一種用於作物防病增產的微生物製劑及其製備方法
2023-12-05 07:07:36
專利名稱:一種用於作物防病增產的微生物製劑及其製備方法
所屬技術領域：
本發明涉及用於作物防病增產的微生物製劑及其製備方法。
背景技術：
作物病害如油菜菌核病、花生白絹病、茄子黃萎病、辣椒疫病、丹參根腐病、紅花枯萎病、棉花立枯病和枯萎病等土傳病害不但嚴重影響作物的產量和品質，而且病害的病原菌可以在土壤中存活和隨土壤傳播。對於這些病害的防治，常用的化學藥劑不但防治效果差，而且濫用化學農藥還會造成嚴重的農殘汙染問題。目前，國內外針對灰黴病、立枯病、白絹病、紋枯病、枯萎病等作物病害的生物防治，分離篩選出了一些具有一定防病效果的木黴菌株，並進行了相應的擴大培養研究，但還存在一些問題，如生產出的製劑適用作物少，防病範圍窄；或者生產原料的來源受地域限制；或者生產工序複雜、生產成本高；或者用量較大，往往每畝需用幾公斤到幾十公斤。如中國專利申請「一種微生物殺菌劑及其製備方法」，公開號CN1337164A，這種微生物殺菌劑僅適用於菸草，僅對菸草立枯病、猝倒病、黑脛病、赤星病有效，其生產原料煙梗的來源地域性強，並且生產過程中需要使用專用設備發酵罐。又如中國專利申請「速效抗病真菌有機肥料及其生產方法」，公開號CN1283599，該抗病真菌有機肥用量較大，每畝需施用40kg-50kg。
發明內容
本發明的目的是提供一種用於作物防病增產的微生物製劑，該種微生物製劑生產周期短、成本低；原料來源廣、價格低廉；產孢量大；使用方便、安全；適用作物廣、防病對象多、促生增產作用顯著；還可減輕汙染，為生產和發展優質無公害農產品提供技術保證。
本發明另一目的是提供一種製備上述用於作物防病增產的微生物製劑的方法。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案是一種用於作物防病增產的微生物製劑，它含有的組分及質量配比為12～16份的哈茨木黴(Trichoderma harzianum)菌株T23 CGMCC No.0975，84～88份的植物粉碎材料，該植物粉碎材料的組成為玉米粉或麥麩或二者的混合物及米糠、玉米杆粉、棉籽殼粉、木屑中的一種或至少兩種的混合物。
製備上述一種用於作物防病增產的微生物製劑的方法，其步驟依次為(1)菌種試管培養採用馬鈴薯葡萄糖瓊膠固體培養基(PDA)，將哈茨木黴菌株T23接種於含鏈黴素40～70ppm的固體培養基(PDA)中，在18℃～30℃溫度下，培養1～7天；(2)液體發酵培養將玉米粉或麥麩或二者的混合物與水按1∶300～500的質量比例混勻裝於三角瓶中，在121℃、15磅下高溫加壓消毒20～30分鐘，製得培養液；冷卻後將(1)步試管中培養出的哈茨木黴菌株T23按接種在三角瓶中，菌株與培養液的質量比例為1∶400～500，並在溫度為20℃～30℃，光暗比為1∶0.8-1.2的光暗交替環境中，恆溫振蕩培養3～5天；(3)固體發酵培養將米糠、玉米杆粉、棉籽殼粉、木屑中的一種或至少兩種的混合物與水按1∶0.8～1.2的比例混勻，裝於耐溫塑膠袋中，在121℃、15磅下高溫加壓消毒120～150分鐘，冷卻後倒入已消毒的培養床中，形成固體培養料；將(2)步製得的液體發酵培養物與該固體培養料按1∶8～10的質量比例接種液體發酵培養物，在18℃～32℃、相對溼度90％以上、自然光照下、消毒的培養室內，通風培養1～3天即製成固體發酵培養物。
(4)製劑的製備將固體發酵培養物自然風乾至含水量在8％～10％，再用粉碎機粉碎，過100目篩後，測定孢子含量，菌株T23孢子含量達到3×1010個/克即為合格品。
本發明採用的哈茨木黴菌株T23，是從四川簡陽的中藥材丹參根際土壤中，利用病原菌作誘餌分離篩選而得。即採用尼龍網片作載體，先將消毒的尼龍網片放入接有病原菌的培養皿內，等尼龍網片上長滿菌體後，將尼龍網片置於土樣表面，培養3-5天後，拮抗木黴菌即可寄生到尼龍網片的病原菌上，揭下尼龍網片放在馬鈴薯葡萄糖瓊膠固體(PDA)培養基上，選取木黴菌株純化培養，就可獲得具有拮抗作用的木黴菌株；通過對這些菌株與多種病原菌的拮抗試驗，從中篩選出拮抗作用顯著的哈茨木黴菌株T23。
