類泛素修飾蛋白在抗病毒方面的新用途的製作方法

2023-12-07 07:38:11 2

專利名稱：類泛素修飾蛋白在抗病毒方面的新用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子免疫學和生物醫藥技術領域；更具體地，本發明涉及一種細胞自身表達的能夠調節固有免疫信號通路的蛋白質分子或其調節劑在抗病毒方面的新用途。
背景技術：
病毒感染一直是威脅人類健康的重大病原體，不僅能夠引發愛滋病、禽流感、肝炎等傳染性疾患，還能夠導致細胞變異，誘使癌變。目前已經臨床使用的藥物中，抑制細菌的特效抗生素種類較多，但抑制病毒的特效藥物很少。這很大程度上是因為病毒結構簡單，沒有複雜的細胞器，通常使用宿主細胞的基因轉錄、蛋白質翻譯系統完成自身的生命周期。在長期的對抗過程中，病毒與宿主之間產生了協同進化，宿主細胞(特別是哺乳動物細胞)獲得了固有免疫系統，這一系統是宿主對抗病毒感染的第一道重要防線。所謂固有免疫系統，是相對獲得性免疫系統(Adapt Immune System)而言。在細胞的外膜、胞漿內、內膜等部位分布著大量的受體O^athogenRecognition Receptor ；簡稱PRR)，例如 Toll分子樣受體(Toll-Like Receptor ；簡稱為TLR)，RIG-I, Mda-5等。與此對應，病毒的核酸以及蛋白分子上都有一些能夠被受體識別的固有分子模式(Pathogen Associated Molecular Pattern ；簡稱PAMP)。細胞的PRR識別病毒的PAMP以後，感應到病毒的入侵， 激活下遊信號轉導通路，誘導產生幹擾素、白介素等細胞因子以及其它一些效應分子，建立抗病毒狀態，最終清除病毒或者自我凋亡，從而達到對抗病毒的目的。從識別病原體感染把入侵信號向下遊傳遞，到激活效應基因的轉錄產生清除病原體的效果，再到通過一系列的調控與反饋使細胞回復到正常狀態，參與這一個過程的細胞組分都屬於固有免疫系統。病毒有多種逃避宿主清除的方法，其中很重要的一種就是直接幹擾宿主的固有免疫反應信號通路。通過模擬、拮抗、修飾、降解等多種策略對信號通路中的重要調控節點進行作用，阻斷固有免疫反應的正常運行。例如，C肝病毒(HCV)編碼一種蛋白酶，可以降解固有免疫信號通路一個關鍵節點蛋白MAVS，造成病毒入侵信號不能向下遊傳遞，也就不能激活幹擾素-β (Interferon-β)的表達；高致病性甲型流感依賴自身編碼的NS 1蛋白抑制宿主細胞對病毒入侵的識別並同時幹擾多個下遊效應分子的關鍵性功能阻止細胞產生抗病毒反應。近年病毒學以及分子免疫學的快速發展顯示可以通過人為幹預固有免疫信號通路的方法，達到對抗病毒的目的，例如基因重組的幹擾素藥物已經廣泛用作高效抗病毒藥物，用於對抗B肝病毒等感染。但外源注射的重組蛋白藥物和自身的同源蛋白在序列上，翻譯後修飾上仍然有一些差異，長期使用可能產生針對藥物的免疫反應，引發藥效下降、過敏寸。機體的固有免疫調控通常有嚴格的時序性以及強度性，是一種靈敏而精細的調控，因此如何充分利用固有免疫反應信號通路自身的一些關鍵分子來調控抗病毒反應，是未來生物醫藥開發的方向。因此，本領域需要基於幹預固有免疫信號通路篩選抗病毒藥物的新途徑、新方法。

發明內容
本發明的目的在於提供一種類泛素修飾蛋白在抗病毒方面的新用途。在本發明的第一方面，提供一種泛素連接酶HERC5或其促進劑或抑制劑的用途，用於製備調節固有免疫反應信號轉導通路(Innate Immunity SignalTransduction Pathway)的組合物。在一個優選例中，所述的固有免疫反應信號轉導通路包括幹擾素調節因子 3(IRF3)介導的信號轉導通路。在另一優選例中，所述的泛素連接酶HERC5或其促進劑用於製備促進固有免疫反應信號轉導通路的激活的組合物。在另一優選例中，所述的組合物還用於抑制病毒；較佳地，抑制病毒在宿主細胞內複製和/或擴增。在另一優選例中，所述的泛素連接酶HERC5包括(a)如SEQ ID NO 2所示胺基酸序列的蛋白；(b)將(a)所限定的蛋白的胺基酸序列經過一個或多個(如1-20個，較佳的1_10 個，更佳的1-5個)胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(c) (a)限定的蛋白的保守性變異蛋白質或其活性片段。較佳地，所述的泛素連接酶HERC5具有SEQ ID NO 2中第681-10 位胺基酸序列 (具有催化類泛素化分子(ISG15)修飾能力的完整HECT結構域)。較佳地，所述的泛素連接酶HERC5或其衍生蛋白在對應於SEQ ID NO :2中第994 位的位置上是半胱氨酸(Cys)。在另一優選例中，所述的組合物還用於提高干擾素β的表達。在另一優選例中，所述的組合物還用於抑制幹擾素調節因子3的泛素化降解(通過與幹擾素調節因子3(IRF3)相互作用)。在另一優選例中，所述的泛素連接酶HERC5的抑制劑用於製備抑制幹擾素調節因子3介導的信號轉導通路的激活的組合物。在另一優選例中，所述的泛素連接酶HERC5的抑制劑是特異性幹擾泛素連接酶 HERC5基因表達(沉默泛素連接酶HERC5的mRNA)的幹擾分子。在另一優選例中，所述的幹擾分子具有SEQ ID NO 3所示的序列。在另一優選例中，所述的泛素連接酶HERC5的促進劑是一重組表達載體，所述表達載體中含有編碼泛素連接酶HERC5的基因。較佳的，所述編碼泛素連接酶HERC5的基因具有SEQ ID NO 1所示的序列。在另一優選例中，所述的泛素連接酶HERC5的促進劑是假病毒或仙臺病毒，其在刺激細胞後促進細胞表達泛素連接酶HERC5。在另一優選例中，所述的組合物還用於促進幹擾素調節因子3的泛素化降解。在本發明的另一方面，提供一種篩選調節固有免疫反應信號轉導通路的潛在物質的方法，所述的方法包括(1)將候選物質與表達泛素連接酶HERC5的體系接觸；
(2)檢測候選物質對泛素連接酶HERC5的影響；若所述候選物質提高泛素連接酶HERC5的表達或活性，則表明該候選物質是促進固有免疫反應信號轉導通路的激活的潛在物質；若所述候選物質抑制泛素連接酶HERC5的表達或活性，則表明該候選物質是抑制固有免疫反應信號轉導通路的激活的潛在物質。在一個優選例中，步驟(1)包括在測試組中，將候選物質加入到表達泛素連接酶 HERC5的體系中；和/或步驟⑵包括檢測測試組的體系中泛素連接酶HERC5的表達或活性，並與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的表達泛素連接酶HERC5的體系；如果測試組中泛素連接酶HERC5的表達或活性在統計學上高於(優選顯著高於， 如高20%以上，較佳的高50%以上；更佳的高80%以上)對照組，就表明該候選物質是促進固有免疫反應信號轉導通路的激活的潛在物質；如果測試組中泛素連接酶HERC5的表達或活性在統計學上低於(優選顯著低於， 如低20%以上，較佳的低50%以上；更佳的低80%以上)對照組，就表明該候選物質是抑制固有免疫反應信號轉導通路的激活的潛在物質。在另一優選例中，步驟(1)中，所述體系中還表達幹擾素調節因子3，且所述的泛素連接酶HERC5與幹擾素調節因子3相互作用(相互結合)；以及步驟( 包括檢測候選物質對泛素連接酶HERC5與幹擾素調節因子3相互作用的影響；若所述候選物質促進泛素連接酶HERC5與幹擾素調節因子3相互作用，則表明該候選物質是促進固有免疫反應信號轉導通路的激活的潛在物質；若所述候選物質抑制泛素連接酶HERC5與幹擾素調節因子3相互作用，則表明該候選物質是抑制固有免疫反應信號轉導通路的激活的潛在物質。在另一優選例中，步驟(1)包括在測試組中，將候選物質加入到表達泛素連接酶 HERC5和幹擾素調節因子3的體系中；和/或步驟⑵包括檢測測試組的體系中泛素連接酶HERC5與幹擾素調節因子3的相互作用，並與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的表達泛素連接酶 HERC5和幹擾素調節因子3的體系；如果測試組中泛素連接酶HERC5與幹擾素調節因子3的相互作用在統計學上強於 (優選顯著強於，如強20 %以上，較佳的強50 %以上；更佳的強80%以上)對照組，就表明該候選物質是促進固有免疫反應信號轉導通路的激活的潛在物質；如果測試組中泛素連接酶HERC5與幹擾素調節因子3的相互作用在統計學上弱於(優選顯著弱於，如弱20%以上， 較佳的弱50%以上；更佳的弱80%以上)對照組，就表明該候選物質是抑制固有免疫反應信號轉導通路的激活的潛在物質。在另一優選例中，所述的體系選自細胞體系、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、 器官體系或動物體系。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1.人HERC5蛋白質的cDNA編碼序列(SEQ ID NO 1)。來源於人細胞總mRNA反轉錄後得到的目標序列測序結果。其中，蛋白編碼區位於第154-32 位。圖 2.人 HERC5 基因的 SiRNA 序列(SiRNA_HERC5，SEQ ID NO 3)。圖3.人HERC5基因編碼的蛋白質序列(SEQ ID NO 2)。為所獲得的cDNA序列按照真核細胞使用的密碼子進行翻譯的序列。圖4. HERC5影響IRF3信號通路的報告基因試驗柱形圖。INF β-Iuc (序列及方法參考 Yang et al. J Immunol. 182 (6) :3782-92)為幹擾素-β的特異性報告基因質粒，它上面有多個轉錄因子的結合位點，其中主要有IRF3、API 以及 NF- κ B 的結合位點；PRDIII-I-Iuc (序列及方法參考 Yang et al. JImmunol. 182 (6) 3782-92)為IRF3轉錄因子的特異性報告基因質粒；κ B-Iuc (序列及方法參考Yang et al. J Immunol. 182(6) :3782-92)為NF-κ B的特異性報告基因質粒；本圖顯示:HERC5通過影響IRF3信號通路而影響到下遊的幹擾素-β的表達，而不是NF-κ B信號通路。圖5. HERC5對IRF3泛素化降解的影響。使用SiRNA-HERC5序列以及它的負對照SiRNA-NC (序列是 5，-UUCUCCGAAGGUGUCACGU-3，(SEQ ID NO :8))分別處理被仙臺病毒GeV)感染的細胞，結果SiRNA-HERC5能夠降低細胞內源的HERC5的表達水平，但是SiRNA-NC卻不能；同時HERC5 的表達水平的降低造成了 IRF3被泛素化的程度增高，降解加速。圖6. HERC5對細胞抗病毒能力的促進作用。在四31~細胞中分別轉染質粒以及SiRNA序列調節細胞內的HERC5的表達量，培養一段時間以後，再使用NDV病毒感染細胞，再培養一段時間讓病毒擴增。使用螢光顯微鏡觀察空斑的形成，空斑多代表病毒濃度高。
具體實施例方式本發明人經過廣泛的研究，首次揭示HERC5蛋白是一種對於調節固有免疫反應信號轉導通路有用的物質。其通過與幹擾素調節因子3 (IRF3)相互作用，催化ISG15修飾IRF3 的多個殘基位點(包括Lysl93，Lys360, Lys366)，抑制IRF3的泛素化，促進細胞分泌幹擾素，再進一步通過幹擾素下遊通路固有免疫的直接效應分子(包括H(R，OAS，RNase L等)。 因此，HERC5蛋白及其促進劑是對於抑制病毒(特別是高致病性甲型流感等新發病毒)有效的物質；同時，HERC5蛋白本身或HERC5蛋白與IRF3蛋白的相互作用可以作為篩選抑制病原體藥物的靶點。如本文所用，所述的「含有」、「具有」或「包括」包括了「包含」、「主要由......構
成」、「基本上由......構成」、和「由......構成」；「主要由......構成」、「基本上
由......構成」和「由......構成」屬於「含有」、「具有」或「包括」的下位概念。如本文所用，所述的「病毒」包括在病毒學專業領域中，被列入DNA病毒、RNA病毒和逆轉錄病毒所屬的各種病毒，只要所述病毒在侵入後能夠被機體的固有免疫反應信號轉導通路(如IRF3介導的信號轉導通路)的激活所抑制。所述的病毒還包括所有能夠被幹擾素(特別是幹擾素β)抑制的病毒。例如，所述的病毒選自仙臺病毒，NDV病毒等。HERC5蛋白及其用途
HERC5蛋白是HECT蛋白家族的成員之一。HERC5家族在哺乳動物細胞中已經有多個同源物，例如HERC3、HERC4、HERC6等。HERC家族擁有一個HECT結構域，能夠催化細胞內的一些蛋白分子發生泛素化⑴bquitination)，因此被稱為泛素連接酶(E3 ligase)，在細胞的生理過程中扮演各種各樣不同的角色，目前還沒有關於HERC5在抗病毒作用方面的直接報導。本發明人第一次證實了 HERC5參與了 IRF3介導的信號轉導通路，並且是一個可抑制病毒擴增的蛋白。它通過和IRF3相互作用，催化IRF3發生類泛素化修飾，影響脯氨酸順反異構酶Pin蛋白對磷酸化激活的IRF3進行構象改變，減慢IRF3的泛素化降解，維持IRF3 信號通路的持續激活，促進細胞分泌幹擾素。因此，HERC5是抗病毒藥物設計的新靶點。HERC5蛋白在獸亞綱哺乳動物中是較為保守的，不同哺乳動物中其胺基酸序列的同源性很高；並且，存在相同且高度保守的結構域，在蛋白高級結構上非常接近，因此本發明所述的HERC5蛋白是來源於哺乳動物(如人、鼠、猴、羊、牛等)的任何一種HERC5蛋白。在本發明中，所用的HERC5蛋白可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自哺乳動物。此外，所述的HERC5蛋白也可以是人工製備的，比如可以根據常規的基因工程重組技術來生產重組HERC5蛋白。任何適合的HERC5蛋白均可用於本發明。所述HERC5蛋白包括全長的HERC5蛋白或其生物活性片段。優選的，所述HERC5蛋白的胺基酸序列可以與SEQ ID NO 2所示的序列基本上相同，其編碼序列例如可以與SEQ ID NO=I所示的序列基本上相同。經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的HERC5蛋白的胺基酸序列也包括在本發明中。HERC5蛋白或其生物活性片段包括一部分保守胺基酸的替代序列，所述經胺基酸替換的序列並不影響其活性或保留了其部分的活性。適當替換胺基酸是本領域公知的技術，所述技術可以很容易地被實施並且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術使本領域人員認識到，一般來說，在一種多肽的非必要區域改變單個胺基酸基本上不會改變生物活性。見Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/ Cummings Pub. Co. P224。任何一種HERC5蛋白的生物活性片段都可以應用到本發明中。在這裡，HERC5蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的HERC5蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長HERC5蛋白的活性。在更優選的條件下，所述活性片段能夠保持全長HERC5蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、 或100%的活性。較佳地，所述的HERC5蛋白的生物活性片段具有SEQ ID NO 2中第681-10 位胺基酸序列，該序列包含有催化類泛素化分子(ISG15)修飾能力的完整HECT結構域。較佳地，所述的HERC5蛋白中相對於SEQ ID NO 2中第994位的位置是半胱氨酸(Cys)。本發明也可採用經修飾或改良的HERC5蛋白，比如，可採用為了促進其半衰期、有效性、代謝和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的HERC5蛋白。所述經過修飾或改良的 HERC5蛋白可以是與天然存在的HERC5蛋白具有較小的共同點，但也能調節哺乳動物的固有免疫反應信號轉導通路，且不會帶來其它不良影響或毒性。也就是說，任何不影響HERC5 蛋白的生物活性的變化形式都可用於本發明中。基於本發明人的新發現，本發明提供了 HERC5蛋白的用途，用於製備調節固有免疫反應信號轉導通路的組合物；或用於篩選調節固有免疫反應信號轉導通路的物質。例如，所述的HERC5用於促進固有免疫反應信號轉導通路的激活，與IRF3相互作用，減緩IRF3的泛素化，促進IRF3信號轉導通路的激活，促進細胞分泌幹擾素。所述的HERC5蛋白通過調控細胞對外界病原體感染的應激反應強度，達到抗感染，特別是抗病毒感染的目的。幹擾素調節因子3幹擾素調節因子3 (Interferon Regulatory Factor 3 ；簡稱IRF!3)是固有免疫反應信號轉導通路中關鍵性的節點分子。它是一個轉錄因子，負責一系列下遊效應靶基因的激活，因此發生在IRF3上的微小變化，會造成下遊效應的巨大變化。細胞進化出多種調控 IRF3轉錄激活活性的手段。靜息狀態下，IRF3呈自抑制狀態，主要分布在胞質中。在病毒感染激活上遊信號通路以後，IRF3的多個殘基位置發生磷酸化，分子構象發生改變並轉變成二聚體，進入細胞核內結合到DNA上，啟動基因的轉錄。完成使命以後，又會很快地被一個叫做Pinl的脯氨酸異構酶改變構象，再被一個尚未鑑定的泛素連接酶(Ε； )泛素化，轉運到蛋白酶體中降解。作為本發明的優選方式，所述的IRF3蛋白的胺基酸序列可以與GenBank登錄號NP_001562. 1所示(或SEQ ID NO :7所示)的序列基本上相同，其核苷酸序列可以與 GenBank登錄號NM_001571. 4所示的序列基本上相同。此外，可與HERC5蛋白發生相互作用的IRF3蛋白的生物活性片段或衍生蛋白也可用於本發明。HERC5的促進劑或抑制劑及其用途如本文所用，所述的HERC5的促進劑包括了上調劑、激活劑、激動劑等。任何可提高HERC5蛋白的活性、維持HERC5蛋白的穩定性、促進HERC5蛋白的表達、延長HERC5蛋白有效作用時間、或促進HERC5基因的轉錄和翻譯的物質均可用於本發明，作為可用於促進固有免疫反應信號轉導通路的激活的有效物質。如本文所用，所述的HERC5的抑制劑包括了下調劑、阻滯劑、阻斷劑、拮抗劑等。任何可降低HERC5蛋白的活性、降低HERC5蛋白的穩定性、抑制HERC5蛋白的表達、減少HERC5 蛋白有效作用時間、或抑制HERC5基因的轉錄和翻譯的物質均可用於本發明，作為可用於抑制固有免疫反應信號轉導通路的激活的有效物質。作為本發明的優選方式，所述的HERC5的促進劑例如是一表達載體，所述表達載體包含一基因盒，所述的基因盒含有編碼HERC5的基因及與之操作性相連的表達調控序列。所述表達載體在轉入細胞後表達(或過表達)HERC5蛋白。更優選地，所述的表達載體是 pCMV-HERC5 載體。作為本發明的優選方式，所述的HERC5的抑制劑是(但不限於)特異性抗HERC5 的抗體，所述的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，只要其對於HERC5具有特異性結合能力，且能夠通過與HERC5的結合而抑制HERC5的活性；或特異性抑制HERC5編碼基因的轉錄或翻譯的幹擾分子或反義核苷酸。針對已知蛋白或已知基因的幹擾分子或反義核苷酸的製備方法是本領域人員熟知的。更優選地，所述的幹擾分子是小幹擾RNA，具有SEQ ID NO 3所示的序列；或其它天然以及化學合成的小分子，具有抑制HERC5的類泛素化催化功能。本發明還提供了 HERC5蛋白的促進劑的用途。所述的HERC5的促進劑用於製備調節固有免疫反應信號轉導通路的組合物。例如，所述的HERC5的促進劑通過促進HERC5的表達或活性，促進固有免疫反應信號轉導通路的激活，減緩IRF3的泛素化，促進IRF3信號轉導通路的激活，促進細胞分泌幹擾素，進而發揮抑制病毒的作用。
本發明還提供了 HERC5蛋白的抑制劑的用途。所述的HERC5的抑制劑用於製備調節固有免疫反應信號轉導通路的組合物。例如，所述的HERC5的抑制劑通過抑制HERC5的表達或活性，抑制固有免疫反應信號轉導通路的激活，促進IRF3的泛素化，抑制IRF3信號轉導通路的激活。篩選調節固有免疫反應信號轉導通路的潛在物質在得知了所述的HERC5蛋白對於調節固有免疫反應信號轉導通路的用途後，可以基於該特徵來篩選通過調節HERC5的活性或表達調節固有免疫反應信號轉導通路的物質。因此，本發明提供一種篩選可用於調節固有免疫反應信號轉導通路的潛在物質的方法，所述的方法包括將候選物質與表達HERC5蛋白的體系接觸；和檢測候選物質對 HERC5蛋白的影響；若所述候選物質可提高HERC5蛋白的表達或活性，則表明該候選物質是可用於促進固有免疫反應信號轉導通路的潛在物質；若所述候選物質可降低HERC5的表達或活性，則表明該候選物質是可用於抑制固有免疫反應信號轉導通路的潛在物質。在本發明的優選方式中，在進行篩選時，為了更易於觀察到HERC5蛋白的表達或活性的改變，還可設置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質的表達HERC5的體系。本發明還提供一種調節固有免疫反應信號轉導通路相關的複合體，所述的複合體含有HERC5蛋白和IRF3蛋白，兩種蛋白相互結合。本發明人通過免疫共沉澱技術證明， HERC5蛋白和IRF3蛋白能夠相互結合，形成複合體。本發明人的發現提示HERC5通過與 IRF3的相互作用，調節IRF3相關的信號轉導通路。可利用所述的複合體篩選調節HERC5與 IRF3相互作用的物質，該物質通過影響HERC5與IRF3相互作用調節IRF3相關的信號轉導通路。