一種培育轉基因小麥的方法
2023-12-10 04:05:01 1
專利名稱：一種培育轉基因小麥的方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域中一種培育轉基因植物的方法及其應用，特別涉及一種培育轉基因小麥的方法及其應用。直量拉水小麥是最重要的糧食作物之一，是人類食物和營養的基本來源。
背景技術：
目前全世界小麥播種面積約2 .沈億公頃，總產量約5 . 5億噸。
發明內容
本發明的目的是提供一種簡單、快速、實用的培育轉基因小麥的方法，利用該方法培育轉基因小麥不需經過組織培養和植株再生的過程。本發明所提供的培育轉基因小麥的方法，是通過農桿菌的介導將外源基因導入小麥生長點，通過非組培遺傳轉化方法得到轉基因小麥。生長點可為根尖生長點、莖尖生長點，優選為莖尖生長點。所述遺傳轉化的外植體為小麥種子23 — 27 「 C萌發48 — 72小時得到的莖尖生長點。攜帶有外源基因的農桿菌需先在80 — 120卿乙酞丁香酮中培養1 一 3小時，再在0 . 03 — 0 . 05 MPa真空度下，感染外植體8 一 12分鐘。然後將被感染的外植體轉入合適培養基中，如 MS培養基，在22 — 250C、14 一 16 / 10 — 8小時光周期下共培養2 — 4天得到轉基因小麥幼苗。本發明的方法與其它培育轉基因小麥方法的顯著區別在於採用小麥生長點作為農桿菌介導的遺傳轉化的外植體，而不是未成熟胚或胚性愈傷組織或懸浮細胞，不需經過組織培養和植株再生的過程，從根本上克服了由於小麥基因型對轉化後形成可育再生植株的限制。本發明通過對局部人工損傷的小麥生長點採用真空滲入技術進行農桿菌介導的遺傳轉化，獲得了表達報告基因的轉基因小麥，生長點轉化率達到60 — 70 %，成苗率平均90 %，T。代種子卡那黴素抗性陽性率為16 — 21 %，T，代幼苗報告基因表達陽性率佔所測植株的81 %。尤為重要的是克服了小麥遺傳轉化的瓶頸問題一基因型的限制。本發明所試材料的品種包括小麥金花、小麥京411、小麥4071，均獲得上述效果。 本發明的方法轉化效率高、操作簡便、重複性好、不依賴於受體的基因型。本發明的方法可以培育出各種高產、優質和/或抗逆性強的小麥新種質非組培遺傳轉化方法可應用到其它受基因型限制大難以獲得轉基因植株的單子葉農作物中，可以培育高產、抗逆、優質的新型農作物。
具體實施例方式實施例1、轉基因小麥的培育 1、小麥外植體的處理
(1 )將金花、京411和京4071三種小麥品種的小麥種子用10 %的次氯酸消毒 5分鐘，再用70 %的乙醇處理10分鐘，然後用無菌水衝洗3次。在一無菌大平皿中墊三層以無菌水浸溼的紗布，將經消毒處理的小麥種子置於平皿中25 〃 C黑暗中萌發48小時，得到待轉化的小麥萌發種子。( 2 )在無菌條件下用解剖針將待轉化的小麥萌發種子胚芽鞘劃開，儘量暴露其生長點，以便於外源基因的導入。2、轉化用農桿菌的培養
(1 )將過夜培養的農桿菌菌株LBA4404 / 3301，其中含CaMV 355啟動子驅動的 ⑶S基因，Iml接種於IOOml含鏈黴素100 mg / L，卡那黴素50 mg / L和利福平50 mg / L的YEB培養基中，^OC，300 rpm振蕩培養至菌液濃度為0D6。。。. =0.7
ο
(2 )在轉化前向菌液中加入乙酞丁香酮至100卿，繼續在^oc，300 rPm振蕩培養2小時。將上述菌液分裝於50ml的無菌三角瓶中，每瓶20ml。3、轉化(1 )將步驟1的(2 )中的小麥生長點浸入步驟2的(2 )中的菌液中，侵染20分鐘後，置於負壓條件下，真空度0 . 04 Mpa，滲透10分鐘。(2 )真空滲透處理後，倒除菌液，用無菌吸水紙將小麥外植體表面的菌液吸淨，轉入含梭節基青黴素的MS培養基中，22 — 250C ,16/8小時光周期下共培養3天。4、生長點轉化後3天報告基因的瞬時表達及轉化率檢測
(1 )⑶S基因表達的組織化學檢測將轉化3天的小麥幼苗置於含1 %甲醛、 50mM pH 7 . 0的磷酸鈉緩衝液和0 . 05 % TritonX 一 100的固定液中，室溫下溫和搖動30分鐘；倒掉固定液，再以50mM磷酸鈉緩衝液(pH 7 . 0 )洗3次；將幼苗轉入含 2 InMX 一 Glue，50InM 磷酸鈉緩衝液(pH 7 . 0 )和 0 . 05 % TritonX 一 100 的染色液中，37oC保溫8小時；之後轉移至75 %乙醇中脫色4小時，然後在解剖鏡下觀察。( 2 )報告基因表達結果小麥金花、小麥京411、小麥4071三種小麥品種轉化後均有⑶S基因表達的藍色顯色反應。如表1所示，小麥金花、小麥京411和小麥4071 的表達率分別為61 . 3 %、64 . 3 %和65 . 8 %。5、生長點轉化後的培育和成苗將共培養3天後的小麥幼苗移入以銼石為基質的花盆中，在25 〃 C、60 %相對溼度、16 / 8小時光周期的培養室中培養3 — 4周後成苗，然後轉入自然光溫室中栽種，約90 %的苗正常結實。5、代種子的篩選以50 mg / L卡那黴素對T。代種子進行篩選，經4小時浸泡後置於平皿中25 〃 C黑暗中萌發48小時，結果如表2所示，小麥金花、小麥京411和小麥4071的表達率分別為61 . 3 64 . 3 %和65 . 8 %。7、T，代報告基因表達的檢測經卡那黴素篩選後萌發的種子轉移到以侄石位為基質的花盆中，在25 「 C、60 %相對溼度、16 / 8小時光周期的培養室中培養。待長出第三片葉時，取第一片葉按照步驟4的(1 )中的方法檢測報告基因的表達，報告基因表達陽性率佔所測植株的81 % ( 22 / 27 λ
權利要求
1.一種培育轉基因小麥的方法，其特徵在於所述生長點為根尖生長點或莖尖生長點ο
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述遺傳轉化的外植體為小麥種子23 一 27 〃 C萌發48 — 72小時得到的莖尖生長點。
全文摘要
一種培育轉基因小麥的方法,重點在生長點為根尖生長點或莖尖生長點。所述遺傳轉化的外植體為小麥種子23一27"C萌發48一72小時得到的莖尖生長點。
文檔編號C12N15/82GK102517323SQ201110426780
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月19日 優先權日2011年12月19日
發明者弓貴明 申請人:弓貴明