該菌株對引起農作物死苗、枯萎病、根腐病和白絹病等病害的立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、齊整小核菌等病原菌的拮抗指數達1級，對病原菌菌絲生長抑制率均在85％以上。
本發明採用的哈茨木黴菌株T23具有以下微生物學特性1、形態學特性孢子梗叢束疏鬆，環狀排列，主分枝呈樹狀，次級分枝多級，常2～3個一組，直角伸出；孢子球形、近球形、或倒卵形。
2、培養學特性在PDA培養基上，1～2天菌落為白色，老熟後轉為暗綠色。
該菌株已於2003年07月03日，在中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏登記號為CGMCC NO.0975。
與現有技術相比，本發明的有益效果是(1)生產周期短，操作簡易。從菌種培養到製劑的生產全程僅需5～11天。
(2)生產成本低液體和固體發酵所需的培養料分別為玉米粉、米糠等，其來源十分豐富，價格低廉。
(3)產孢量大根據本方法生產出的液體發酵培養物中的木黴菌孢子含量為0.5×108～2×108個/ml；製成的微生物製劑成品中，木黴菌孢子含量在3×1010～9×1010個/克，木黴菌孢子粉的重量百分比佔12％～16％，米糠、玉米粉等植物粉碎材料佔84％～88％。
(4)適用作物廣，防病對象多，促生增產作用顯著。適用作物包括糧油作物、蔬菜、中藥材，防病對象涉及由鐮刀菌、立枯絲核菌、大麗輪枝菌、菌核菌、疫菌和齊整小核菌等病原菌引起的枯萎病、立枯病、菌核病、白絹病等化學農藥難於防治的土傳病害，防治效果顯著，且可使作物顯著增產。
(5)採用本發明方法製備上述的微生物製劑，不僅可以防病、增產，達到提高種植效益的目的，還可減輕汙染，為生產和發展優質無公害農產品提供技術保證。
本發明的微生物製劑對多種作物防病增產的效果由下面的對比實驗證明用於油菜的試驗表明，油菜移栽時土壤穴施上述微生物製劑0.2kg/畝，能有效地減輕油菜菌核病的發生，對油菜菌核病的防治效果達62.9％，比目前常用的化學農藥多菌靈的防治效果(55.7％)好。並且油菜的千粒重比空白對照增加5.6％，油菜增產5.3％。
用於花生的試驗表明，花生播種時土壤穴施上述微生物製劑0.25kg/畝，花生出苗快、整齊、缺窩少。花生出苗早1-2天，出苗率提高7個百分點，缺窩率下降7個百分點，產量比空白對照增產10.2％。
用於辣椒的試驗表明，辣椒移栽時土壤穴施上述微生物製劑0.2kg/畝，能使辣椒增產14.0％。
用於茄子的試驗表明，茄子移栽時土壤穴施上述微生物製劑0.2kg/畝，能有效地減輕茄子黃萎病的發生，對其黃萎病的防治效果為55.9％，比目前常用的化學農藥多菌靈的防治效果(40.4％)好，並使茄子增產12.9％。
用於丹參的試驗表明，丹參播種時土壤穴施上述微生物製劑0.2kg/畝，對丹參根腐病防治效果為55.7％，與多菌靈的防治效果(57.5％)相當；對丹參出苗有促進作用，處理後的出苗率為83.8％，顯著高於多菌靈的71.3％和空白對照的64.4％；並使丹參增產8.2％。
用於川紅化的試驗表明，川紅化播種時土壤穴施上述微生物製劑0.2kg/畝，能有效控制川紅花枯萎病的發生，對其枯萎病的防治效果為70.4％，高於化學藥劑多菌靈的防治效果(60.9％)。並促進出苗和幼苗的生長，處理後的川紅花出苗率為87.5％，顯著高於空白對照的73.9％；單株鮮重和乾重分別為3.23g和0.46g，均顯著高於空白對照的2.70g和0.41g。
