蛇毒抗栓酶的製備方法
2023-12-05 15:35:56
專利名稱:蛇毒抗栓酶的製備方法
本發明提供一種從蛇毒中製取蛇毒抗栓酶的方法，屬於藥品的生產方法。
蛇毒抗栓酶的主要成份是精氨酸酯酶等抗凝成份，它具有抗凝、去纖、降脂、溶栓、擴張血管等多種功能，適用於腦血栓、血栓閉塞性脈管炎等常見的缺血性疾病。目前治療這些疾病的藥物很多，但尚無滿意療效。本發明生產的蛇毒抗栓酶經臨床一千餘例病人試用，總有效率達90%以上。
目前國內外均有以蛇毒提取精氨酸酯酶的報導，並已純化作為藥品出售，它們的商品名稱分別為Ancrod Reptilase Crotalase。但這些方法均具有生產步驟複雜、生產周期長、產量低、價格昂貴等缺點。
本發明的目的在於提供一種從蛇毒中製取蛇毒抗栓酶的簡便方法，縮短製取周期，增加每克蛇毒製取蛇毒抗栓酶的量，並使該藥物毒性低、療效高。
本發明是這樣實現的取幹蛇毒以1∶(10～12)的比例溶於Tris-Hcl緩衝液中，再倒入已經處理好且已平衡的DEAE-葡聚糖凝膠分子篩層析柱中，用0.01MTris-Hcl做緩衝液進行三步洗脫，控制流速，洗脫液流經紫外檢測儀記錄其流出曲線。按記錄儀所描繪出的曲線，合併有效組分的洗脫液，用專一性底用TAME(a-甲苯磺醯-L精氨酸甲酯鹽酸鹽)測定精氨酸酯酶的活力，按活力加稀釋劑，攪拌均勻，除菌過濾，加防腐劑慶大黴素，分裝冷凍乾燥製成凍乾粉劑。每支蛇毒抗栓酶0.25單位。
本發明洗脫液的PH值應保持在PH7.0～7.4。操作時的溫度應控制在12～14℃。防腐劑為10～12萬單位/萬支慶大黴素。
本發明與現有技術相比有如下優點1、由多次上柱改為一次上柱，使生產周期由10～15天縮短為7天，減少了酶製劑在生產過程中的汙染機會，簡化了方法，而製劑的療效不變。
2、洗脫液的PH為7.2，是最佳的條件，可使每克蛇毒製取的精氨酸酯酶由1000～1500支提高到2500支(每支均為0.25單位)，明顯提高了產量。
3、操作溫度由常溫改為14℃，可使酶活力達到最好狀態，亦可提高產量。
4、在凍乾粉劑中加用適量的慶大黴素，可顯著減少蛋白質製品的汙染，避免浪費。
本發明實施例如下
一、分子篩處理1、新膠處理。稱取DEAE-葡聚糖凝膠分子篩30～50克。加水2000～2500ml膨脹，用0.01M Tris-Hcl緩衝液平衡，直至上清液的PH與緩衝液PH相似(7.0～7.4)。
2、再生膠處理。將用過的膠倒出，用蒸餾水反覆洗至無鹹味，然後用鹼矸、酸、鹼矸處理至中性。
二、膠上柱1、層析柱處理。選擇110cm柱長的層析柱和G1號篩板，常規處理後，將篩板用薄乳膠膜包對，置於柱下口，緊貼膠塞(以免漏水)，將兩者密合後，垂直安裝在鐵架上，用乳膠管連接下口，加入0.1M Tris-Hcl緩衝液。
2、膠上柱。將柱中Tris-Hcl緩衝液緩慢由下口放出，留三分之一，再加入已處理好的膠，攪拌至無斷層現象，待底層自然下沉的膠可見有10cm厚時，以25滴/分的速度緩慢放緩衝液，直至達到平衡。
三、上樣稱取5克幹蛇毒，加1∶10Tris-Hcl緩衝液置冰箱12小時後，以3000轉/分離心20分鐘後吸取上清液均勻地由中心向四周滴加於膠床上，待樣品依其自身的高密度自然進入膠床後，繼續加等量緩衝液在膠面上，反覆兩次，將乳膠管與檢測儀連接好，以備檢測。
四、洗脫洗脫共分三步進行。洗脫液分裝在兩個瓶內(攪拌瓶和貯存瓶。兩瓶以膠管連接)。
第一梯度洗脫液為0.01M Tris-Hcl2400ml，勻速洗脫，洗脫液流經蛋白測定儀，第一洗脫液呈1、2、3峰。
第二梯度洗脫液由2400ml Tris-Hcl和2400ml4MNaCl組成，洗脫液呈4、5、6、7、8、9、10七個峰。
第三洗脫液由0.27MNaCl 1000ml和0.7M NaCl1000ml組成，此段洗脫液呈11、12、13、14四個峰。當測定儀指示出直線時，洗脫完畢。合併有效組分，按常規方法測定精氨酸酯酶的活力，加慶大黴素10～12萬單位/萬支，稀釋凍幹，每支蛇毒抗栓酶含精氨酸酯酶0.25單位。以上工作一旦進行，不得中斷。分離時最佳室溫為14℃，洗脫液PH為7.2。
權利要求
1.一種用蛇毒作原料製取蛇毒抗栓酶的製備方法，其特徵是用Tris-Hcl緩衝液溶解幹蛇毒，倒入平衡的DEAE-葡聚糖凝膠分子篩層析柱中，一次層析，三步洗脫，合併有效組分的洗脫液，並按酶活力加以稀釋，除菌過濾，加防腐劑慶大黴素，製成蛇毒抗栓酶凍乾粉劑。
2.按權利要求
1的製備方法，其特徵在於洗脫液加慶大黴素10～12萬單位/萬支。
3.按權利要求
1的製備方法，其特徵在於洗脫液的PH值在7.0～7.4。
4.按權利要求
1的製備方法，其特徵在於操作溫度保持在12～14℃。
專利摘要
本發明提供一種從蛇毒中製取蛇毒抗栓酶的方法，屬於藥品的生產方法。蛇毒抗栓酶的主要成分是精氨酸酯酶，用於腦血栓、血栓性脈管炎等常見的缺血性疾病，總有效率達90％以上。本方法的特點是一次性膠上柱，並嚴格控制洗脫液的pH。用本方法製取蛇毒抗栓酶，方法簡便，生產周期短，成本低，產量高，並可明顯減少生產蛋白質製品的汙染，便於推廣。
文檔編號A61K35/56GK86104422SQ86104422
公開日1988年1月6日 申請日期1986年6月24日
發明者郝文學 申請人:中國醫科大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan