用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的製備方法
2023-12-07 05:10:31 1
專利名稱：用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物技術領域的組織工程纖維支架的製備方法，特別是一種利用靜電紡纖維的串珠擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的製備方法。
背景技術：
對靜電紡纖維載藥系統的研究從21世紀初開始，2002年Kenawy等人發表了題為 Release of tetracycline hydrochloride from electrospun poly (ethylene-co-vinylacetate), poly (lactic acid), and a blend 的論文(見Journal of Controlled Release, 2002,81 (I) :57_64),同年，Zong 等人發表了題為 Structure and process relationship of electrospun bioabsorbable nanofiber membranes (見 Polymer, 2002,43 (16) =4403-4412)的論文，都提出利用靜電紡纖維擔載藥物的想法。其中 Kenawy以聚乳酸(PLA)、聚乙烯一醋酸乙烯酯(PEVA)、PLA與PEVA以50/50的混合比例為高聚物進行靜電紡絲，所擔載的模型藥物為鹽酸四環素；Zong以聚右旋乳酸為高聚物進行靜電紡絲，擔載模型藥物為美福仙。兩個實驗結果均表明，利用靜電紡方法能夠成功地使纖維擔載藥物，但是藥物釋放難以控制，特別是存在嚴重的突釋現象。
為緩解藥物的突釋，採用了一些新的靜電紡製備方法，如同軸靜電紡和乳液靜電紡(見中國專利「擔載蛋白的組織工程纖維支架的製備方法」，公開號CN 102188755A)。 同軸靜電紡用於製備一種具有殼/核結構的納米纖維，核的部分用於擔載藥物，殼的部分用來控制藥物向纖維外擴散。Huang等人以聚己丙醯胺為殼層，白藜蘆醇和硫酸慶大黴素分別為芯層進行同軸靜電紡絲，體外釋放結果表明，兩種藥物均沒有出現明顯的突釋現象 (見!Encapsulating drugs in biodegradable ultrafine fibers through co-axial electrospinning. Journal of Biomedical Materials Research Part A,2006,77A(I) 169-179.)。而對於水溶性的藥物，人們傾向於用乳液靜電紡絲法將藥物包覆於纖維中。 Tian等人採用乳液靜電紡將牛血清白蛋白和血管內皮生長因子，葡聚糖和血管內皮生長因子兩種藥物組合分別包覆於聚乳酸一己內酯共聚物的納米纖維中，體外釋放結果表明，兩種藥物組合均未見突釋產生(見Emulsion electrospun vaseular endothelial growth factor encapsulated poly (1-lactic acid-co- ε-caprolactone) nanofibers for sustained release in cardiac tissue engineering. Journal of Materials Science, 2012,47 :3272_3281)。雖然同軸靜電紡和乳液靜電紡改善了擔載藥物的突釋問題，但是所使用的模型藥物均為納米級粒徑藥物或可溶於紡絲液的藥物。
對於蛋白藥物，為了在纖維支架的製備過程中保護蛋白的活性和構象，採用多糖顆粒包覆藥物是一種新穎的蛋白藥物保護方法，可避免蛋白藥物在製劑和體外釋放過程中失活(見中國專利「利用冷凍相分離製備多糖玻璃體微粒的方法」，公開號CN 1887276A)， 所製備的藥物粒徑分布為0. I 10 μ m。在此基礎上，用靜電紡方法在纖維上擔載蛋白顆粒，具有蛋白擔載量高的優點，是組織工程用藥物支架的理想製備方式。但是由於靜電紡方法所製備的纖維直徑多為幾百納米，沒有能力擔載具有微米級粒徑的顆粒藥物，因此無法優化蛋白的釋放曲線，特別是無法克服所擔載的蛋白藥物的突釋問題。發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種用靜電紡纖維的串珠來擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的製備方法。所製備的靜電紡纖維膜中具有微米級尺寸的串珠結構，在製備過程中能將蛋白顆粒有效地包埋在串珠內，既保護了蛋白藥物的活性和構象， 又達到理想的緩釋效果。
為了達到上述目的，本發明提供了一種用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的製備方法，其特徵在於，具體步驟為