用於棉花的試驗表明，棉花播種時用上述微生物製劑拌種處理棉花(製劑∶棉種為1∶100)後，可有效減少棉花死苗和枯萎病的發生。對棉花立枯病的防治效果為70.0％，對棉枯萎病的防效可達60.4％，高於或相當於化學藥劑多菌靈的防治效果(分別為54.6％和61.2％)；同時，用該微生物製劑處理後的棉花出苗率為80.9％，顯著高於空白對照的出苗率(51.6％)。
下面結合實施例對本發明進一步說明。
具體實施方式
實施例一本例的微生物製劑中植物粉碎材料的組成為玉米粉及米糠。其製備方法的步驟依次為(1)菌種試管培養採用馬鈴薯葡萄糖瓊膠固體培養基(PDA)，將哈茨木黴菌株T23接種於含鏈黴素50ppm的固體培養基(PDA)中，在溫度為25℃下，培養1～3天，具體培養時間以菌絲布滿培養基表面為準。
PDA培養基中加入鏈黴素的目的，在於防止細菌和其它黴菌的生長。
(2)液體發酵培養採用玉米粉與水按1∶400的質量比例混勻裝於三角瓶中，在121℃、15磅下高溫加壓消毒25min，製得培養液；冷卻後將試管中的哈茨木黴菌株T23接種在三角瓶中，哈茨木黴與培養液的質量比例為1∶450，置於溫度25℃，光暗比為1∶1的光暗交替環境中，振蕩培養3～5天，培養製成液體發酵培養物。具體培養時間，以能確保液體發酵培養物中的菌株T23孢子含量達到0.5×108～2×108個/ml為宜。
(3)固體發酵培養將米糠與水按1∶1的質量比例混勻，裝於耐溫塑膠袋中，在121℃、15磅下高溫加壓消毒130min，冷卻後倒入已消毒的培養床中，按液體發酵培養物固體培養料為1∶9的質量比例接種液體發酵培養物，在溫度25℃、相對溼度90％以上，自然光照，在消毒的培養室內通風培養1～3天製成固體發酵培養物。具體培養時間應以固體發酵培養物中的菌株T23孢子含量能達到3×1010～9×1010個/克為宜。
(4)製劑的製備將固體發酵培養物自然風乾至含水量在8％～10％後，用粉碎機粉碎，過100目篩後，進行孢子含量測定，微生物製劑中的菌株T23孢子含量達到3×1010個/克即為合格品。
實施例二本例的微生物製劑中植物粉碎材料的組成為麥麩及玉米杆粉。其製備方法的步驟依次為(1)菌種試管培養採用馬鈴薯葡萄糖瓊膠固體培養基(PDA)，將哈茨木黴菌株T23接種於含鏈黴素40ppm的固體培養基(PDA)中，在溫度為22℃下，培養1～3天，具體培養時間以菌絲布滿培養基表面為準。
(2)液體發酵培養採用麥麩與水按1∶500的質量比例混勻裝於三角瓶中，在121℃、15磅下高溫加壓消毒30min，製得培養液；冷卻後將試管中的哈茨木黴菌株T23接種在三角瓶中，哈茨木黴菌株T23與培養液的質量比例為1∶500，置於溫度23℃，光暗比為1∶1.2的光暗交替環境中，振蕩培養3～5天，培養製成液體發酵培養物。具體培養時間，以能確保液體發酵培養物中的菌株T23孢子含量達到0.5×108～2×108個/ml為宜。
(3)固體發酵培養將玉米杆粉與水按1∶0.8的質量比例混勻，裝於耐溫塑膠袋中，在121℃、15磅下高溫加壓消毒150min，冷卻後倒入已消毒的培養床中，按液體發酵培養物固體培養料為1∶10的質量比例接種液體發酵培養物，在溫度28℃、相對溼度90％以上，自然光照，在消毒的培養室內通風培養1～3天製成固體發酵培養物。具體培養時間以固體發酵培養物中的菌株T23孢子含量能達到3×1010～9×1010個/克為宜。
(4)製劑的製備同實施例一。
實施例三本例的微生物製劑中植物粉碎材料的組成為麥麩及米糠。其製備方法的步驟依次為(1)菌種試管培養採用馬鈴薯葡萄糖瓊膠固體培養基(PDA)，將哈茨木黴菌株T23接種於含鏈黴素70ppm的固體培養基(PDA)中，在溫度為28℃下，培養1～3天，具體培養時間以菌絲布滿培養基表面為準。
(2)液體發酵培養採用麥麩與水按1∶300的質量比例混勻裝於三角瓶中，在121℃、15磅下高溫加壓消毒20min，製得培養液；冷卻後將試管中的哈茨木黴菌株T23接種在三角瓶中，哈茨木黴菌株T23與培養液的質量比例為1∶400，置於溫度27℃，光暗比為1∶0.8的光暗交替環境中，振蕩培養3～5天，培養製成液體發酵培養物。具體培養時間，以能確保液體發酵培養物中的菌株T23孢子含量達到0.5×108～2×108個/ml為宜。
(3)固體發酵培養將米糠與水按1∶1.2的質量比例混勻，裝於耐溫塑膠袋中，在121℃、15磅下高溫加壓消毒120min，冷卻後倒入已消毒的培養床中，按液體發酵培養物固體培養料為1∶8的質量比例接種液體發酵培養物，在溫度22℃、相對溼度90％以上，自然光照，在消毒的培養室內通風培養1～3天製成固體發酵培養物。具體培養時間，以固體發酵培養物中的菌株T23孢子含量能達到3×1010～9×1010個/克為宜。
(4)製劑的製備同實施例一。
實施例四本例的微生物製劑中植物粉碎材料的組成為玉米粉、麥麩的混合物及棉籽殼粉。其製備方法的步驟依次為(1)菌種試管培養採用馬鈴薯葡萄糖瓊膠固體培養基(PDA)，將哈茨木黴菌株T23接種於含鏈黴素60ppm的固體培養基(PDA)中，在溫度為18℃下，培養1～7天，具體培養時間以菌絲布滿培養基表面為準。
(2)液體發酵培養採用玉米粉與麥麩的混合物與水按1∶450的質量比例混勻裝於三角瓶中，在121℃、15磅下高溫加壓消毒30min，製得培養液；冷卻後將試管中的哈茨木黴菌株T23接種在三角瓶中，哈茨木黴菌株T23與培養液的質量比例為1∶450，置於20℃，光暗比為1∶0.9的光暗交替環境中，振蕩培養3～5天，培養製成液體發酵培養物。具體培養時間，以能確保液體發酵培養物中的菌株T23孢子含量達到0.5×108～2×108個/ml為宜。
(3)固體發酵培養將棉籽殼粉與水按1∶0.9的質量比例混勻，裝於耐溫塑膠袋中，在121℃、15磅下高溫加壓消毒150min，冷卻後倒入已消毒的培養床中，按液體發酵培養物固體培養料為1∶10的質量比例接種液體發酵培養物，在溫度18℃、相對溼度90％以上，自然光照，在消毒的培養室內通風培養1～3天製成固體發酵培養物。具體培養時間，以固體發酵培養物中的菌株T23孢子含量能達到3×1010～9×1010個/克為宜。
(4)製劑的製備同實施例一。
實施例五本例的微生物製劑中植物粉碎材料的組成為玉米粉、麥麩的混合物及木屑。其製備方法的步驟依次為(1)菌種試管培養採用馬鈴薯葡萄糖瓊膠固體培養基(PDA)，將哈茨木黴菌株T23接種於含鏈黴素70ppm的固體培養基(PDA)中，在溫度為30℃下，培養1～3天，具體培養時間以菌絲布滿培養基表面為準。
(2)液體發酵培養採用玉米粉、麥麩的混合物與水按1∶450的質量比例混勻裝於三角瓶中，在121℃、15磅下高溫加壓消毒20min，製得培養液；冷卻後將試管中的哈茨木黴菌株T23接種在三角瓶中，哈茨木黴菌株T23與培養液的質量比例為1∶450，置於30℃，光暗比為1∶1的光暗交替環境中，振蕩培養3～5天，培養製成液體發酵培養物。具體培養時間，以能確保液體發酵培養物中的菌株T23孢子含量達到0.5×108～2×108個/ml為宜。
(3)固體發酵培養將木屑與水按1∶1.1的質量比例混勻，裝於耐溫塑膠袋中，在121℃、15磅下高溫加壓消毒120min，冷卻後倒入已消毒的培養床中，按液體發酵培養物固體培養料為1∶8的質量比例接種液體發酵培養物，在溫度32℃、相對溼度90％以上，自然光照，在消毒的培養室內通風培養1～3天製成固體發酵培養物。具體培養時間，以固體發酵培養物中的菌株T23孢子含量能達到3×1010～9×1010個/克為宜。
(4)製劑的製備同實施例一。
上述各實施例的微生物製劑均含有12-16份質量的哈茨木黴菌株T23，84-88份質量的植物碎粉材料。
上述各實施例的固體發酵培養中使用的容器及培養室消毒的具體方式均為採用燻蒸消毒，按每平方米用高錳酸鉀1g、甲醛10ml進行燻蒸10～12小時，備用。
固體發酵培養時使用的植物粉碎材料既可為上述為各實施例那樣選取米糠、玉米杆份、棉籽殼份或木屑中的一種，也可以選取它們中的至少兩種的混合物。
本發明的微生物製劑在液體培養、固體培養時所使用的植物材料，也可用其它適宜培養哈茨木黴菌的現有植物材料進行替代。
本發明的微生物製劑的製備步驟中1、菌種試管培養的適宜溫度為22℃～28℃，在此溫度條件下1～3天菌絲即可布滿培養基表面；在18℃以下，菌絲生長較慢，需6天才能布滿培養基表面，在30℃以上時，菌絲需7天才能布滿培養基表面。
2、液體發酵培養的適宜溫度為23℃～27℃，其培養時間一般為84-96小時即可滿足要求；養溫度在20℃以下，菌株T23孢子含量小於0.5×108個/ml，在30℃以上時，菌株T23孢子含量小於0.4×108個/ml，在23℃～27℃時，菌株T23孢子含量為0.5×108個～2×108個/ml，25℃時孢子含量達最高達2×108個/ml。
3、固體發酵培養的適宜溫度為22℃-28℃，培養時間一般為36-60小時，在18℃以下時，需培養4天以上，在32℃以上時，木黴生長明顯受阻，也需培養4天以上，在22℃需培養3.5天菌絲才能布滿固體發酵物表面，在25℃時，菌絲1天即可布滿固體發酵物表面。
權利要求
1.一種用於作物防病增產的微生物製劑，它含有的組分及質量配比為12～16份的哈茨木黴(Trichoderma harzianum)菌株T23 CGMCC No.0975，84～88份的植物粉碎材料，該植物粉碎材料的組成為玉米粉或麥麩或二者的混合物及米糠、玉米杆粉、棉籽殼粉、木屑中的一種或至少兩種的混合物。
2.一種製備權利要求
1所述的微生物製劑的方法，其步驟依次為(1)菌種試管培養採用馬鈴薯葡萄糖瓊膠固體培養基(PDA)，將哈茨木黴菌株T23接種於含鏈黴素40～70ppm的固體培養基(PDA)中，在18℃～30℃溫度下，培養1～7天；(2)液體發酵培養將玉米粉或麥麩或二者的混合物與水按1∶300～500的質量比例混勻裝於三角瓶中，在121℃、15磅下高溫加壓消毒20～30分鐘，製得培養液；冷卻後將(1)步試管中培養出的哈茨木黴菌株T23接種在三角瓶中，菌株與培養液的質量比例為1∶400～500，並在溫度為20℃～30℃，光暗比為1∶0.8-1.2的光暗交替環境中，恆溫振蕩培養3～5天；(3)固體發酵培養將米糠、玉米杆粉、棉籽殼粉、木屑之一種或至少兩種的混合物與水按1∶0.8～1.2的質量比例混勻，裝於耐溫塑膠袋中，在121℃、15磅下高溫加壓消毒120～150分鐘，冷卻後倒入已消毒的培養床中，形成固體培養料；將(2)步製得的液體發酵培養物與該固體培養料按1∶8～10的質量比例接種液體發酵培養物，在18℃～32℃、相對溼度90％以上、自然光照下、消毒的培養室內，通風培養1～3天即製成固體發酵培養物。(4)製劑的製備將固體發酵培養物自然風乾至含水量在8％～10％，再用粉碎機粉碎，過100目篩後，測定孢子含量，菌株T23孢子含量達到3×1010個/克即為合格品。
專利摘要
本發明公開了一種用於作物防病增產的微生物製劑及其製備方法，該種微生物製劑的主要組份及質量配比為12～16份的哈茨木黴(Trichoderma harzianum)菌株T23CGMCC No.0975，84～88份的植物粉碎材料，該植物粉碎材料的組成為玉米粉或麥麩或二者的混合物及米糠、玉米杆粉、棉籽殼粉、木屑中的一種或至少兩種的混合物。本發明的微生物製劑，生產周期短、成本低；原料來源廣、價格低廉；產孢量大；使用方便、安全；適用作物廣、防病對象多、促生增產作用顯著；還可減輕汙染，為生產和發展優質無公害農產品提供技術保證。
文檔編號A01N63/04GKCN1488257SQ03135663
公開日2004年4月14日 申請日期2003年8月25日
發明者曾華蘭, 李瓊芳, 葉鵬盛, 何煉, 江懷仲, 譚永久, 何洪華 申請人:四川省農業科學院經濟作物育種栽培研究所, 四川省農業科學院經濟作物育種栽培研導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan