鹼會由供給側吸收轉運或外排轉運至接收側，分別於培養20min、40min、60min、90min和120min時自接收側取樣，取樣的體積優選為100 μ L 150 μ L，每次取樣結束後，向所述接收側補足相同體積的Hanks平衡鹽緩衝液。取樣後，將所述樣品溶液進行本領域技術人員熟知的冷凍乾燥後，得到待測樣品。該待測樣品即為附子中生物鹼在Caco-2細胞模型中吸收轉運或外排轉運後得到的待測樣品。得到待測樣品後，以利血平為內標物，採用超高效液相色譜儀和質譜儀對其進行分離檢測，得到質譜圖，具體過程如下cl)將所述待測樣品溶解於甲醇、乙腈和水的混合溶液中，得到待測溶液；c2)向所述待測溶液中加入利血平，然後採用超高效液相色譜儀和質譜儀進行分離檢測，得到質譜圖。得到待測樣品後，將所述待測樣品溶解於甲醇、乙腈和水的混合溶液中，得到待測溶液。所述甲醇、乙腈和水的體積比優選為1 2 1 2 2 4，更優選為1 1 2。為了使得到的結果更為準確，本發明以利血平作為內標物，採用超高效液相色譜儀和質譜儀對所述待測溶液進行分離檢測，得到質譜圖。加入利血平後，得到的溶液中的利血平的濃度優選為300 μ g/L 600 μ g/L，更優選為400 μ g/L 55 μ g/L ；所述超高效液相色譜儀的檢測條件優選為超高效液相色譜儀型號Waters ACQUITY ；色譜柱:WatersAcquity uplc BEH C18 色譜柱(50 毫米 X 2. 1 毫米，1. 7 微米，美國)；流動相A為體積比為50 50的乙腈與甲醇的混合液；流動相B為35mmol/L的乙酸銨溶液，所述乙酸銨溶液用氨水調節pH值至10. 5 ；樣品溶液流速0. 3mL/min ；柱溫35°C；梯度0 lmin，流動相A為90% -57% ;1 2min，流動相A為57% -45% ;2 4. 5min，流動相 A 為 45% -0% ；所述質譜儀的檢測條件優選為質譜儀型號WatersXevo TQ ；ESI離子源，正離子模式；噴霧電壓2.5kV;脫溶劑氣溫度為350°C的N2 ；去溶劑氣流速700L/h ；錐孔氣流速50L/h ；碰撞氣流速為0. 15mL/min的Ar ；離子源溫度120°C。經過超高效液相色譜儀後，附子中的二萜類生物鹼被分離開來；然後經過質譜儀檢測，得到質譜圖；根據得到的質譜圖和預先建立的標準工作曲線可得到各生物鹼在Caco-2細胞模型中的吸收轉運含量。按照本發明，所述標準工作曲線優選按照以下方法建立
dl)提取附子中的二萜類生物鹼，得到生物鹼提取物；d2)以經過Caco-2細胞孵育的Hanks平衡鹽緩衝液為溶劑，配製不同濃度的生物鹼提取物溶液，以利血平為內標物，採用超高效液相色譜儀和質譜儀分別對所述生物鹼提取物溶液進行分離檢測，獲得質譜圖；d3)根據所述生物鹼提取物溶液的濃度和所述質譜圖建立各生物鹼的標準工作曲線。首先按照上文所述的方法提取附子中的二萜類生物鹼，得到生物鹼提取物；將Hanks平衡鹽緩衝液按照本領域技術人員熟知的方法經過Caco-2細胞孵育後，作為溶劑配製不同濃度的生物鹼提取物溶液，所述濃度範圍優選為100μ g/L 15000 μ g/L，更優選為300 μ g/L 10000 μ g/L。分別向所述生物鹼提取物溶液中加入利血平作為內標物，加入所述利血平後，所述利血平的濃度與上文所述的利血平濃度一致。採用超高效液相色譜儀和質譜儀分別對所述加入利血平後得到的溶液進行分離檢測，得到質譜圖。超高效液相色譜儀和質譜儀的工作參數與上文所述的工作參數相同。根據所述生物鹼提取物的濃度和其相應的質譜圖建立各生物鹼的標準工作曲線，具體而言，以生物鹼提取物的濃度為橫坐標、以質譜圖中各生物鹼的峰面積與利血平的峰面積的比值為縱坐標，分別繪製各生物鹼的標準工作曲線，得到各生物鹼的標準工作曲線。得到待測樣品的質譜圖後，根據各生物鹼的峰面積與利血平的峰面積的比值和上述標準工作曲線可以得知總生物鹼濃度，進而判斷各生物鹼的相對濃度，從而得知各生物鹼在Caco-2細胞中吸收轉運情況。超高效液相色譜儀具有較強的分離能力，將經過Caco-2細胞轉運的生物鹼分離開來；質譜儀具有靈敏度高、分析結果準確，不受無機鹽、其他藥物等幹擾；超高效液相色譜儀和質譜儀聯用進行分析檢測的結果較為準確。實驗表明，本發明提供的方法能夠檢測附子中11種生物鹼在Caco-2細胞模型中吸收轉運的含量，而且檢測靈敏度高、結果準確，不受五味子、乾薑等提取物的影響。根據對附子中11種生物鹼在Caco-2細胞中吸收轉運含量的測定結果，可以判斷附子中各生物鹼在人體內的吸收情況，從而提高對附子的利用率。對所述待測樣品進行分離檢測後，根據得到的質譜圖和預先建立的標準工作曲線分別計算各生物鹼的表觀滲透係數Papp，進而分別判斷附子中各類生物鹼在人體中的吸收情況。以次烏頭鹼為例，表觀滲透係數Papp的計算方法具體如下Papp = k · A · C0其中，A為培養板的膜面積，為常數，其單位為cm2 ；C0為次烏頭鹼在Caco-2細胞模型中吸收轉運的初始濃度；k= Δ Q/At，其中，At為轉運時間，Δ Q為次烏頭鹼在At內的轉運量。計算得到各生物鹼的表觀滲透係數Papp後，即可判斷人體對該生物鹼的吸收程度。為了進一步說明本發明，以下結合實施例對本發明提供的檢測附子中二萜類生物鹼在Caco-2細胞模型中吸收轉運含量的方法進行詳細描述。以下各實施例中所用原料均為從市場上購得。實施例11. 1生物鹼的提取
將附子藥材粉末用相當於其體積8倍量的體積濃度為95%的乙醇在25°C下超聲提取池，提取兩次，合併提取液並濃縮成浸膏；用相當於所述浸膏體積5 10倍量的無水乙醇多次溶解浸膏、抽濾除去不溶物質，真空乾燥後得到附子中二萜類生物鹼的提取物；1. 2標準工作曲線的建立以經過Caco-2細胞孵育的HBSS緩衝鹽溶液為溶液，分別配製300 μ g/L、500 μ g/L、1000y g/L、3000y g/L、6000y g/L、8000y g/L 和 10000 μ g/L 的生物鹼提取物溶液，分別向各生物鹼提取物溶液中加入利血平作為內標物，使利血平的濃度為500μ g/L，採用超高效液相色譜儀和質譜儀進行分離檢測，其中，超高效液相色譜儀的檢測條件如下超高效液相色譜儀型號Waters ACQUITY ；色譜柱WatersAcquity uplc BEH C18 色譜柱(50 毫米 X 2. 1 毫米，1. 7 微米，美國)；流動相A為體積比為50 50的乙腈與甲醇的混合液；流動相B為35mmol/L的乙酸銨溶液，所述乙酸銨溶液用氨水調節pH值至10. 5 ；樣品溶液流速0. 3mL/min ；柱溫35°C；梯度0 lmin，流動相A為90% -57% ；1 2min，流動相A為57% -45% ；2 4. 5min，流動相 A 為 45% -0% ；質譜儀檢測條件如下質譜儀型號WatersXevo TQ ；ESI離子源，正離子模式；噴霧電壓2.5kV;脫溶劑氣溫度為350°C的N2 ；去溶劑氣流速700L/h ；錐孔氣流速50L/h;碰撞氣流速為0. 15mL/min的Ar ；離子源溫度120°C;在進行分離檢測時，分離得到了 11種生物鹼，以生物鹼提取物溶液的濃度為橫坐標、質譜中各生物鹼峰面積與利血平峰面積的比值為縱坐標繪製各生物鹼的標準工作曲線，結果參見表1，表1為附子中11種生物鹼的標準工作曲線方程及R2值。表1本發明實施例1提供的附子中11種生物鹼的標準工作曲線方程及R2值
權利要求
1.一種檢測附子中二萜類生物鹼在Caco-2細胞模型中吸收轉運含量的方法，包括以下步驟a)提取附子中的二萜類生物鹼，得到生物鹼提取物；b)將所述生物鹼提取物溶解於Hanks平衡鹽緩衝液中，將得到的溶液作為供給側、Hanks平衡鹽緩衝液作為接收側在Caco-2細胞模型中進行吸收轉運，自接收側取樣，得到待測樣品；c)以利血平為內標物，採用超高效液相色譜儀和質譜儀對所述待測樣品進行分離檢測，得到質譜圖；d)根據所述質譜圖和預先建立的標準工作曲線得到各生物鹼在Caco-2細胞模型中的吸收轉運含量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟a)具體包括將附子粉末浸泡於乙醇中，超聲提取並濃縮後，得到浸膏；將所述浸膏溶解於乙醇中，抽濾，將得到的濾液真空乾燥後得到生物鹼提取物。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述超聲提取的溫度為20°C 30°C。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述超聲提取的時間為Ih 池。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述Hanks平衡鹽緩衝液的pH值為7 8。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟b)具體包括以下步驟bl)將Caco-2細胞接種於培養板上，培養後得到Caco-2細胞模型；b2)將所述生物鹼提取物溶解於Hanks平衡鹽緩衝液中，得到生物鹼提取物溶液；b3)向所述Caco-2細胞模型的絨毛面加入所述生物鹼提取物溶液作為供給側，同時向所述Caco-2細胞模型的基底面加入Hanks平衡鹽緩衝液作為接收側；或者，向所述Caco-2細胞模型的基底面加入所述生物鹼提取物溶液作為供給側，同時向所述Caco-2細胞模型的絨毛面加入Hanks平衡鹽緩衝液作為接收側；b4)將步驟b3)得到的Caco-2細胞模型置于振蕩培養箱中，於培養20min、40min、60min、90min和120min時自接收側取樣，冷凍乾燥後得到待測樣品；每次取樣結束後，補加等量的Hanks平衡鹽緩衝液。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述振蕩培養箱的溫度為35°C 40°C。
8.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述振蕩培養箱的振蕩速度為1轉/s 3 轉/s。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟c)具體包括以下步驟cl)將所述待測樣品溶解於甲醇、乙腈和水的混合溶液中，得到待測溶液；c2)向所述待測溶液中加入利血平，然後採用超高效液相色譜儀和質譜儀進行分離檢測，得到質譜圖。
10.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟d)中的標準工作曲線按照以下方法建立dl)提取附子中的二萜類生物鹼，得到生物鹼提取物；d2)以經過Caco-2細胞孵育的Hanks平衡鹽緩衝液為溶劑，配製不同濃度的生物鹼提取物溶液，以利血平為內標物，採用超高效液相色譜儀和質譜儀分別對所述生物鹼提取物溶液進行分離檢測，獲得質譜圖；d3)根據所述生物鹼提取物溶液的濃度和所述質譜圖建立各生物鹼的標準工作曲線。
全文摘要
本發明提供了一種檢測附子中二萜類生物鹼在Caco-2細胞模型中吸收轉運含量的方法，包括以下步驟a)提取附子中的二萜類生物鹼，得到生物鹼提取物；b)將所述生物鹼提取物溶解於Hanks平衡鹽緩衝液中，將得到的溶液作為供給側、Hanks平衡鹽緩衝液作為接收側在Caco-2細胞模型中進行吸收轉運，自接收側取樣，得到待測樣品；c)以利血平為內標物，採用超高效液相色譜儀和質譜儀對所述待測樣品進行分離檢測，得到質譜圖；d)根據所述質譜圖和預先建立的標準工作曲線得到各生物鹼在Caco-2細胞模型中的吸收轉運含量。超高效液相色譜儀對複雜樣品的分離效果較好，而質譜儀則具有較高的靈敏度和精確性，檢測結果更為準確。
文檔編號G01N30/72GK102590404SQ20111000264
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月7日 優先權日2011年1月7日
發明者劉志強, 劉淑瑩, 宋鳳瑞, 邢俊鵬, 鄭重, 韓天嬌 申請人:中國科學院長春應用化學研究所