第一步A溶液的配製將高聚物溶於溶劑中，得到A溶液；
第二步B溶液的配置在A溶液中加入蛋白顆粒，磁力攪拌均勻，得到B溶液；
第三步靜電紡絲將B溶液加入注射器中，設定紡絲電壓、紡絲速度和紡絲距離， 靜電紡絲，在接收器上收集纖維膜；
第四步將收集到的纖維膜在室溫下靜置晾乾，剝離接收器，得到用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架。
上述方案中，所述的高聚物為可溶解於有機溶劑中的高分子聚合物，水溶性合成高分子聚合物，或者天然高分子聚合物及其衍生物。所述的可溶解於有機溶劑中的合成高分子聚合物優選為聚苯並咪唑、聚對苯二甲醯對苯二胺、聚碳酸酯、聚對苯二甲醯間苯二胺、聚醚醯亞胺、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚對苯二甲酸丙二醇酯、聚對苯二甲酸丁二醇酯、 聚碸、聚苯胺、聚環氧乙烷、聚乙烯咔唑、聚丙烯腈、聚醚醚酮、聚苯乙烯、脂肪族聚醯胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚偏二氟乙烯、聚亞氨酯、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇縮丁醛、聚二茂鐵基二甲基矽烷、聚醯亞胺、聚吡咯以及聚甲醛中的一種或兩種以上的組合。所述的水溶性合成高分子聚合物優選為聚乙烯醇、聚環氧乙烷、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亞胺、聚丙烯醯胺、聚乙二醇、聚乳酸、聚乳酸一羥基乙酸共聚物、聚己內酯、聚羥基乙酸、聚羥基鏈烷酸酯、聚丁二酸丁二醇酯、聚對二氧環己酮丙交酯、聚酯以及聚亞胺酯中的一種或兩種以上的組合。所述的天然高分子聚合物及其衍生物優選為纖維素、醋酸纖維素、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維、甲殼素、殼聚糖、海藻酸鈉、右旋糖酐、脫氧核糖核酸、膠原蛋白、明膠、卵磷脂、蠶絲蛋白、玉米醇溶蛋白以及小麥蛋白中的一種或兩種以上的組合。
上述方案中，所述的溶劑優選為N，N-二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、硫酸、二氯甲烷、六氟異丙醇、三氯甲烷、三氟乙酸、四氫呋喃、甲酸、丙酮、蒸餾水、異丙醇、乙醇以及乙酸中的一種或兩種以上的組合。
上述方案中，所述的紡絲液的濃度指單位毫升溶劑中高聚物的質量。
上述方案中，所述的蛋白顆粒為擔載蛋白的多糖玻璃體顆粒。
所述的蛋白為用於組織再生治療的蛋白，如促紅細胞生成素，重組人粒細胞集落刺激因子，粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子，幹擾素，生長激素，胰島素，表皮生長因子，成纖維細胞生長因子，轉化生長因子，胰島素樣生長因子，血管內皮細胞生長因子，血小板生長因子，內皮生長因子，神經生長因子，骨衍生性生長因子，骨形成蛋白，組織多肽抗原，抗體以及凝血因子中的一種或兩種以上的組合。
所述的蛋白也可為牛血清白蛋白。本發明以牛血清白蛋白作為各種組織再生蛋白藥物或生長因子的模型蛋白。
上述方案中，所述的蛋白顆粒的粒徑為200 1600nm。
上述方案中，所述的紡絲電壓調節範圍為5 30kV，紡絲速度調節範圍為O. 5 2.5mL/h，紡絲距離調節範圍為10 25cm。
上述方案中，所述的接收器為鋪蓋一層鋁箔的金屬平板。
本發明在靜電紡的過程中，將蛋白顆粒包埋在纖維的串珠內，改善了藥物的體外釋放曲線。
本發明方法簡便，成本低，具有串珠結構的靜電紡纖維膜可有效地包埋顆粒藥物， 改善藥物體外釋放曲線。可維持藥物持續釋放超過一個月且第一天釋放量不超過藥物擔載量的15%。
圖I為用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的電鏡照片。
圖2為串珠結構擔載藥物的示意圖。圖中，I為串珠結構，2為蛋白顆粒。
圖3為實施例I中帶串珠結構的靜電紡載藥纖維支架的藥物體外釋放曲線。
圖4為實施例2中帶串珠結構的靜電紡載藥纖維支架的藥物體外釋放曲線。
圖5為實施例3中帶串珠結構的靜電紡載藥纖維支架的藥物體外釋放曲線。
具體實施方式
為使本發明更明顯易懂，茲以優選實施例，並配合附圖作詳細說明如下。在下列所有的實施例中使用的、擔載有牛血清白蛋白的葡聚糖顆粒由上海交通大學提供，(其製備方法參見Preparing polymer-based sustained-release systems without exposing proteins to water-oil or water-air interfaces and cross-linking reagents, Journal of Controlled Release, 2008，128 :50_59)。牛血清白蛋白在所有的實施例中作為模型蛋白藥物使用，以代替各種組織再生治療的蛋白藥物或生長因子。所使用的聚乳酸一輕基乙酸共聚物，分子量為115. 67kDa,由Lakeshore Biomaterials公司(美國)提供；N，N- 二甲基甲醯胺為分析純，由上海潤捷化學試劑有限公司生產；四氫呋喃為分析純， 由常熟市楊園化工有限公司生產。
