一種黃瓜霜黴病菌菌株的保存方法

2023-12-03 13:09:56 2

專利名稱：一種黃瓜霜黴病菌菌株的保存方法
技術領域：
本發明涉及植物保護領域中一種專性寄生菌的保存方法，特別是涉及黃瓜霜黴病菌菌株的一種保存方法。
背景技術：
黃瓜是我國蔬菜產區露地和保護地栽培的主要種植品種，在多數地區可以整年種植。霜黴病是黃瓜生產上最重要的病害之一，凡栽培黃瓜的地區均有發生，在我國尤以北方地區受害最重，露地栽培以春茬黃瓜發病最重，保護地栽培則春季或冬季發病較重。該病主要由氣流傳播，具有侵染頻繁、潛育期短的特點，流行危害嚴重，能在幾日內導致植物全部死亡，俗稱「跑馬乾」，也因在其發病後，黃瓜葉背出現大量紫褐色的黴狀物，而稱之為「黑毛病」。
黃瓜霜黴病的病原菌為古巴假霜黴菌(Pseudoperonospora cubensis(Berk.EtCert.)Rostr.)，該菌是一種專性寄生菌，其孢子萌發後菌絲主要在寄主細胞間隙擴展，不能在人工培養基上生長，因此該菌株難於在離體條件下進行長期的保存。國內外的許多研究機構和農化企業現正加緊研製對該致病菌具有有效防治效果的新型殺菌劑。在用所研製的不同殺菌劑對黃瓜霜黴病菌進行毒力測定時需要用到大量的該活體致病菌，因此迫切需要一種黃瓜霜黴病菌菌株的長期保存方法。

發明內容
本發明的目的是提供一種黃瓜霜黴病菌菌株的較長期的保存方法。
本發明所提供的黃瓜霜黴病菌菌株的保存方法，是在無菌條件下，用經消毒的黃瓜植株第3-6葉位上的健康離體葉片製成葉碟，將每個葉碟背面滴加黃瓜霜黴病菌的孢子囊懸浮液，然後將其在17-20℃黑暗條件下保溼培養20-28h，再於17-20℃、溼度RH大於80％、10-14h光暗交替條件下保溼培養，待葉碟背面產生黑色黴層後，置於-30℃至-80℃下密閉保存。
上述方法中，所述健康離體葉片優選為黃瓜植株第4葉位上的葉片；葉碟的尺寸為Φ1.2-2.0cm，優選為Φ1.5cm；黃瓜霜黴病菌的孢子囊懸浮液的濃度為1×104-1×105個孢子囊/mL，優選為1.0×104個孢子囊/mL；每個葉碟背面滴加的孢子囊懸浮液的體積為10μL；背面滴加有黃瓜霜黴病菌的孢子囊懸浮液的葉碟的培養條件優選為先在19℃的黑暗條件下保溼培養24h，再於19℃、溼度RH大於80％、12h光暗交替條件下保溼培養；保存溫度優選為-80℃。
所述孢子囊懸浮液的獲得方法為；田間採集葉背面有黑色黴層的病葉，室內將病葉上的雜質和老熟的孢子囊洗淨後，在19℃下暗培養誘導產生新的孢子囊，再將新生孢子囊接種到無菌的健康離體黃瓜葉片背面，置於17-20℃黑暗條件下保溼培養20-28h，再於17-20℃、溼度RH大於80％、10-14h光暗交替條件下保溼培養，待葉片背面產生黑色黴層後，挑取單根的孢囊梗進行菌株的純化，並將單孢囊梗及其著生的孢子囊轉接到健康黃瓜第3-5葉位上的離體葉片背面在17-20℃下保溼培養，發病後洗脫病斑上的孢子囊配成孢子囊懸浮液。
在上述孢子囊懸浮液的獲得方法中，新生孢子囊的接種方法為液滴法，用液滴法接種時所用的新生孢子囊懸浮液的濃度優選為1.0×104個孢子囊/mL，接種體積為10μL；背面接種有黃瓜霜黴病菌孢子囊的黃瓜葉片的培養條件優選為先在19℃的黑暗條件下保溼培養24h，再於19℃、溼度RH大於80％、12h光暗交替條件下培養。
在實際應用中，可將上述方法保存的黃瓜霜黴病菌菌株放入冰盒中使其緩慢升溫，以免孢子囊驟熱而開裂，然後洗脫孢子囊，製成孢子囊懸浮液即可使用。
本發明根據黃瓜霜黴病菌在低溫下能存活的特點，提供了一種低溫冷藏條件下保存黃瓜霜黴病菌菌株的簡便、長久的方法。可使黃瓜霜黴病菌菌株在60天內均保持較高活性，可用葉盤漂浮法等常規的毒力測定法對其進行毒力測定，測定結果表明用該法保存的菌株在60d內的致病力均與空白對照一致，無明顯差異，可用於殺菌劑對黃瓜霜黴病菌的毒力測定，為研究黃瓜霜黴病的防治提供了極大方便。本發明具有較高的實際應用價值。


