一種新的轉基因米麴黴檢測試劑盒及其檢測方法

2023-12-10 04:05:51 2

一種新的轉基因米麴黴檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明名為「一種新的轉基因米麴黴檢測試劑盒及其檢測方法」，涉及轉基因微生物檢測【技術領域】，本發明通過設計針對轉基因米麴黴特異序列的帶標記的引物和探針，結合應用PCR擴增和核酸試紙條檢測技術，實現了轉基因米麴黴的準確、高效快速檢測。該方法特異性強，靈敏度高和穩定性好，對於提高轉基因米麴黴檢測的準確性、縮短檢測時間具有重要的作用。本檢測試劑盒使用方便快捷，原理和操作簡單，可應用於快速檢測轉基因米麴黴。
【專利說明】一種新的轉基因米麴黴檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及轉基因微生物檢測【技術領域】，提供了一種利用PCR擴增和核酸試紙條技術相結合的快速檢測轉基因米麴黴的試劑盒，適用於轉基因米麴黴的快速檢測。
【背景技術】
[0002]米麴黴(Aspergillus oryzae),屬於半知菌亞門，絲孢綱,絲孢目，叢梗孢科，麴黴屬，是真菌中的一個常見種。分布廣，主要在糧食、發酵食品、腐敗有機物和土壤等處。是我國傳統釀造食品醬和醬油的生產菌種。也可生產澱粉酶、蛋白酶、果膠酶和曲酸等，是一種非常重要的工業用菌種。
[0003]目前酶製劑產品中的轉基因微生物檢測的技術還是主要依靠傳統分離培養的形態學檢測方法，檢測靈敏度低，通常需要幾天時間。近些年來，隨著分子生物學和生物技術的快速發展，PCR技術成了快速檢測的常用手段。但是擴增產物需要凝膠電泳，紫外凝膠成像，步驟多，耗時長，而且存在EB染色劑汙染的問題。
[0004]本研究通過巧妙地設計針對轉基因米麴黴的帶標記的特異性引物和探針，應用 PCR擴增和核酸試紙條檢測技術，實現了轉基因米麴黴的高效快速檢測。該方法特異性強， 靈敏度高、穩定性好，可以廣泛應用於轉基因米麴黴的準確快速檢測。

【發明內容】
[0005]本發明需要解決的技術問題是提供用於檢測轉基因米麴黴的兩套特異性引物和探針。[0006]本發明需要解決的另一問題是提供包含上述引物的核酸試紙條檢測試劑盒。[0007]本發明用於檢測轉基因米麴黴的兩套PCR引物及探針序列為:[0008]上遊引物 1:PyrG-F-bio:5』 biotin-AGCGCACGCGCTAGCCGT-3』[0009]下遊引物 I =PyrG-R:5』 -GTGGGTCCTGCTACCTTTCC-3』[0010]探針 1:PyrG-P-fitc:5`』 fitc-CTTGGAACGCATGAGTCTA-3』[0011]上遊引物 2:Npl-F-bio:5』 biotin-GTAACCCAAGAGAATGCC-3』[0012]下遊引物 2:Np1-R:5』 -AGTACCAGAGAAGCTCCA-3』[0013]探針 2:Npl-P-fitc:5』 fitc-AGACTCCTGCAATATCCGA-3』[0014]本發明的轉基因米麴黴檢測試劑盒，包括以下成分:[0015](I)轉基因米麴黴DNA模板和陰性對照野生型米麴黴模板[0016](2)轉基因米麴黴帶標記的上、下遊引物和探針[0017]上遊引物 1:PyrG-F-bio:5』 biotin-AGCGCACGCGCTAGCCGT-3?[0018]下遊引物 I =PyrG-R:5』 -GTGGGTCCTGCTACCTTTCC-3』[0019]探針 1:PyrG-P-fitc:5』 fitc-CTTGGAACGCATGAGTCTA-3?[0020]上遊引物 2:Npl-F-bio:5』 biotin-GTAACCCAAGAGAATGCC-3?[0021]下遊引物 2:Np1-R:5』 -AGTACCAGAGAAGCTCCA-3』[0022]探針2:Npl-P-fitc:5』 fitc-AGACTCCTGCAATATCCGA-3J
[0023](3) IOXTaq PCR Buffer, DDH2O, 2.5mM dNTP，5U / μ I Taq 酶
[0024]分別用上述方法對待測樣品DNA進行PCR擴增，PCR產物用試紙條檢測，兩套引物探針的檢測結果顯示控制線正常，檢測線呈現陽性，則說明該樣品含有轉基因米麴黴，若至少有一套引物、探針檢測結果呈現陰性，則說明該樣品中不含有轉基因米麴黴。
[0025]與現有技術相比，本發明的進步在於:無需瓊脂糖凝膠電泳、紫外凝膠成像，從而避免了溴化乙錠的汙染，而且檢測結果直觀、可視，從PCR擴增到觀察結果只需IOOmin左右，大大優於凝膠電泳成像。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1、圖2轉基因米麴黴試劑盒特異性測試結果，其中圖1為PyrG特異性檢測、圖2為Npl特異性檢測，I為陰性對照，2、3、4、5、6、7為野生型米麴黴，8為轉基因米麴黴，從圖1、圖2可以看出，只有轉基因米麴黴出現特異條帶，使用本試劑盒能準確地檢測出轉基因米麴黴。
【具體實施方式】
[0027]第一套PyrG特異引物、探針設計:
[0028]`
【權利要求】
1.兩套用於轉基因米麴黴檢測的特異性引物和探針，其特徵在於，序列為:
上遊引物 1:PyrG-F-bio:5』 biotin-AGCGCACGCGCTAGCCGT-3』
下遊引物 I =PyrG-R:5』 -GTGGGTCCTGCTACCTTTCC-3』
探針 1:PyrG-P-fitc:5』 fitc-CTTGGAACGCATGAGTCTA-3』
上遊引物 2:Npl-F-bio:5』 biotin—GTAACCCAAGAGAATGCC_3』
下遊引物 2:Npl-R:5』 -AGTACCAGAGAAGCTCCA-3』
探針 2:Npl-P-fitc:5』 fitc-AGACTCCTGCAATATCCGA-3』。
2.一種用於檢測轉基因米麴黴的試劑盒其特徵在於，包括如下成分: (1)陽性對照轉基因米麴黴DNA模板和陰性對照野生型米麴黴DNA模板 (2)轉基因米麴黴PyrG、Npl上下遊特異引物和探針
上遊引物 1:PyrG-F-bio:5』 biotin-AGCGCACGCGCTAGCCGT-3?
下遊引物 I =PyrG-R:5』 -GTGGGTCCTGCTACCTTTCC-3』
探針 1:PyrG-P-fitc:5』 fitc-CTTGGAACGCATGAGTCTA-3?
上遊引物 2:Npl-F-bio:5』 biotin—GTAACCCAAGAGAATGCC_3』
下遊引物 2:Npl-R:5』 -AGTACCAGAGAAGCTCCA-3』
探針 2:Npl-P-fitc:5』 fitc-AGACTCCTGCAATATCCGA-3』
(3)IOXExTaq PCR Buffer, ddH20，2.5mM dNTP,5U/y IExTaq 酶 (4)生物素(biotin)、螢光素(fitc)抗原標記的薄膜層析試紙條。
3.—種轉基因米麴黴的快速檢測方法，包括如下步驟: (1)PCR反應體系:
【文檔編號】C12N15/11GK103497992SQ201310263785
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年6月28日 優先權日:2013年6月28日
【發明者】張裕君, 趙衛東, 劉國紅, 賀豔, 鄭文杰 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心