實施例I :
(I) A溶液的配製將聚乳酸一輕基乙酸共聚物溶於0. 25mL N，N-二甲基甲醯胺與0.75mL四氫呋喃的混合溶劑中，得到濃度為150mg/mL的A溶液。
(2) B溶液的配置向A溶液中加入15mg粒徑為227 1575nm的擔載有牛血清白蛋白的葡聚糖顆粒，採用磁力攪拌2000rpm, 60min。
(3)靜電紡絲將B溶液加入注射器中，設定紡絲電壓20kV，紡絲速度lmL/h，紡絲距離20cm，靜電紡絲，在接收器(鋪蓋一層鋁箔的金屬平板)上收集纖維膜。
(4)將收集到的纖維膜在室溫下靜置晾乾，剝離接收器，得到如圖I所示的用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架。如圖2所示，蛋白顆粒擔載在串珠結構I中。
(5)稱量20mg纖維膜，加入ImL的pH為7. 4的PBS緩衝液，於37°C、IOOrpm搖床培養，定時取出上清液並補加緩衝液，採用MicroBCA方法測試上清液中BSA的含量，計算藥6物釋放量。
(6)如圖3所示，實驗結果表明，串珠結構的靜電紡載藥纖維支架達到平穩緩釋的效果，第一天釋放量不大於藥物擔載量的15%，無突釋現象。
實施例2
(I)A溶液的配製將聚乳酸-羥基乙酸共聚物溶於O. 25mL N，N-二甲基甲醯胺與O.75mL四氫呋喃的混合溶劑中，得到濃度為150mg/mL的A溶液。
(2) B溶液的配置向A溶液中加入IOmg粒徑為227 1575nm的擔載有牛血清白蛋白的葡聚糖顆粒，採用磁力攪拌2000rpm, 60min。
(3)靜電紡絲將B溶液加入注射器中，紡絲電壓20kV，紡絲速度lmL/h，紡絲距離 20cm，靜電紡絲，在接收器(鋪蓋一層鋁箔的金屬平板)上收集纖維膜。
(4)將收集到的纖維膜在室溫下靜置晾乾，剝離接收器，得到用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架。
(5)稱量20mg纖維膜，加入ImL的pH為7. 4的PBS緩衝液，於37°C、IOOrpm搖床培養，定時取出上清液並補加緩衝液，採用MicroBCA方法測試上清液中BSA的含量，計算藥物釋放量。
(6)如圖4所示，實驗結果表明，串珠結構的靜電紡載藥纖維支架達到平穩緩釋的效果，第一天釋放量約為藥物擔載量的10%，無突釋現象。
實施例3
(I) A溶液的配製將聚乳酸一輕基乙酸共聚物溶於O. 25mL N，N-二甲基甲醯胺與O.75mL四氫呋喃的混合溶劑中，得到濃度為150mg/mL的A溶液。
(2) B溶液的配置向A溶液中加入6. 67mg粒徑為227 1575nm的擔載有牛血清白蛋白的葡聚糖顆粒，採用磁力攪拌2000rpm, 60min。
(3)靜電紡絲將B溶液加入注射器中，設定紡絲電壓20kV，紡絲速度lmL/h，紡絲距離20cm，靜電紡絲，在接收器(鋪蓋一層鋁箔的金屬平板)上收集纖維膜。
(4)將收集到的纖維膜在室溫下靜置晾乾，剝離接收器，得到用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架。
(5)稱量20mg纖維，加入ImL的pH為7. 4的PBS緩衝液，於37°C、IOOrpm搖床培養，定時取出上清液並補加緩衝液，採用MicroBCA方法測試上清液中BSA的含量，計算藥物釋放量。
(6)如圖5所示，實驗結果表明，串珠結構的靜電紡載藥纖維支架達到平穩緩釋的效果，第一天釋放量約為藥物擔載量的10%，無突釋現象。
權利要求
1.一種用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的製備方法，其特徵在於，具體步驟為第一步A溶液的配製將高聚物溶於溶劑中，得到A溶液；第二步B溶液的配置在A溶液中加入蛋白顆粒，磁力攪拌均勻，得到B溶液；第三步靜電紡絲將B溶液加入注射器中，設定紡絲電壓、紡絲速度和紡絲距離，靜電紡絲，在接收器上收集纖維膜；第四步將收集到的纖維膜在室溫下靜置晾乾，剝離接收器，得到用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架。
2.如權利要求I中所述的用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的製備方法， 其特徵在於，所述的高聚物為可溶解於有機溶劑中的高分子聚合物，水溶性合成高分子聚合物，或者天然高分子聚合物及其衍生物。
3.如權利要求2所述的用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的製備方法，其特徵在於，所述的可溶解於有機溶劑中的合成高分子聚合物為聚苯並咪唑、聚對苯二甲醯對苯二胺、聚碳酸酯、聚對苯二甲醯間苯二胺、聚醚醯亞胺、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚對苯二甲酸丙二醇酯、聚對苯二甲酸丁二醇酯、聚碸、聚苯胺、聚環氧乙烷、聚乙烯咔唑、聚丙烯腈、聚醚醚酮、聚苯乙烯、脂肪族聚醯胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚偏二氟乙烯、聚亞氨酯、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇縮丁醛、聚二茂鐵基二甲基矽烷、聚醯亞胺、聚吡咯以及聚甲醛中的一種或兩種以上的組合。
4.如權利要求2所述的用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的製備方法，其特徵在於，所述的水溶性合成高分子聚合物為聚乙烯醇、聚環氧乙烷、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亞胺、聚丙烯醯胺、聚乙二醇、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚己內酯、 聚羥基乙酸、聚羥基鏈烷酸酯、聚丁二酸丁二醇酯、聚對二氧環己酮丙交酯、聚酯以及聚亞胺酯中的一種或兩種以上的組合。
5.如權利要求2所述的用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的製備方法，其特徵在於，所述的天然高分子聚合物及其衍生物為纖維素、醋酸纖維素、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維、甲殼素、殼聚糖、海藻酸鈉、右旋糖酐、脫氧核糖核酸、膠原蛋白、明膠、卵磷脂、 蠶絲蛋白、玉米醇溶蛋白以及小麥蛋白中的一種或兩種以上的組合。
6.如權利要求I所述的用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的製備方法，其特徵在於，所述的溶劑為二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、硫酸、二氯甲烷、六氟異丙醇、三氯甲烷、三氟乙酸、四氫呋喃、甲酸、丙酮、蒸餾水、異丙醇、乙醇以及乙酸中的一種或兩種以上的組合。
7.如權利要求I所述的用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的製備方法，其特徵在於，所述的蛋白顆粒為擔載蛋白的多糖玻璃體顆粒。
8.如權利要求7所述的用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的製備方法，其特徵在於，所述的蛋白為促紅細胞生成素，重組人粒細胞集落刺激因子，粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子，幹擾素，生長激素，胰島素，表皮生長因子，成纖維細胞生長因子，轉化生長因子，胰島素樣生長因子，血管內皮細胞生長因子，血小板生長因子，內皮生長因子，神經生長因子，骨衍生性生長因子，骨形成蛋白，組織多肽抗原，抗體以及凝血因子中的一種或兩種以上的組合。CN 102908665 A _權利要求書_ _2/2 頁
9.如權利要求I所述的用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的製備方法，其特徵在於，所述的蛋白顆粒的粒徑為200 1600nm。
10.如權利要求I所述的用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的製備方法， 其特徵在於，所述的紡絲電壓調節範圍為5 30kV，紡絲速度調節範圍為O. 5 2. 5mL/h, 紡絲距離調節範圍為10 25cm。全文摘要
本發明提供了一種用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架的製備方法，其特徵在於，具體步驟為第一步A溶液的配製將高聚物溶於溶劑中，得到A溶液；第二步B溶液的配置在A溶液中加入蛋白顆粒，磁力攪拌均勻，得到B溶液；第三步靜電紡絲將B溶液加入注射器中，設定紡絲電壓、紡絲速度和紡絲距離，靜電紡絲，在接收器上收集纖維膜；第四步將收集到的纖維膜在室溫下靜置晾乾，剝離接收器，得到用串珠纖維擔載蛋白顆粒的組織工程纖維支架。本發明在靜電紡的過程中，將顆粒蛋白顆粒藥物包埋在纖維的串珠內，改善了藥物的體外釋放性能。
文檔編號A61L27/16GK102908665SQ201210419070
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月26日 優先權日2012年10月26日
發明者丁辛, 隋曉, 田玲玲, 李庭曉, 胡崛, 李毓陵, 王璐, 胡吉永, 楊旭東 申請人:東華大學