圖1為從田間發病植株採集的葉背面有明顯褐色黴層的病葉圖2為在病葉上誘導產生的新孢子囊圖3為接種有新生孢子囊懸浮液的健康離體黃瓜葉片圖4為將接種有新生孢子囊懸浮液的健康離體的黃瓜植株的葉片進行暗培養後於19℃、溼度RH大於80％、12h光暗交替的條件下培養具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
供試植物材料將感病黃瓜品種長春密刺栽培於Φ15cm，高12cm的育苗缽內，置於玻璃溫室中培養，待植株長到6葉期後採集健康植株第4葉位的葉片，用於黃瓜霜黴病菌的培養及菌株的低溫冷凍保藏。
實施例1、黃瓜霜黴病菌的分離培養和保存1、黃瓜霜黴病樣採集和病菌的分離培養從北京郊區的平谷東高村崔莊子科技園、懷柔王化村西菜地、延慶永寧鎮孔化營村、昌平南郝莊蘋園及中國農業大學昌平實驗站、房山豆店村、海澱區西北旺村及河北巒平、內蒙等地區未施用過氟嗎啉及同類藥劑烯醯嗎啉的黃瓜栽培地採集黃瓜霜黴病菌樣本，共分離得到77株敏感菌株，同時從北京郊區分離得到6株對甲霜靈具有不同抗性水平的抗藥性菌株；從進行過2年腈嘧菌酯田間藥效試驗的大棚分離得到6株腈嘧菌酯抗藥性菌株。具體方法為將從田間發病植株採集的葉背面有明顯褐色黴層的病葉(圖1)用蒸餾水將葉片上殘留的雜質和老熟的孢子囊洗淨，然後置於19℃的條件下黑暗培養24h，誘導產生新的孢子囊(圖2)。用4℃無菌水將新產生的孢子囊洗脫，配成每毫升含有1×104個孢子囊的懸浮液，用液滴法接種到用無菌水衝洗後的健康離體的黃瓜植株的葉片背面，每滴10μL，再將其置於用吸水紙保溼的Φ150mm培養皿中於19℃黑暗條件下培養24h(圖3)，以確保病原菌的侵入，然後於19℃、溼度RH大於80％、12h光暗交替的條件下培養(圖4)，葉片接菌3d後可以觀察到不規則的水浸狀病斑，5d後葉片背面產生黑色黴層。在解剖鏡下挑取單根的孢囊梗進行菌株的純化，並將挑取的單孢囊梗及其著生的孢子囊轉移到健康的離體黃瓜葉片背面進行保溼培養，病原菌在黃瓜離體葉片上能保存10-15d。可繼續用4℃無菌水洗脫病斑上的孢子囊，轉接到新鮮的健康黃瓜離體葉片上繼代培養。
2、黃瓜霜黴病菌的低溫冷藏保存選擇黃瓜植株第4葉位的健康離體葉片，進行表面消毒處理後，用打孔器製取Φ1.5cm的黃瓜葉碟，每個葉碟背面滴加用上述方法分離獲得的黃瓜霜黴病菌的孢子囊配製的濃度為1×104個孢子囊/mL的孢子囊懸浮液10μL，然後按照步驟1所述的方法培養，待葉碟背面產生黑色黴層後，將其小心裝入10mL具塞離心管中，分別置於4℃，-20℃，-30℃，-70℃和-80℃下保存，每個溫度重複放置10管，每隔10d取1管放入冰盒中緩慢升溫，以免孢子囊驟熱而開裂。然後洗脫孢子囊，製成濃度為1×104個孢子囊/mL的孢子囊懸浮液，將其接種在黃瓜葉盤上，保溼培養，發病後測量病斑面積，比較各保存溫度下不同保存時間病菌致病力的變化，黃瓜霜黴病菌在4℃下保存時間小於10d，-20℃下可保存20d，-30℃下至少可保存40d，-70℃和-80℃下可保存至少60d以上。但在-20℃和-30℃條件下保存，隨著時間增長，菌種致病力減弱；而在-70℃和-80℃條件下，60d內菌種致病力與空白對照一致，沒有顯著性差異。當保存時間大於30d時，-80℃條件下菌種的致病力強於其它條件處理的菌種。
表1 黃瓜霜黴病菌在低溫條件下冷藏不同時間後其致病力的變化

注a＝0.05；-未做接種實驗
權利要求
1.一種黃瓜霜黴病菌菌株的保存方法，是在無菌條件下，用經消毒的黃瓜植株第3-6葉位上的健康離體葉片製成的葉碟，將每個葉碟背面滴加黃瓜霜黴病菌的孢子囊懸浮液，然後將其在17-20℃黑暗條件下保溼培養20-28h，再於17-20℃、溼度RH＞80％、光暗交替條件下保溼培養，待葉碟背面產生黑色黴層後，置於-30℃至-80℃下密閉保存。
2.根據權利要求1所述的保存方法，其特徵在於所述健康離體葉片為黃瓜植株第4葉位上的葉片。
3.根據權利要求1所述的保存方法，其特徵在於所述葉碟的尺寸為φ1.2-2.0cm；黃瓜霜黴病菌的孢子囊懸浮液的濃度為1×104-1×105個孢子囊/mL；每個葉碟背面滴加的孢子囊懸浮液的體積為10μL。
4.根據權利要求3所述的保存方法，其特徵在於所述葉碟的尺寸為φ1.5cm；黃瓜霜黴病菌的孢子囊懸浮液的濃度為1.0×104個孢子囊/mL；每個葉碟背面滴加的孢子囊懸浮液的體積為10μL。
5.根據權利要求1或2或3或4所述的保存方法，其特徵在於所述背面滴加有黃瓜霜黴病菌的孢子囊懸浮液的葉碟的培養條件為先在19℃的黑暗條件下保溼培養24h，再於19℃、溼度RH大於80％、光暗交替條件下保溼培養。
6.根據權利要求1或2或3或4所述的保存方法，其特徵在於所述保存溫度為-80℃。
7.根據權利要求1或2或3或4所述的保存方法，其特徵在於所述孢子囊懸浮液的獲得方法為將病葉上的雜質和老熟的孢子囊洗淨後，在19℃下暗培養誘導產生新的孢子囊，再將新生孢子囊接種到無菌的健康離體黃瓜葉片背面，置於17-20℃黑暗條件下保溼培養20-28h，再於17-20℃、溼度RH＞80％、光暗交替條件下保溼培養，待葉片背面產生黑色黴層後，挑取單根的孢囊梗進行菌株的純化，並將單孢囊梗及其著生的孢子囊轉接到健康黃瓜第3-6葉位上的離體葉片背面在17-20℃下保溼培養，發病後洗脫病斑上的孢子囊配成孢子囊懸浮液。
8.根據權利要求7所述的保存方法，其特徵在於所述新生孢子囊的接種方法為液滴法，接種時所用的新生孢子囊懸浮液的濃度為1.0×104個孢子囊/mL，接種體積為10μL。
9.根據權利要求7所述的保存方法，其特徵在於所述背面接種有黃瓜霜黴病菌孢子囊的黃瓜葉片的培養條件為先在19℃的黑暗條件下保溼培養24h，再於19℃、RH＞80％、光暗交替條件下保溼培養。
全文摘要
本發明公開了一種黃瓜霜黴病菌菌株的保存方法。該保存方法為在無菌條件下，用經消毒的黃瓜植株第3－6葉位上的健康離體葉片製成直徑為1.2－2.0cm的葉碟，將每個葉碟背面滴加黃瓜霜黴病菌的孢子囊懸浮液，然後將其在17－20℃黑暗條件下保溼培養20－28h，再於17－20℃、溼度RH大於80％、光暗交替條件下保溼培養，待葉碟背面產生黑色黴層後，置於－30℃至－80℃下密閉保存。本發明根據黃瓜霜黴病菌在低溫下能存活的特點，提供了一種低溫冷藏條件下保存黃瓜霜黴病菌菌株的簡便、長久的方法，為黃瓜霜黴病的防治提供了極大方便，具有較高的實際應用價值。
文檔編號C12N1/14GK1693447SQ200510070978
公開日2005年11月9日 申請日期2005年5月19日 優先權日2005年5月19日
發明者劉西莉, 朱書生, 李健強, 顧寶根, 袁善奎, 姜輝, 範潔茹 申請人:中國農業大學