基於以上新發現，本發明還提供了一種篩選調節固有免疫反應信號轉導通路的潛在物質的方法，所述方法包括向HERC5蛋白和IRF3蛋白相互作用(相互結合)的反應體系中添加待篩選的候選物質，並檢測HERC5蛋白和IRF3蛋白相互作用情況；如果HERC5蛋白和IRF3蛋白的相互作用在統計學上減弱，就表明該候選物質是抑制固有免疫反應信號轉導通路的潛在物質；如果HERC5蛋白和IRF3蛋白的相互作用在統計學上增強，就表明該候選物質是促進固有免疫反應信號轉導通路的潛在物質。在本發明的優選方式中，在進行篩選時，為了更易於觀察到HERC5蛋白和IRF3蛋白相互作用的變化，還可設置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質的、HERC5蛋白和IRF3蛋白相互作用的反應體系。在本發明中，檢測蛋白與蛋白之間相互作用以及相互作用的強弱可採用多種本領域技術人員熟知的技術，比如GST沉降技術、噬菌體展示技術、酵母雙雜交系統或免疫共沉澱技術。在本發明的一個優選例中，採用了免疫共沉澱技術來鑑定HERC5蛋白和IRF3蛋白的相互作用。所述的免疫共沉澱技術的原理是在保持蛋白-蛋白相互作用的條件下，收穫和裂解細胞，從細胞提取液中特異性地免疫沉澱目的蛋白，然後通過電泳等方法分離免疫沉澱物。具有已知特性的蛋白的共沉澱，可採用抗該蛋白的抗體，通過比如Western印跡來檢測。此外，如果細胞在裂解前已經用標記物進行過標記，則可通過放射自顯影或其它免疫學技術來觀察共沉澱的蛋白。作為本發明的優選方式，所述的方法還包括對獲得的潛在物質進行進一步的細胞試驗或動物試驗，以進一步選擇和確定對於調節固有免疫反應信號轉導通路有用的物質。本發明所述的體系包括但不限於細胞(包括原核細胞，真核細胞)或細胞培養物體系、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。另一方面，本發明還提供了採用所述篩選方法獲得的可用於調節固有免疫反應信號轉導通路的潛在物質。這些初步篩選出的物質可構成一個篩選庫。組合物本發明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.00000 l-50Wt% ；較佳的 0. 00001-20wt% ；更佳的，0. 0001-10wt% )的所述的HERC5蛋白，或其促進劑或抑制劑，以
及藥學上可接受的載體。所述的組合物可直接用於調節固有免疫反應信號轉導通路。此外， 還可同時與其它治療劑或輔劑聯合使用。如本文所用，「藥學上可接受的」的成分是適用於人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即具有合理的效益/風險比的物質。術語「藥學上可接受的載體」指用於治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。本發明的組合物含有安全有效量的HERC5蛋白或其促進劑或抑制劑，以及藥學上可接受的載體。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物製劑應與給藥方式相匹配，本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發明的藥物製劑還可製成緩釋製劑。本發明所述的HERC5蛋白或其促進劑或抑制劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限於所述的HERC5蛋白或其促進劑或抑制劑的藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當本發明的HERC5蛋白或其生物活性片段每天以約0. 00001-50mg/kg動物體重(較佳的0. OOOl-lOmg/kg動物體重)的劑量給予，能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或將劑量按比例地減少。本發明的主要優點在於首次證明HERC5蛋白是調控宿主細胞固有免疫反應信號轉導通路的重要分子，能夠影響幹擾素的表達，對抗病毒感染。可通過HERC5蛋白或其促進劑或抑制劑來調控細胞對外界病原體感染的應激反應強度，達到抗感染，特別是病毒感染的目的。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人《分子克隆實驗室指南》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。I .材料和方法1. HERC5 cDNA 的克隆本發明的實施例中，使用hvitrogen公司1Trizol試劑抽提細胞RNA，使用Promega公司反轉錄試劑盒進行cDNA的合成，步驟如下A)選擇生長良好的四31~細胞(購自ATCC)，吸去培養基，無菌PBS衝洗。使用PBS 吹起懸浮以後，在血細胞計數板上計數。收集5X IO6個細胞於1.5ml EP管中，加入Iml Trizol試劑後，用移液器將細胞吹散開，室溫放置5分鐘，讓細胞完全裂解。B)在裂解液中加入0. 2ml氯仿，于振蕩器上劇烈震蕩，使兩相溶液充分混合。室溫放置3分鐘後，4°C 12000g高速離心15分鐘，此時溶液呈兩相，所需RNA在上層無色水相中。C)小心將水相轉移到一個新的EP管中，加入0. 