固定化擴展青黴脂肪酶催化合成糖苷酯類化合物的方法
2023-12-05 22:31:11
專利名稱：固定化擴展青黴脂肪酶催化合成糖苷酯類化合物的方法
技術領域：
本發明屬於酶化工領域，特別涉及一種利用固定化擴展青黴脂肪酶催化 糖苷醯化合成糖苷酯類化合物的方法。
背景技術：
糖苷廣泛存在於生物體內，其中很多糖苷因具有特殊的生物活性而擔負 著重要的生物功能。許多糖苷化合物，如天麻苷、熊果苷、葡萄糖豆腐果苷、
高熊果苷、異高熊果苷、水楊醛-^-D-葡萄糖苷等，由於具有特定的藥用價 值(例如抗腫瘤、抗微生物、降血脂、抗氧化、提高機體免疫功能、鎮靜安 眠等)而引起了人們的關注。糖苷化合物是一類活潑的化合物，結構上存在 著多個羥基，可以與其它不同結構的化合物相連接，當糖環的羥基連接上脂 肪族或芳香族醯基時，可以增強化合物的脂溶性，從而改善其在細胞和腸內 的吸收，提高其口服生物利用度，增強藥效。因此，對該類化合物的合成及 修飾則成為糖苷類藥物的一個主要研究方向。熊果苷除了具有抗菌、鎮咳、 降血糖等多種藥理作用外，還是人黑色素細胞中酪氨酸酶的抑制劑，能阻斷 多巴以及多巴醌的合成，從而有效地抑制黑色素的生成，具有美白作用，且 對皮膚沒有刺激性，毒副作用小。然而在使用過程中，熊果苷存在脂溶性差、 生物利用度低等問題。藥理活性研究表明，熊果苷的碳十一烯酸和月桂酸酯 衍生物均比親代化合物表現出更高的抗酪氨酸酶和抗亞油酸氧化活性。
糖苷類化合物糖環上羥基眾多，且反應活性相似。採用一般化學方法直接 酯化時，區域選擇性低，易產生大量的副產物，產物分離困難；為合成確定 位置醯化的產物，需要對糖環特定羥基進行保護和去保護等操作，反應步驟 多、工藝複雜；同時該方法採用鹼性催化劑，易產生含鹼廢液，對環境造成 嚴重汙染。而酶法合成避免了繁瑣的保護和去保護等複雜的反應步驟，反應 條件溫和、對環境友好，所得產物純度高。因此，酶催化糖苷區域選擇性醯 化是一條具有廣闊前景的替代途徑。曾有文獻(Tokiwa et al.， Med. Chem. Lett, 2007, 17: 3105-3108; Nakajima et al., J. Biosci. Bioeng. 1997, 87: 105-107; Watanabe et al., Biochem. Eng. J. 2009, 43: 261-265; Chigorimbo-MurefU et al,,J. Mol. Catal. B: Enzym., 2009， 56: 277-282 )公開了酶促熊果苷酯衍生物的 合成方法，但其所用的酶製劑為價格昂貴的商品化蛋白酶或脂肪酶，且催化 效率不高。如利用枯草桿菌蛋白酶催化合成熊果苷碳十一烯酸酯，其反應時 間較長，效率較低；利用來源於南極假絲酵母的脂肪酶催化熊果苷月桂酸酯 和阿魏酸酯的合成，其最大轉化率僅為50%;利用來源于洋蔥假單胞菌的脂 肪酶催化熊果苷肉桂酸酯的合成，其收率僅為28%。基於不同來源的脂肪酶 之結構與功能的差異，本發明選用價格低廉的固定化擴展青黴脂肪酶製劑催 化糖苷醯化以製備糖苷酯化合物，其不但收率高(85%-98%)，且成本大大 降低。
發明內容
為了解決上述現有技術的不足之處，本發明的首要目的在於提供一種固 定化擴展青黴脂肪酶催化合成糖苷酯類化合物的方法。
本發明的另一目的在於提供上述方法合成的糖苷酯類化合物。
本發明的目的通過下述技術方案實現 一種固定化擴展青黴(屍^^7/^附 ex;^似wm)脂肪酶催化合成糖苷酯類化合物的方法，包括以下操作步驟在 非水介質中，加入摩爾比為l: 1 20: l的醯基供體和糖苷，得到溶液，該
溶液中糖苷的濃度為1 40 mg/mL;加入與糖苷的質量比為10: 1 1: 10 的固定化擴展青黴脂肪酶，在溫度為30 60 °C、振蕩速度為100 300 rpm 和常壓條件下，轉酯化反應0.5 72小時，得到糖苷酯類化合物；
所述醯基供體為羧酸乙烯酯、酸酐、羧酸甲酯或羧酸乙酯；
所述糖苷為具有如下通式(II)的化合物
formula see original document page 5其中，Ri為氫、羥基、甲氧基、醛基、羥甲基、甲醯基或乙醯基；R: 為氫、甲基或醛基；R3為氫或甲基；所述非水介質為非質子有機溶劑或含低親核性陰離子的離子液中的一 種或兩種。
所述糖苷為熊果苷、天麻苷、葡萄糖豆腐果苷、高熊果苷、異高熊果苷
或水楊醛---D-葡萄糖苷。
所述固定化擴展青黴脂肪酶的製備包括以下操作步驟
(1) 將含有質量百分數為95%澱粉的擴展青黴脂肪酶粗酶粉(購自深
圳綠微康生物工程有限公司)溶於甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液中，配製成每毫
升緩衝液含有0.3g脂肪酶粗酶粉的懸浮液，在溫度35 t:和轉速150 rpm條 件下攪拌1 h;在溫度4°C和轉速6000 rpm條件下離心得上清液；所述甘氨 酸-氫氧化鈉緩衝液中甘氨酸和氫氧化鈉的重量比為2.9: 1;
(2) 將大孔吸附樹脂(D4020)用質量百分數為95%的乙醇浸泡24 h 後，用去離子水洗至濾液澄清，得到濾液；
(3) 將步驟(2)所得濾液添加到步驟(1)所得上清液中，加酶量為9 g粗酶粉/g樹脂；在溫度35匸和轉速150rpm條件下攪拌4h，用砂芯漏鬥 過濾，用甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液衝洗，抽濾後冷凍乾燥，得到固定化擴展 青黴脂肪酶；將固定化擴展青黴脂肪酶於4 °C冰箱保存備用。
所述非質子有機溶劑為四氫呋喃、丙酮、乙腈、二噁垸、叔丁醇、二甲 基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺、吡啶、異丙醚、異辛垸、正己垸、正庚烷、正 辛烷、正壬垸或環己垸；
所述含低親核性陰離子的離子液中的陰離子為四氟硼酸根離子、六氟磷 酸根離子、二 (三氟甲基磺醯)亞胺離子或胺基酸陰離子；陽離子為1-烷基 -3-甲基咪唑離子、l-烷基-2,3-二甲基咪唑離子、季銨離子、季磷離子、氨基 酸陽離子或N-垸基吡啶離子。
所述非水介質為上述非質子有機溶劑中的兩種，兩種非質子有機溶劑體 積比為1 19: 1。
所述非水介質為上述非質子有機溶劑中的一種和上述含低親核性陰離 子的離子液中的一種，其中含低親核性陰離子的離子液的體積百分含量為 5 95%。
上述方法製備的糖苷酯類化合物，具有如下通式(I ):formula see original document page 7
(i)
其中R為2 18個碳原子的烷醯基或9 11個碳原子的不飽和芳香醯 基；R,為氫、羥基、甲氧基、醛基、羥甲基、甲醯基或乙醯基；R2為氫、甲 基或醛基；R3為氫或甲基。
所述烷醯基為直鏈或支鏈的飽和或不飽和的垸醯基；所述不飽和芳香醯 基為順式不飽和芳香醯基或反式不飽和芳香醯基。
本發明相對現有技術，具有如下的優點及有益效果
(1) 採用廉價、高效的生物催化劑——自製固定化擴展青黴脂肪酶催 化糖苷酯衍生物合成。酶促反應選擇性高，產物結構易控，因此克服了傳統 化學方法選擇性低、易生成副產物，或需要保護和脫保護操作及產率低等缺 點；本發明選用價格低廉、來源於擴展青黴的固定化脂肪酶製劑催化糖苷酯 衍生物的合成，與現有的酶催化熊果苷酯衍生物合成的技術相比，具有收率 高(85% 98%)，成本低的優點。
(2) 本發明區域選擇性高，產率高、產物純度高、反應過程簡單易控， 產物易分離。
(3) 本發明在溫度為30 6(TC、振蕩速度為100 300rpm、常壓條件 下，利用酶催化製備糖苷酯衍生物，反應條件溫和、環境友好。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不 限於此。
實施例l:熊果苷6'-丁醯酯的合成
將熊果苷(109mg, 0.4mmo1)、 丁酸乙烯酯(3 mmol)、 20mL無水四 氫呋喃加入50 mL具塞三角瓶中混勻後，於其中加入1000 mg固定化擴展青 黴脂肪酶，常壓下於35'C、 300rpm的恆溫振蕩器內振蕩，利用薄層層析法 (TLC)監控反應。反應1 h後，過濾、真空濃縮濾液、柱層析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)-1/4， Rf=0.25)純化，得白色粉末產物116mg，收率為85%， 純度大於99%。結構通過13C NMR (100.5 MHz)和& NMR (400 MHz) 確認
13C NMR: S ppm 14.04 (C4")， 18.52 (C3"), 36.02 (C2"), 63.99 (C6'), 70.64 (C4')， 73.79 (C2'), 74.22 (C5'), 76.93 (C3'), 102.05 (Cl')， 116.01 (C3+C5), 118.24 (C2+ C6)， 150.70 (Cl)， 152.91 (C4), 173.17 (Cl")。
& NMR: S ppm 0.88 (t, 3H， H4"), 1.54 (q, 2H, H3"), 2.27 (t， 2H, H2"), 3.29-3.11 (m, 3H， H2'+ H3'+ H4'), 3.51 (t， 1H, H5'), 4.06 (dd， 1H, H6'), 4.33 (d， 1H, H6')， 4.68 (d， 1H， Hl')， 5.14 (d, 1H, OH4'), 5.24 (d, 1H, OH3'), 5.30 (d, 1H， OH2'), 6.65 (d, 2H, H3+ H5)， 6.84 (d, 2H, H2+ H6), 9.01 (s, 1H， OH4)。
實施例2:熊果苷6'-丁醯酯的合成
將熊果苷(218 mg, 0.8 mmol)、 丁酸酐(5.6 mmol)、 20 mL正己烷/四 氫呋喃(1/4, v/v)加入50 mL具塞三角瓶中混勻後，於其中加入900 mg固定 化擴展青黴脂肪酶，常壓下於4(TC、 200rpm的恆溫振蕩器內振蕩，利用薄 層層析法(TLC)監控反應。反應10h後，過濾、真空濃縮濾液、柱層析(石 油醚(PE)/乙酸乙酯(EA一1/4， 純化，得白色粉末產物230 mg，收
率為84%，純度大於99%。結構通過13C NMR (100.5 MHz)和& NMR (400 MHz)確認
13C NMR: S ppm 14.04 (C4"), 18.52 (C3"), 36.02 (C2")， 63.99 (C6')， 70.64 (C4'), 73.79 (C2')， 74.22 (C5'), 76.93 (C3')， 102.05 (Cl')， 116.01 (C3+C5), 118.24 (C2+C6)， 150.70 (Cl), 152.91 (C4)， 173.17 (Cl")。
& NMR: S ppm 0.88 (t， 3H, H4"), 1.54 (q， 2H, H3")， 2.27 (t， 2H, H2"), 3.29-3.11 (m, 3H, H2'+ H3'十H4'), 3.51 (t， 1H, H5'),楊(dd, 1H, H6'), 4.33 (d, 眠H6')， 4.68 (d, 1H， Hl'), 5.14 (d, 1H, OH4'), 5.24 (d, 1H, OH3')， 5.30 (d, 1H， OH2'), 6.65 (d, 2H, H3+ H5), 6.84 (d, 2H, H2+ H6), 9.01 (s, 1H, OH4)。
實施例3:熊果苷6'-己酸酯的合成
將熊果苷(20mg,0.07mmo1)、己酸乙烯酯(0.5 mmol)、 20mL異丙醚 /四氫呋喃(l/19,v/v)加入50mL具塞三角瓶中混勻後，於其中加入10mg固定 化擴展青黴脂肪酶，常壓下於35'C、 150rpm的恆溫振蕩器內振蕩，用TLC 監控反應。反應24h後，過濾、真空濃縮濾液、柱層析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA"4/1， Rf=0.25)純化，得白色粉末產物22.4mg，收率為86%，純度大 於99%。結構通過BCNMR (100.5 MHz)和iHNMR (400 MHz)確認
13C雨R: S ppm 14.37 (C6"), 22.34 (C5"), 24.69 (C3"), 31.24 (C4"), 34.08 (C2"), 63.98 (C6')， 70.62 (C4'), 73.78 (C2'), 74.22 (C5'), 76.93 (C3'), 102.07 (Cl'): 116.01 (C3+ C5), 118.23 (C2+ C6)， 150.71 (Cl), 152.92 (C4), 173.32 (Cl")。
& NMR: S ppm 0.85 (t, 3H, H6")， 1.25 (s, 4H， H4"+ H5")， 1.52 (q， 2H, H3"), 2.28 (t, 2H， H2"), 3.29-3.11 (m， 3H， H2'十H3'十H4'), 3.50 (t, 1H, H5'),楊 (dd, 1H， H6'), 4.33 (d, 1H, H6'), 4.67 (d, 1H, Hl'), 5.14 (d, 1H, OH4'), 5.23 (d, 1H, OH3'), 5.31 (d, 1H, OH2')， 6,65 (d， 2H, H3+ H5)， 6.84 (d, 2H, H2+ H6), 9.01 (s， 1H, OH4)。
實施例4:熊果苷6'-己酸酯的合成
將熊果苷(109mg, 0.4mmo1)、己酸乙酯(3.6 mmol)、 20 mL異丙醚/ 乙腈(1/5, v/v)加入50 mL具塞三角瓶中混勻後，於其中加入800 mg固定化 擴展青黴脂肪酶，常壓下於45 °C、 250 rpm的恆溫振蕩器內振蕩，用TLC 監控反應。反應4.5h後，過濾、真空濃縮濾液、柱層析(石油醚(PE)/乙酸 乙酯(EA"4/1， RJN0.25)純化，得白色粉末產物127 mg，收率為85%，純 度大於99%。結構通過13C NMR (100.5 MHz)和^ NMR (400 MHz)確 認
13C NMR: S ppm 14.37 (C6"), 22.34 (C5"), 24.69 (C3"), 31.24 (C4"), 34.08 (C2"), 63.98 (C6'), 70.62 (C4'), 73.78 (C2')， 74.22 (C5'), 76.93 (C3'), 102.07 (Cl')， 116.01 (C3+ C5)， 118.23 (C2+ C6)， 150.71 (Cl), 152.92 (C4), 173.32 (Cl")。
!H NMR: S ppm 0.85 (t, 3H， H6")， 1.25 (s， 4H, H4"十H5"), 1.52 (q, 2H， H3"), 2.28 (t, 2H, H2"), 3.29-3,11 (m, 3H, H2'+ H3'十H4')， 3.50 (t, 1H, H5'), 4.06 (dd， 1H, H6'), 4.33 (d, 1H, H6'), 4.67 (d, 1H, Hl')， 5.14 (d, 1H, OH4'), 5.23 (d, 1H, OH3')， 5.31 (d, 1H, OH2')， 6.65 (d, 2H, H3+ H5)， 6.84 (d, 2H, H2+ H6), 9.01 (s, 1H, OH4)。
實施例5:熊果苷6'-辛酸酯的合成
將熊果苷(109 mg, 0.4 mmol)、辛酸乙烯酯(0.4 mmol) 、 20 mL[C4MIm]PF6/四氫呋喃(1/9, v/v)加入50 mL具塞三角瓶中混勻後，於 其中加入600 mg固定化擴展青黴脂肪酶，常壓下於40 °C 、 250 rpm的恆溫振蕩器內振蕩，利用TLC監控反應。反應8h後，過濾、真空濃縮濾液、柱 層析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA"4/1， RfH).27)純化，得白色粉末產物145 mg，收率為91%，純度大於99%。結構通過13CNMR( 100.5 MHz)和^NMR (400 MHz)確認
13C NMR: S ppm 14.51 (C8"), 22.61 (C7"), 25.01 (C3")， 28.93 (C4")， 29.01 (C5"), 31.68 (C6"), 34.12 (C2"), 63.98 (C6'), 70.61 (C4')， 73.79 (C2'), 74.22 (C5')， 76.93 (C3'), 102.08 (C1'), 116.01 (C3+ C5), 118.22 (C2+ C6)， 150.71 (Cl), 152.93 (C4), 173.32 (Cr')。
& NMR: S ppm 0.85 (t, 3H， H8"), 1.25 (s, 8H， H4"+ H5"+ H6"+ H7"), 1.52 (t, 2H, H3")， 2.28 (t， 2H， H2")， 3.29-3.11 (m, 3H， H2'+ H3'十H4') 3.50 (t， 1H, H5')， 4.06 (dd, 1H, H6')， 4.31 (d, 1H, H6'), 4.67 (d, 1H， Hl'), 5.14 (d, 1H, OH4')， 5.22 (d, 1H, OH3'), 5.30 (d, 1H, OH2')， 6.66 (d, 2H， H3+ H5)， 6.83 (d, 2H, H2+ H6), 9.00 (s， 1H, OH4)。
實施例6:熊果苷6'-辛酸酯的合成
將熊果苷(109 mg, 0.4 mmol)、辛酸甲酯(4 mmol)、 20 mL[C6MIm]PF6/ 四氫呋喃(1/9, v/v)加入50 mL具塞三角瓶中混勻後，於其中加入600 mg 固定化擴展青黴脂肪酶，常壓下於45'C、 250rpm的恆溫振蕩器內振蕩，利 用TLC監控反應。反應4h後，過濾、真空濃縮濾液、柱層析(石油醚(PE)/ 乙酸乙酯(EA)-4/1， RfK).27)純化，得白色粉末產物145 mg，收率為91%， 純度大於99%。結構通過13C NMR (100.5 MHz)和]H NMR (400 MHz) 確認
13C NMR: 5 ppm 14.51 (C8")， 22.61 (C7")， 25.01 (C3"), 28.93 (C4"), 29.01 (C5"), 31.68 (C6")， 34.12 (C2"), 63.98 (C6'), 70.61 (C4'), 73.79 (C2'), 74.22 (C5'), 76.93 (C3'), 102.08 (Cl')， 116.01 (C3+ C5)， 118.22 (C2+ C6), 150.71 (Cl)， 152.93 (C4), 173.32 (Cl")。
!H NMR: S ppm 0.85 (t, 3H, H8"), 1.25 (s, 8H, H4"+ H5"+ H6"十H7"), 1.52 (t, 2H, H3"), 2.28 (t, 2H, H2")， 3.29-3.11 (m， 3H， H2'+ H3'+ H4') 3.50 (t, 1H, H5'), 4.06 (dd, 1H, H6'), 4.31 (d, 1H, H6'), 4.67 (d, 1H, m'), 5.14 (d, 1H, OH4'), 5.22 (d, 1H, OH3'), 5.30 (d， 1H, OH2'), 6.66 (d, 2H, H3+ H5)， 6.83 (d， 2H， H2+ H6), 9.00 (s, 1H，OH4)。實施例7:熊果苷6'-癸酸酯的合成
將熊果苷(800mg,2.9mmo1)、癸酸乙烯酯(14mmo1)、 20 mL 二噁烷 加入50 mL具塞三角瓶中混勻後，於其中加入520 mg固定化擴展青黴脂肪 酶，常壓下於6(KC、 250 rpm的恆溫振蕩器內振蕩，利用TLC監控反應。 反應24h後，過濾、真空濃縮濾液、柱層析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA"4/1， Rf=0.27)純化，得白色粉末產物1087mg，收率為88%，純度大於99°/。。結 構通過"CNMR (100.5MHz)和iHNMR (400 MHz)確認
13C NMR: 5 ppm 14.54 (C10"), 22.67 (C9"), 25.01 (C3")， 29.06 (C4"), 29.23 (C5")， 29.28 (C7"), 29.43 (C6"), 31.85 (C8"), 34.12 (C2")， 63.99 (C6')， 70.62 (C4')， 73.79 (C2')， 74.23 (C5'), 76.94 (C3')， 102.11 (Cl')， 116.00 (C3+ C5), 118.23 (C2+ C6), 150.72 (Cl), 152.94 (C4)， 173.31 (Cl")。
& NMR: S ppm 0.85 (t, 3H， H10"), 1.23 (s， 12H, H4"+ H5"+ H6"+ H7"+ H8"+ H9"), 1.51 (t, 2H, H3"), 2,28 (t, 2H, H2"), 3.29-3.08 (m， 3H, H2'+ H3'+ H4'), 3.50 (t, 1H, H5')， 4.06 (dd, 1H, H6'), 4.31 (d, 1H, H6'), 4.66 (d， 1H, HI'), 5.14(d, 1H, 0H4'), 5.22 (d, 1H, OH3'), 5.30 (d， 1H, OH2'), 6.65 (d， 2H, H3+ H5), 6.83 (d, 2H， H2+ H6), 9.00 (s, 1H, OH4)。
實施例8:熊果苷6'-月桂酸酯的合成
將熊果苷(109 mg, 0.4 mmol)、月桂酸乙烯酯(0.8 mmol) 、 20 mL[QPy]NTf2/丙酮(19/l,v/v)加入50 mL具塞三角瓶中混勻後，於其中加 入100 mg固定化擴展青黴脂肪酶，常壓下於60 °C、 250 rpm的恆溫振蕩器 內振蕩，利用TLC監控反應。反應72h後，過濾、真空濃縮濾液、柱層析
(石油醚(PEy乙酸乙酯(EA)-l/3， RfN).27)純化，得白色粉末產物160 mg， 收率為88%，純度大於99%。結構通過"CNMR (100.5 MHz)和1H NMR
(400 MHz)確認
13C NMR: S ppm 14.51 (C8")， 22.61 (C7,.)， 25.01 (C3 ), 28.93 (C4..)， 29.01 (C5")， 31.68 (C6")， 34.12 (C2',)， 63.98 70.61 (C4,)， 73.79 (C2,)， 74.22 (C5')， 76.93 (C3〕， 102.09 116.01 (C3+ C5), 118.22 (C2+ C6), 150.71 (d), 152.93 (C4)， 173.32 (Cr)。
!HNMR: S ppm 0.85 (t, 3H, H8..)， 1.25 (s， 8H， H4.'+ H5"+ H6"+ H7")， 1.52 (t, 2H， H3,')， 2.28 (t, 2H, H2"), 3.29-3.11 (m, 3H， H2,+ H3.+ H4') 3.50 (t, 1H, H5')， 4.06 (dd, 1H， H6,)， 4.31 (d, 1H, H6,)， 4.67 (d, 1H, Hr), 5.14 (d， 1H, OH4,)， 5.22 (d, 1H，OH3.)， 5.30 (d, 1H, OH2〕， 6.66 (d， 2H, H3+ H5), 6.83 (d， 2H, H2+ H6), 9.00 (s, 1H， OH4)。
實施例9:熊果苷6'-棕櫚酸酯的合成
將熊果苷(109mg,0.4mmo1)、棕櫚酸乙烯酯(4mmo1)、 20 mL 二噁垸 /異辛烷(1/1，v/v)加入50mL具塞三角瓶中混勻後，於其中加入200mg固 定化擴展青黴脂肪酶，常壓下於5(TC、 200rpm的恆溫振蕩器內振蕩，利用 TLC監控反應。反應IO h後，過濾、真空濃縮濾液、柱層析(石油醚(PE)/ 乙酸乙酯(EA)-1/3， Rf=0.28)純化，得白色粉末產物174mg，收率為85%， 純度大於99%。結構通過13C NMR (100.5 MHz)和& NMR (400 MHz) 確認
13C NMR: S卯m 13.97 (C16"), 22.13 (C15")， 24.44 (C3"), 28.51 (C4"), 28.75 (C5")， 28.93 (C13"), 29.07 (C6"+ C7"+ C8"+ C9"+ C10"+ Cll"+ C12")，
31.33 (C14"), 33.53 (C2"), 63.43 (C6'), 70.02 (C4')， 73.19 (C2'), 73.63 (C5'),
76.34 (C3'), 101.51 (C1'), 115.41 (C3+ C5), 117.62 (C2+ C6)， 150.13 (Cl)， 152.36 (C4), 172.72 (Cl")。
& NMR: S ppm 0.85 (t， 3H， H16") 1.23 (s, 24H, H4"+ H5"+ H6"+ H7"+ H8"+ H9"+ H10"+ Hll"+ H12"+ H13"十H14"十H15")， 1.50 (t, 2H, H3"), 2.28 (t, 2H， H2"), 3.23-3.14 (m, 3H, H2'+ H3'+ H4'), 3.50 (t, 1H， H5')， 4.06 (dd, 1H, H6'), 4.29 (d, 1H, H6')， 4.66 (d, 1H， Hl')， 5.17 (s, 1H， 0H4'), 5.25 (d, 1H, OH3'), 5.32 (s， 1H， OH2'), 6.65 (d， 2H, H3+ H5)， 6.83 (d, 2H, H2+ H6), 9.01 (s, 1H, OH4)。
實施例10:熊果苷6'-甲基丙烯酸酯的合成
將熊果苷(109 mg, 0.4 mmol)、甲基丙烯酸乙烯酯(6 mmol)、 20 mL[C4MIm]BF4/乙腈(1/19, v/v)加入50 mL具塞三角瓶混勻後，於其中加 入600 mg固定化擴展青黴脂肪酶，常壓下於55'C、 150 rpm的恆溫振蕩器 內振蕩，利用TLC監控反應。反應72h後，過濾、真空濃縮濾液、柱層析
(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA^4/1， Rf=0.25)純化，得白色粉末產物115 mg， 收率為85%，純度大於99%。結構通過"CNMR (100.5 MHz)和NMR
(400 MHz)確認
13C NMR: 5 ppm 17.88 (C4"), 64.05 (C6'), 70.17 (C4'), 73.18 (C2'), 73.61 (C5'), 76.38 (C3'), 101.35 (Cl'), 115,40 (C3+ C5)， 117.47 (C2+ C6), 125.67 (C3"),說 135.84 (C2"), 150.10 (Cl), 152.24 (C4)， 166.33 (Cl")。
H NMR: 5 ppm 1.89 (s， 3H, H4"), 3.32-3.15 (m, 3H， H2'+ H3'+ H4')， 3.59 (t， 1H, H5')， 4.06 (dd， 1H, H6'), 4.44 (d, 1H, H6'), 4.69 (d, 1H, Hl'), 5.14 (s, 1H， OH4')， 5.26 (d, 1H, OH3'), 5.29 (d, 1H， OH2')， 5.69 (d, 1H, H3"), 6.05 (s， 1H, H3")， 6.63 (d， 2H, H3+ H5), 6.84 (d, 2H, H2+ H6), 8.98 (s， 1H, OH4)。
實施例lh熊果苷6'-碳十一烯酸酯的合成
將熊果苷(109 mg, 0.4 mmol)、碳H"^—烯酸乙烯酯(6 mmol)、 20 mL 四氫呋喃加入50 mL具塞三角瓶混勻後，於其中加入600 mg固定化擴展青 黴脂肪酶，常壓下於45 'C、 200 rpm的恆溫振蕩器內振蕩，利用TLC監控 反應。反應0.5 h後，過濾、真空濃縮濾液、柱層析(石油醚(PE)/乙酸乙酯 (EA)=4/1， RfN3.25)純化，得白色粉末產物172 mg，收率為98%，純度大 於99%。結構通過"CNMR (100.5 MHz)和^NMR (400 MHz)確認
^NMR: S ppm 1.23 (s, 8H， H4'十H5"+ H6"+ H7")， 1.32-1.30 (m， 2H， H8"), 1.51 (s, 2H, H3"), 1.99 (q, 2H, H9"), 2.27 (t， 2H, H2"), 3.27-3.12 (m, 3H， H2'+ H3'十H4'), 3.50 (t, 1H, H5'), 4.06 (dd, 1H， H6'), 4.31 (d， 1H, H6'), 4.66 (d, 1H, Hl'), 5.00-4.90 (m, 2H, Hll"), 5.13 (s, 1H， OH4'), 5.21 (d， 1H, OH3')， 5.29 (s, 1H, OH2'), 5.82-5.72 (m, 1H, H10"), 6.65 (d, 2H, H3+ H5), 6.83 (d, 2H, H2+ H6): 8.99 (s, 1H, OH4)。
13C NMR: S ppm 24.38 (C3")， 28.25 (C8"), 28.41 (C6"+ C7"), 28.60 (C5"), 28.65(C4" )， 33.12 (C9"), 33.52 (C2")， 63.38 (C6'), 70.05 (C4')， 73.19 (C2'), 73.65 (C5')， 76.36 (C3'), 101.57 (Cl'), 114.51 (Cll"), 115.40 (C3+ C5), 117,66 (C2+ C6), 138.77 (C10"), 150.12 (Cl), 152.34 (C4), 172.66 (Cl")。
實施例12:熊果苷6'-苯甲酸酯的合成
將熊果苷(109mg,0.4mmo1)、苯甲酸乙烯酯(8mmo1)、 20 mL正辛烷 /四氫呋喃(19/1, v/v)加入50 mL具塞三角瓶混勻後，於其中加入700 mg 固定化擴展青黴脂肪酶，常壓下置於6(TC、 200rpm的恆溫振蕩器內振蕩， 利用TLC監控反應。反應72h後，過濾、真空濃縮濾液、柱層析(石油醚 (PE)/乙酸乙酯(EA"1/4， RfH).25)純化，得產物130 mg，收率為86%，白 色粉末，純度大於99%。結構通過^CNMR (100.5 MHz)和^NMR (400 MHz)確認"C NMR: S ppm 165.51 (Cl"), 152.25 (C4)， 150.05 (Cl), 133.34 (C5"), 129.68 (C2")， 129.14 (C3'十C7"), 128.68 (C4"十C6"), 117.56 (C2+ C6), 115.40 (C3+ C5), 101.36 (CI'), 76.45 (C3')， 73.65 (C5'), 73.24 (C2'), 70.25 (C4'), 64.32 (C6')。
& NMR: S ppm 9.02 (s, 1H, OH4), 7.98 (d, 2H， H3"+ H7"), 7.70-7.66 (m, 1H, H5"), 7.55 (t, 2H, H4"十H6"), 6.88 (d, 2H， H2+ H6), 6.60 (d, 2H, H3+ H5), 5.37-5.36 (m, 2H， OH2'十OH3'), 5.18 (t, 1H, OH4'), 4.76 (t, 1H， Hl'), 4.63 (d, 1H H6'), 4.31-4.27 (m, 1H, H6'), 3.54 (t, 1H, H5'), 3.38-3.28 (m, 3H， H2'+ H3'+ H4')。
實施例13:天麻苷6'-己酸酯的合成
將天麻苷(115mg, 0.4mmo1)、己酸乙烯酯(4 mmol)、 20mL環己垸/ 四氫呋喃(1/4,v/v)加入50mL具塞三角瓶混勻後，於其中加入500mg固 定化擴展青黴脂肪酶，常壓下置於5(TC、 200rpm的恆溫振蕩器內振蕩，利 用TLC監控反應。反應6h後，過濾、真空濃縮濾液、柱層析(石油醚(PE)/ 乙酸乙酯(EA)-1/4， Rf=0.25)純化，得產物131 mg，收率為85%，白色粉 末，純度大於99%。結構通過13C NMR (100.5 MHz)禾Q ^NMR (400 MHz) 確認。
實施例14:葡萄糖豆腐果苷6'-辛酸酯的合成
將葡萄糖豆腐果苷(115mg,0.4mmo1)、辛酸乙烯酯(6mmo1)、 20 mL 異辛垸/叔丁醇(1/5, v/v)加入50 mL具塞三角瓶混勻後，於其中加入400 mg 固定化擴展青黴脂肪酶，常壓下置於55"、 200rpm的恆溫振蕩器內振蕩， 利用TLC監控反應。反應4 h後，過濾、真空濃縮濾液、柱層析(石油醚(PE)/ 乙酸乙酯(EA)4/4， RfN).25)純化，得產物145 mg，收率為88%，白色粉 末，純度大於99%。結構通過13CNMR (100.5 MHz)和& NMR (400 MHz) 確認。
實施例15:葡萄糖豆腐果苷6'-月桂酸酯的合成
將葡萄糖豆腐果苷(115mg,0.4mmo1)、辛月桂酸酸乙烯酯(4mmo1)、 20mL正壬垸/丙酮(1/5, v/v)加入50 mL具塞三角瓶混勻後，於其中加入 520 mg固定化擴展青黴脂肪酶，常壓下置於30 'C、 250 rpm的恆溫振蕩器內振蕩，利用TLC監控反應。反應4h後，過濾、真空濃縮濾液、柱層析(石 油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)-1/4， RfK).25)純化，得產物142mg，收率為86%， 白色粉末，純度大於99%。結構通過13C NMR (100.5 MHz)和^NMR (400 MHz)確認。
實施例16:水楊醛-P -D-葡萄糖苷6'-巴豆酸酯的合成 將水楊醛-e-D-葡萄糖苷(115 mg， 0.4 mmol)、巴豆酸酸乙烯酯(4 mmol)、 20mL正庚烷/乙腈(l/5,v/v)加入50 mL具塞三角瓶混勻後，於其 中加入800 mg固定化擴展青黴脂肪酶，常壓下置於55 °C、 100 rpm的恆溫 振蕩器內振蕩，利用TLC監控反應。反應72h後，過濾、真空濃縮濾液、 柱層析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)-1/4， RM).25)純化，得產物145 mg， 收率為88%，白色粉末，純度大於99%。結構通過"CNMR (100.5 MHz) 和iHNMR (400 MHz)確認。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述 實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、 修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護 範圍之內。
權利要求
1、一種固定化擴展青黴(Penicillium expansum)脂肪酶催化合成糖苷酯類化合物的方法，其特徵在於包括以下操作步驟在非水介質中，加入摩爾比為1∶1～20∶1的醯基供體和糖苷，，得到溶液，該溶液中糖苷的濃度為1～40mg/mL；加入與糖苷的質量比為10∶1～1∶10的固定化擴展青黴脂肪酶，在溫度為30～60℃、振蕩速度為100～300rpm和常壓條件下，轉酯化反應0.5～72小時，得到糖苷酯類化合物；所述醯基供體為羧酸乙烯酯、酸酐、羧酸甲酯或羧酸乙酯；所述糖苷為具有如下通式(II)的化合物其中，R1為氫、羥基、甲氧基、醛基、羥甲基、甲醯基或乙醯基；R2為氫、甲基或醛基；R3為氫或甲基；所述非水介質為非質子有機溶劑或含低親核性陰離子的離子液中的一種或兩種。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述糖苷為熊果苷、天 麻苷、葡萄糖豆腐果苷、高熊果苷、異高熊果苷或水楊醛-:-D-葡萄糖苷。
3、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述固定化擴展青黴脂 肪酶的製備包括以下操作步驟(1) 將含有質量百分數為95%澱粉的擴展青黴脂肪酶粗酶粉溶於甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液中，配製成每毫升緩衝液含有0.3g脂肪酶粗酶粉的懸浮 液，在溫度35 。C和轉速150 rpm條件下攪拌1 h;在溫度4。C和轉速6000 rpm 條件下離心得上清液；所述甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液中甘氨酸和氫氧化鈉的 重量比為2.9: 1;(2) 將大孔吸附樹脂用質量百分數為95%的乙醇浸泡後，用去離子水洗至濾液澄清，得到濾液；(3)將步驟(2)所得濾液添加到步驟(1)所得上清液中，加酶量為9 g粗酶粉/g樹脂；在溫度35'C和轉速150rpm條件下攪拌4h，過濾，用甘 氨酸-氫氧化鈉緩衝液衝洗，抽濾後冷凍乾燥，得到固定化擴展青黴脂肪酶。
4、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述非質子有機溶劑為 四氫呋喃、丙酮、乙腈、二噁垸、叔丁醇、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺、 吡啶、異丙醚、異辛烷、正己烷、正庚垸、正辛烷、正壬垸或環己垸；所述含低親核性陰離子的離子液中的陰離子為四氟硼酸根離子、六氟磷 酸根離子、二 (三氟甲基磺醯)亞胺離子或胺基酸陰離子；陽離子為1-垸基 -3-甲基咪唑離子、l-烷基-2,3-二甲基咪唑離子、季銨離子、季磷離子、氨基 酸陽離子或N-垸基吡啶離子。
5、 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述非水介質為非質子 有機溶劑中的兩種。
6、 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述非水介質為非質子 有機溶劑中的一種和含低親核性陰離子的離子液中的一種，其中含低親核性 陰離子的離子液的體積百分含量為5 95%。
7、 根據權利要求1 6任一項所述方法製備的糖苷酯類化合物，其特徵在於該糖苷酯類化合物具有如下通式(I ):formula see original document page 3其中R為2 18個碳原子的烷醯基或9 H個碳原子的不飽和芳香醯 基；&為氫、羥基、甲氧基、醛基、羥甲基、甲醯基或乙醯基；R2為氫、甲 基或醛基；R3為氫或甲基。
8、根據權利要求7所述的糖苷酯類化合物，其特徵在於所述烷醯基 為直鏈或支鏈的飽和或不飽和的烷醯基；所述不飽和芳香醯基為順式不飽和 芳香醯基或反式不飽和芳香醯基。
全文摘要
本發明公開了一種固定化擴展青黴脂肪酶催化合成糖苷酯類化合物的方法。該方法是在非水介質中，加入摩爾比1∶1～20∶1的糖苷和醯基供體，糖苷的濃度為1～40mg/mL；加入與糖苷的質量比為10∶1～1∶10的固定化擴展青黴脂肪酶，在溫度30～60℃、振蕩速度100～300rpm和常壓條件下，轉酯化反應0.5～72小時，得到糖苷酯類化合物。該化合物具有如上通式(I)的結構。本發明選用一種價格低廉的固定化擴展青黴脂肪酶製劑進行轉酯化反應合成糖苷的酯類化合物，不但收率高達85％～98％，且成本大大降低。本發明具有反應條件溫和、環境友好、區域選擇性高、反應過程簡單可控、產物易分離和成本低的優點。
文檔編號C12P19/44GK101624612SQ20091004170
公開日2010年1月13日 申請日期2009年8月7日 優先權日2009年8月7日
發明者虹 吳, 宗敏華, 寧 李, 楊榮玲 申請人:華南理工大學