一種製備寶霍苷i純品的方法
2023-12-05 23:00:26 2
專利名稱：一種製備寶霍苷i純品的方法
技術領域：
本發明涉及一種製備寶霍苷I純品的方法。主要包括淫羊藿苷的葡聚糖酶水解，及寶霍苷I的反相高效液相製備純化。
背景技術：
淫羊藿(Herba Epimedii)隸屬小檗科(Berberridaceae)淫羊藿屬，為常用中藥，具有強筋骨，祛風溼，抗病毒等功效。現代藥理研究發現，淫羊藿中寶霍苷I等去糖後的低分子量化合物具有比含量較高的淫羊藿苷具有更高的活性。目前市場上，寶霍苷I非常稀缺，而且價格昂貴，而對寶霍苷I的需求越來越大，因此開發寶霍苷I的製備方法是非常有意義的。根據現有的專利及文獻，寶霍苷的主要製備方法有酸水解法，鹼水解法以及酶水解法。酸鹼水解法，方法簡單，然而由於其水解環境劇烈，製備出的寶霍苷I往往活性損失較大。酶水解法主要採用β-葡萄糖苷酶，然而其活性較低，水解效率低，原材料浪費嚴重。葡聚糖酶也叫β-1，3_1，4葡聚糖酶，是一種專一作用於β-葡聚糖的1，3及1，4糖苷鍵的內切酶。該酶可以通過Bacillus Lichenifomis菌株經過液態深層發酵製得,製備工藝路線成熟，是一種廉價高活性的葡萄糖苷鍵水解酶。其活性非常高，水解淫羊藿苷為寶霍苷I的轉化率最高大於98%，且通過合適的回收，酶可二次利用，第二次的轉化率大於50%，充分利用了原材料，節省了成本。本文首次嘗試採用葡聚糖酶作為淫羊藿苷的水解酶，將相對價廉易得的淫羊藿苷純品，轉化為學術及經濟價值均較高的寶霍苷I純品，並對其生產條件進行了優化研究。結果發現，葡聚糖酶具有很高的內切酶活性，可以高產量的轉化淫羊藿苷為寶霍苷I，同時結合反相高效製備色譜技術，可以製備高純寶霍苷I純品。
發明內容
本發明主要目的在於通過葡聚糖酶水解淫羊藿苷製備寶霍苷I粗品，並進一步通過反相高效製備液相純化，製備的寶霍苷I純品純度大於98%。主要技術流程如下所示:1.一種寶霍苷I純品的製備方法，其特徵在於:以淫羊藿苷為原料，葡聚糖酶水解及反相高效製備色譜純化，即可獲得純度大於98%的寶霍苷I純品；具體步驟如下:I)淫羊藿苷葡聚糖酶水解獲得寶霍苷I粗品:將l-25mg淫羊藿苷用IO-1OOml PH為4_7的檸檬酸緩衝溶液溶解，加入40-150ul、4-10ug/ul的葡聚糖酶水溶液，保持19-80攝氏度並攪拌3-6小時，即可將絕大部
分淫羊藿苷轉化為寶霍苷I ;得寶霍苷I沉澱；寶霍苷I沉澱經水洗除去部分酶和大部分葡萄糖，進一步用-4到4攝氏度冷甲醇溶解除去殘餘酶和不溶沉澱，上清液濃縮乾燥即可得到寶霍苷I粗品；經過處理後的寶霍苷I含量大於90%。2)反相高效製備液相獲得寶霍苷I純品寶霍苷I粗品用甲醇溶解，經0.45u m微膜過濾；採用Waters DP4000高效製備系統，採用C18反相填料製備色譜柱分離純化，優選10-20um粒徑的C18矽膠鍵合填料，以100% -70%甲醇為洗脫劑等度洗脫，0.45um濾膜處理樣品，通過微膜濾出的樣品上樣分析。採用紫外檢測器檢測，檢測波長270nm，寶霍苷I在10分鐘內流出，收集相應保留時間處餾分(通常為3-9分鐘的餾分)，濃縮乾燥後既得寶霍苷I純品，得到的寶霍苷I含量大於 98%。水解步驟中檸檬酸緩衝體系的PH值控制在4-7。寶霍苷I純品獲得採用反相高效製備色譜柱，填料優選10_20um C18鍵合矽膠，柱效大於等於2500。本發明以淫羊藿苷為原料，通過葡聚糖酶水解和高效製備系統獲得目標產物寶霍苷I純品，與傳統方法相比具有以下優點:1)葡聚糖酶水解能力強，淫羊藿苷轉化為寶霍苷I的轉化率最高可達98%，且酶可二次利用，充分利用了原材料。2)以反相高效製備液相為手段，可以製備高純度寶霍苷I，純度大於98%。通過不同填料選擇進行製備柱自裝填，有效提高寶霍苷I的選擇性。3)採用等度條件，分離快速，高效，而且寶霍苷出峰時間短，出峰時間在3-9分鐘內。4)操作過程簡單，無需複雜樣品處理手段，適合大規模生產製備
圖1為淫羊藿苷原料的HPLC分析圖(270nm)，其積分報告如下:
權利要求
1.一種寶霍苷I純品的製備方法，其特徵在於:以淫羊藿苷為原料，葡聚糖酶水解及反相高效製備色譜純化，即可獲得純度大於98%的寶霍苷I純品；具體步驟如下: 1)葡聚糖酶水解: 將l_25mg淫羊藿苷用IO-1OOml檸檬酸緩衝溶液溶解，加入40-150ul、4_10ug/ul的葡聚糖酶水溶液，保持19-80攝氏度並攪拌3-6小時，獲得寶霍苷I沉澱； 寶霍苷I沉澱經水洗除去部分酶和大部分葡萄糖，進一步用-4到4攝氏度冷甲醇溶解除去殘餘酶和不溶沉澱，上清液濃縮乾燥即可得到寶霍苷I粗品； 2)反相高效製備液相純化: 寶霍苷I粗品用甲醇溶解，經0.45um微膜過濾；通過微膜濾出的樣品上樣分析，採用C18反相填料製備色譜柱分離純化，採用C18鍵合矽膠填料，採用體積濃度70-100%甲醇水溶液等度洗脫，採用紫外檢測器檢測，檢測波長270nm，收集相應保留時間處餾分，濃縮乾燥即得純度大於98%的寶霍苷I純品。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:水解步驟中檸檬酸緩衝體系的PH值控制在4-7，水解時間控制在3-6小時，水解溫度控制在19-80攝氏度。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:寶霍苷I純品獲得採用反相高效製備色譜柱，填料優選10-20um C1 8鍵合矽膠，柱效大於等於2500。
全文摘要
本發明涉及一種製備寶霍苷I純品的方法。以實驗室自製的淫羊藿苷(純度大於98％)為原料，經過葡聚糖酶水解，得到含量大於90％的寶霍苷I粗品，用反相高效製備色譜作為純化手段，得到純度大於98％的寶霍苷I純品。本發明工藝步驟簡單、純度高、成本低，並且可大規模生產。
文檔編號C07H1/06GK103160553SQ20111042819
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月19日 優先權日2011年12月19日
發明者肖紅斌, 楊乾栩, 王莉 申請人:中國科學院大連化學物理研究所