5ml異丙醇，震蕩混勻後放置室溫 15分鐘，4°C 12000g高速離心10分鐘，此時RNA呈膠狀沉澱在EP管底部。D)加入1. 5ml 75%乙醇對沉澱的RNA進行震蕩分散，4°C 7500g離心5分鐘，小心吸去上清。重複清洗步驟一次。倒置EP管，讓殘留的乙醇自然揮發，獲得分離的RNA作為模板。E)在完全乾燥之前，向EP管中加入無RNA酶的水，輕吹分散，在55°C水浴中溶解 10分鐘，測定A26W，確定數值在1. 6左右，按照吸光度定量。F)取一滅菌的無RNA酶的EP管，加入1μ g RNA模板和0. 5 μ g引物(oligo-dT)。 調整體積至15μ 1，70°C處理5分鐘，冷卻至室溫，離心使溶液集中在管底，再依次加入5X 第一鏈緩衝液5 μ 1、RNA酶抑制劑25U、M-MLV反轉錄酶200U後，用H2O調至總體積25 μ 1， 震蕩混勻。G)離心將反應液集中在管底，在Eppendorf PCR儀上，42°C溫浴1小時，完成後取出置於冰上，獲得HERC5 cDNA，其序列如圖1 (SEQ ID NO 1)，編碼如圖3 (SEQ ID NO 2)所示的蛋白序列。2. HERC5原核表達載體的構建得到HERC5 cDNA後，使用"Toyobo公司高保真KOD PCR試劑盒擴增目標基因。A)取薄壁PCR管向其中依次加入5 μ 1 IOXPCR緩衝液、4μ 1 dNTP、1 μ 1酶、1 μ 1 cDNA模板、兩端引物各1 μ 1，並用去離子水調至總體積50 μ 1。兩條引物序列為HERC5-5，ACTGGAATTCATGGAGCGGAGGTCGCGGAG(SEQ ID NO 4)；HERC 5-3，AGTCTCGAGTCAGCCAAATCCTCTGTTGTTG(SEQ ID NO :5)。B)震蕩混合均勻後，離心收集反應液於PCR管底，使用下列程序進行目標片段擴增95 °C 5分鐘，94°C 20秒，55°C 25秒，68°C 4分鐘，30個循環。C)瓊脂糖電泳檢測PCR產物，選取條帶大小正確，條帶清晰的樣品，進行切膠純化。D)純化產物使用EcoRI、XhoI雙酶切，37 °C反應2小時，瓊脂糖電泳，再次進行切膠純化，用作外源片段。E)使用 EcoRI、XhoI 對 PGEX_6p_l (購自 Amersham Pharmacia 公司)以及進行雙酶切，37°C反應2小時，瓊脂糖電泳，切膠純化切出的線性片段，用做載體大片段。F)使用T4連接酶連接外源片段以及載體大片段，16°C放置過夜，轉化DH5ci大腸桿菌感受態細胞。培養過夜，挑取單克隆送樣測序。G)測序正確的克隆，製備甘油菌，於_80°C長期保存。3.外源DNA載體以及SiRNA的轉染
本發明人設計了人HERC5基因的SiRNA序列(SiRNA_HERC5)，序列如圖2 (SEQ ID NO 3)所示。對於小量外源DNA以及SiRNA的轉染使用hvitrogen公司的Lipofectamine 2000試劑盒完成，這裡所指出的「適量」或「適合」是參照hvitrogen公司Lipofectamine 2000說明書確定。A)在轉染前一天，將健康生長細胞按照適合密度轉接到新的12孔培養板中，加入不含抗生素的DMEM培養基培養，培養過夜。B)當細胞生長密度達到覆蓋80%培養板底部時，開始轉化。首先用不含有血清的 OPTi-DMEM將DNA和RNA幹擾分子(siRNA)稀釋到適當濃度，輕輕地混合。再用不含有血清的OPTi-DMEM將適量Lipofectamine 2000脂質體稀釋到適當濃度，輕輕混勻。放置5分鐘後，將兩個溶液混合，再在室溫放置20分鐘。C)取適量加入到12孔細胞培養板中，放置二氧化碳培養箱中，37°C繼續培養適當時間，進行後續步驟。II .實施例實施例1.通過免疫共沉澱(co-IP)研究HERC5與IRF3相互作用先前已經知道，與IRF3擁有直接相互作用的蛋白質分子有多種。本發明重點關注 IRF3信號通路被病毒激活後，與IRF3擁有直接相互作用的蛋白質分子，因為這類分子可能在宿主細胞抗病毒過程中起到重要作用。首先使用普通仙臺病毒購自武漢病毒所)的方法(參見Yang et al. JImmunol. 182(6) =3782-92)模擬病毒對細胞的IRF3信號通路的激活。收集細胞後，進行裂解，離心取細胞裂解上清，再使用抗IRF3的單克隆抗體(購自Abeam)進行co-IP 試驗。經過銀染鑑定，發現有一個IlOkDa左右的條帶在刺激前後表達量有明顯變化。對該條帶切膠鑑定，質譜分析顯示該條帶是HERC5蛋白。使用抗HERC5的特異性抗體(購自AbMART)對該條帶進行免疫雜交(Western Blotting)，證實了質譜鑑定的結果。實施例2.克隆HERC5的cDNA序列HERC5是一個IlOkDa左右的蛋白，是HECT蛋白家族成員。這一家族蛋白有一些共同特徵在蛋白質的C端有一個HECT結構域(在人的HERC5蛋白(圖幻上包括殘基位 681-10M)，並且994殘基位被半胱氨酸(Cys)佔據。使用RNA抽提試劑盒抽提四31~細胞RNA以後，使用通用引物Oligo dT進行反轉錄獲得cDNA，再使用兩端序列引物進行擴增。5』端帶有EcoRI限制性內切酶位點，3』端有 XhoI限制性內切酶位點。擴增產物電泳以後，切下目標條帶，轉入常規載體中測序，測序後拼接結果見圖1。製備甘油菌，凍存於-80°C。實施例3.原核表達HERC5以及真核表達HERC5HERC5的DNA編碼序列獲得以後，使用EcoRI和BioI雙酶切，再轉入到大腸桿菌表達載體PGEX-6p-l的相應位點中。這種載體是原核表達載體，擁有Lac操縱子，在大腸桿菌中受IPTG誘導而表達。PGEX-6p-l載體編碼一個穀胱甘肽轉移酶(GST)，因此相應的 HERC5表達產物是連接有GST的融合蛋白，可以通過穀胱甘肽(GSH)樹脂進行親和純化。同時GST-HERC5融合蛋白上有一個蛋白酶的切點(LEVLF丨GP)，通過流感鼻病毒的3C蛋白酶可以在柱對融合蛋白進行酶解，可以將HERC5與GST蛋白分離開來。真核表達的方法與原核類似，使用EcoRI和B10I雙酶切後，將編碼HERC的基因序列接入pCMV真核表達載體(購自Clontech公司)中，轉化大腸桿菌後，挑單克隆擴增質粒。 使用hvitrogen轉染試劑Lipofectamine 2000轉染等細胞株，適當條件培養16小時，可以檢測到細胞內的外源HERC5表達。表達產物根據基因序列翻譯後得到的蛋白質一級殘基序列見圖3。實施例4. IFR3介導的細胞信號轉導通路受到HERC5影響早期已經知道HERC5是一個泛素連接酶Ε3，那麼它對IRF3轉錄因子的調控可能與它的Ε3活性有關係。本發明人首先使用表達HERC5的真核載體pCMV轉染細胞，再使用仙臺病毒6eV，購自武漢病毒所)刺激轉染以及未轉染的細胞，報告基因實驗(方法參考 Yang et al. J Immunol. 182(6) :3782-92)結果顯示外源轉入的 HERC5 (過表達 HERC5)能夠促進細胞分泌幹擾素-β，而過表達HERC5突變體(第994位由C突變為Α)沒有該作用， 見圖4。前面已經介紹幹擾素-β的分泌受到IRF3信號通路的調控，而幹擾素-β的表達量提高能夠促進細胞對抗病毒的能力。在過表達(Over-expression)實驗之後，本發明還使用了 RNA幹擾(Knock-down) 的方法降低了細胞內的HERC5的表達量。此時，報告基因的結果顯示細胞分泌幹擾素的能力隨著HERC5表達量的降低而降低。定量PCR以及其它一些實驗的結果也證實了 HERC5 通過與IRF3相互作用，影響IFR3介導的細胞信號轉導通路，調控細胞分泌幹擾素。上述結果顯示，HERC5是一個幹擾素正調控因子，能夠幫助細胞分泌幹擾素。實施例5. RNA幹擾HERC5影響IRF3的泛素化降解本發明人對IRF3的泛素化進行了深入研究。前面已經介紹了 IRF3被磷酸化激活以後，結合到受它調控的基因的啟動子區域，誘導下遊基因轉錄。完成任務以後，IRF3首先被Pinl蛋白改變構象，再被一個未知的泛素連接酶Ε3泛素化，轉運到蛋白酶體中降解(參考Yang et al. J Immunol. 182(6) :3782-92)。因此，IRF3的泛素化程度越高，則說明細胞對IRF3的降解速度越快。在仙臺病毒刺激時，通過MG132抑制蛋白酶體降解，可以觀測到 IRF3的泛素化。如果此時再對內源的HERC5進行RNA幹擾，可以發現IRF3的泛素化降解明顯快，見圖5。在本發明中，本發明人還使用點突變的方法證實了 HERC5通過類泛素化(催化 ISG15，序列參見 SEQ ID NO :6，Gene Bank 登錄號NP_005092)修飾 IRF3(序列參見 SEQ ID NO :7，GeneBank 登錄號ΝΡ_001562· 1)的 Lysl93、Lys360、Lys366 (參考 Yang et al. J Immunol. 182 (6) :3782-92)，影響了 Pinl對IRF3的構象轉變作用。已經有報導Pinl對IRF3 的構象轉變作用發生在IRF3被泛素化之前，因此可以理解HERC5與IRF3之間的相互作用能夠影響IRF3的泛素化降解。實施例6. HERC5對細胞抗病毒能力的影響如前所述，為了研究HERC5對細胞抗病毒能力的直接影響，本發明人使用外源 HERC5真核表達質粒以及HERC5的RNA幹擾序列轉染細胞，細胞培養一段時間以後再使用仙臺病毒刺激。感染後的細胞培養M小時後，收集培養基上清，離心後一部分用作 ELISA實驗直接測定幹擾素-β的含量，實驗結果表明轉染外源HERC5表達載體的細胞培養基離心上清中幹擾素-β的含量明顯上升，而RNA幹擾內源的HERC5使培養基離心上清中的幹擾素-β的含量顯著降低。同時外轉喪失連接酶活性的HERC5的C994A突變體則沒有促進幹擾素-β表達上升的功能。另外，SiRNA幹擾處理的離心上清被直接用作抗病毒實驗。把離心上清加
細胞的培養基中，再使用NDV病毒(購自ATCC)感染，進行病毒空斑試驗。結果顯示與沒有使用NC序列處理的對照組細胞相比，使用HERC5RNA幹擾後的上清處理的細胞形成的空斑增加，死亡率顯著升高(圖6)。該研究結果證實轉染外源HERC5能夠增加細胞培養上清中幹擾素-β的分泌量，促進細胞對抗病毒感染。反之，轉染HERC5的SiRNA序列，能夠減弱培養細胞分泌幹擾素-β的能力，使得細胞易於被病毒感染。總之，HERC5在細胞抗病毒過程中扮演重要角色，是抗病毒藥物設計的關鍵靶點蛋白。實施例7.篩選藥物使用前述細胞(含有IRF3信號通路)作為模型，在細胞內構建篩選體系。設置以下組測試組用候選物質處理的細胞；對照組不用候選物質處理的細胞。經過上述處理後，用裂解緩衝液裂解細胞，通過免疫雜交以及免疫共沉澱的方法觀察HERC5以及IRF3的表達量改變，同時觀察兩種蛋白的相互作用情況以及IRF3被ISG15 修飾的情況。如果與對照組相比，測試組中的HERC5與IRF3蛋白表達量或者相互作用顯著增強，則說明該候選物質是潛在的促進固有免疫反應信號轉導通路的激活的物質；反之，如測試組中的HERC5與IRF3蛋白相互作用顯著變弱，則說明該候選物質是潛在的抑制固有免疫反應信號轉導通路的激活的物質。同樣，使用ISG15抗體檢查IRF3的修飾程度，如果ISG15化的程度提高，說明該候選物質是潛在的促進固有免疫反應信號轉導通路的激活的物質；反之，如測試組中的IRF3 蛋白的ISG15修飾顯著變弱，則說明該候選物質是潛在的抑制固有免疫反應信號轉導通路的激活的物質。總之，本發明使用分子生物學、細胞生物學、免疫學等技術手段證實了 HERC5能夠與IRF3直接相互作用，阻斷磷酸化激活的IRF3分子被Pinl作用，進而抑制IRF3分子的泛素化降解。也指出了通過外源導入DNA或者SiRNA的手段，能夠改變細胞內HERC5的表達水平，進而影響細胞內IRF3介導的信號轉導通路。同時，由於IRF3介導的信號轉導通路主要負責細胞對抗病毒感染，因此HERC5分子是一個新的抗病毒藥物設計靶點。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣屬於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種泛素連接酶HERC5或其促進劑或抑制劑的用途，用於製備調節固有免疫反應信號轉導通路的組合物。
2.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的固有免疫反應信號轉導通路包括幹擾素調節因子3介導的信號轉導通路。
3.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的泛素連接酶HERC5或其促進劑用於製備促進固有免疫反應信號轉導通路的激活的組合物。
4.如權利要求3所述的用途，其特徵在於，所述的組合物還用於抑制病毒。
5.如權利要求3所述的用途，其特徵在於，所述的組合物還用於提高干擾素β的表達。
6.如權利要求3所述的用途，其特徵在於，所述的組合物還用於抑制幹擾素調節因子3 的泛素化降解。
7.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的泛素連接酶HERC5的抑制劑用於製備抑制幹擾素調節因子3介導的信號轉導通路的激活的組合物。
8.如權利要求7所述的用途，其特徵在於，所述的泛素連接酶HERC5的抑制劑是特異性幹擾泛素連接酶HERC5基因表達的幹擾分子。
9.如權利要求8所述的用途，其特徵在於，所述的幹擾分子具有SEQIDNO :3所示的序列。
10.如權利要求7所述的用途，其特徵在於，所述的組合物還用於促進幹擾素調節因子 3的泛素化降解。
11.一種篩選調節固有免疫反應信號轉導通路的潛在物質的方法，其特徵在於，所述的方法包括(1)將候選物質與表達泛素連接酶HERC5的體系接觸；(2)檢測候選物質對泛素連接酶HERC5的影響；若所述候選物質提高泛素連接酶HERC5的表達或活性，則表明該候選物質是促進固有免疫反應信號轉導通路的激活的潛在物質；若所述候選物質抑制泛素連接酶HERC5的表達或活性，則表明該候選物質是抑制固有免疫反應信號轉導通路的激活的潛在物質。
12.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，步驟(1)包括在測試組中，將候選物質加入到表達泛素連接酶HERC5的體系中；和/或步驟( 包括檢測測試組的體系中泛素連接酶HERC5的表達或活性，並與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的表達泛素連接酶HERC5的體系；如果測試組中泛素連接酶HERC5的表達或活性在統計學上高於對照組，就表明該候選物質是促進固有免疫反應信號轉導通路的激活的潛在物質；如果測試組中泛素連接酶HERC5的表達或活性在統計學上低於對照組，就表明該候選物質是抑制固有免疫反應信號轉導通路的激活的潛在物質。
13.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，步驟(1)中，所述體系中還表達幹擾素調節因子3，且所述的泛素連接酶HERC5與幹擾素調節因子3相互作用；以及步驟( 包括檢測候選物質對泛素連接酶HERC5與幹擾素調節因子3相互作用的影響；若所述候選物質促進泛素連接酶HERC5與幹擾素調節因子3相互作用，則表明該候選物質是促進固有免疫反應信號轉導通路的激活的潛在物質；若所述候選物質抑制泛素連接酶HERC5與幹擾素調節因子3相互作用，則表明該候選物質是抑制固有免疫反應信號轉導通路的激活的潛在物質。
全文摘要
本發明涉及類泛素修飾蛋白在抗病毒方面的新用途。本發明公開了HERC5蛋白或其調節劑在調節固有免疫反應信號轉導通路中的新用途；本發明還公開了以HERC5蛋白作為靶點，篩選調節固有免疫反應信號轉導通路的潛在物質的方法。本發明首次揭示了HERC5蛋白是調節固有免疫反應信號轉導通路的新的關鍵分子，為抗病毒藥物的設計、開發提供了新的途徑。
文檔編號A61P31/00GK102247592SQ20101017932
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月19日 優先權日2010年5月19日
發明者劉星, 單玉飛, 王琛, 石賀欣 申請人:中國科學院上海生命科學研究院