一種金納米粒子比色法快速檢測奶粉中三聚氰胺含量的方法

2023-12-10 05:14:31 3

專利名稱：一種金納米粒子比色法快速檢測奶粉中三聚氰胺含量的方法
技術領域：
一種金納米粒子比色法快速檢測奶粉中三聚氰胺含量的方法，屬於分析化學技術 領域。
背景技術：
三聚氰胺(Melamine)，俗稱密胺、蛋白精，化學名稱為1，3，5_三嗪_2，4，6-三氨 基，是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，為純白色單斜稜晶體。三聚氰胺是一種用途廣泛的 基本有機化工中間產品，最主要的用途是作為生產三聚氰胺甲醛樹脂(MF)的原料。該樹脂 硬度比脲醛樹脂高，不易燃，耐水、耐熱、有良好的絕緣性能、光澤度和機械強度，廣泛運用 於木材、塑料、塗料、造紙、紡織、皮革、電氣、醫藥等行業。食品工業上通常採用凱氏定氮法，通過測定氮含量來推算蛋白質含量。三聚氰胺
結構式如下 其含氮量為66%，常被不法分子違法添加到食品中，以造成蛋白質含量達標的假象。三聚氰胺具有較強的黏性，進入人體後水解生成三聚氰酸，容易在體內吸附形成 結石的草酸、鞣酸及鈣等物質，並沉積在泌尿系統中。長期攝入三聚氰胺會造成泌尿系統損 害，會損害人體和動物的生殖、泌尿系統，產生腎、膀胱結石。2007年，在美國數千計的貓和狗因攝入含有三聚氰胺和氰尿酸的寵物食品而造成 腎衰竭並死亡；2008年，在中國超過5萬的嬰幼兒因食用含三聚氰胺的奶粉而患腎結石，3 名嬰兒死亡。2008年10月7日，衛生部、工業和信息化部、農業部、工商總局和質檢總局5部門， 聯合發布公告，制定三聚氰胺在乳與乳製品中的臨時管理限量值。公告規定，嬰幼兒配方乳 粉中三聚氰胺的限量值為lmg/kg，高於lmg/kg的產品一律不得銷售。液態奶(包括原料 乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值為2. 5mg/kg,高於2. 5mg/kg的產品一律不得 銷售。含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的限量值為2. 5mg/kg，高於2. 5mg/kg的產品 一律不得銷售。2010年4月22日，衛生部公布66項新乳品安全國家標準，三聚氰胺不再具備「合 法」身份被「限量添加」到乳品製品中去。目前，三聚氰胺的檢測手段主要包括液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質譜法 (GC-MS)、液相色譜-質譜法(LC-MS)、毛細管電泳法等。儘管這些方法靈敏度高，但樣品的前處理步驟較多，相對費時、檢測費用較高，而且需要一定的專業技術，使得不能廣泛應用。 因此需要建立一種快速、簡單、靈敏的方法檢測食品中的三聚氰胺。

發明內容
本發明的目的是提供一種基於金納米粒子自組裝材料和分子識別的比色法，快速、簡單、靈敏的檢測奶粉中的三聚氰胺。本發明的技術方案一種金納米粒子比色法快速檢測奶粉中三聚氰胺含量的方 法，利用金納米粒子自組裝和分子識別的比色方法檢測奶粉中的三聚氰胺含量，表面修飾 冠醚的金納米粒子，加入三聚氰胺後，依靠冠醚與銨根離子的耦合作用，使得金納米粒子發 生自組裝，體系由紅色變為藍色，金納米粒子的特徵吸收峰發生紅移，由此檢測體系中的三 聚氰胺；包括以下步驟金納米粒子AuNPs的製備、冠醚的衍生化、金納米粒子偶聯冠醚、運 用金納米自組裝和分子識別的比色方法檢測三聚氰胺、實際樣品檢測；(1)金納米粒子AuNPs的製備所用的玻璃儀器都經過王水浸泡，雙蒸水清洗，晾乾備用；製備時，向潔淨的三角 燒瓶中加入質量濃度為0. 01 %的氯金酸IOOmL,加熱，煮沸，緊接著加入質量濃度為1 %的 檸檬酸三鈉溶液2. 4mL，邊加熱邊攪拌，溶液顏色從淡黃色變成紅色，反應持續6-8分鐘， 最後，溶液冷卻至室溫，雙蒸水補足到100mL，4°C保藏，所製得的金納米粒子平均粒徑為 20nmo(2)冠醚的衍生化①2-羥甲基-18-冠醚-6-C6_Br的製備稱取0. llg、即4.5mmol浸在礦物油中的氫化鈉(在礦物油中氫化鈉質量含量為 55% -65% )，溶於5mL 二甲亞碸溶液，加入1. 94mmol (0. 57g) 2-羥甲基-18冠醚-6，室溫下 攪拌30分鐘，再加入1.55mL、S卩10. Immol 1，6-二溴己烷，室溫攪拌過夜。向反應溶液中加 入甲醇猝滅，再進行減壓蒸發。殘留液用50mL 二氯甲烷萃取，用50mL水洗三遍，過後用無 水硫酸鎂進行乾燥10h，過濾，得到的溶液經矽膠柱純化，洗脫液為苯/石油醚=1 1。②2-羥甲基-18冠醚-6-C6-SH的製備稱取0. 49g、即1.08mmol溶液①2-羥甲基-18-冠醚-6-C6-Br溶於IOmL乙醇，力口 入0. 4g、即5. 5mmol硫脲充分混合後，加熱回流過夜。用0. 4g、即7mmol氫氧化鉀加入到殘 留液中調節PH，繼續回流2小時，加IM鹽酸酸化。向反應殘留液中加入50mL 二氯甲烷萃 取，50mL水洗三遍，過後用無水硫酸鎂乾燥10小時，過濾。得到的溶液用矽膠柱純化(洗脫 液為苯)。(3)金納米粒子偶聯冠醚取20mL金納米粒子，用0. 2mL、0. 5M氫氧化鈉溶液調節至pH 8。將衍生化的冠醚 ②2-羥甲基-18冠醚-6-C6-SH 2mL溶解於4. 4mL乙醇中，取2滴加入到調節好pH的金納 米粒子溶液中，室溫下攪拌2天，然後lOOOr/min離心15分鐘，去上清，濾餅用超純水稀釋 到原體積，4°C保存備用。(4)利用金納米粒子自組裝和分子識別的比色方法檢測三聚氰胺向偶聯好的金納米粒子溶液中加入不同濃度的三聚氰胺溶液標準品，金表面的冠 醚與銨根離子偶聯，使得分散的金納米粒子聚集，體系由紅色變為藍色。
所用三聚氰胺溶液標準品濃度依次分別為0、0. 5ng/mL、Ing/mL、lOOng/mL、 250ng/mL、350ng/mL、500ng/mL、2000ng/mL、4000ng/mL，添加到組裝的金納米粒子體系中，
並對金納米粒子的特徵表面等離子共振峰進行鑑定，金納米粒子的表面等離子共振峰由 525nm紅移至698nm，且三聚氰胺濃度越高，698nm處峰的吸收值(A698)越大，而525nm處峰 的吸收值(A525)越小，進而A698A525的比值越大，根據A698A525的比值與三聚氰胺的濃度建 立標準曲線。本發明中，三聚氰胺的檢測限為6ng/mL，線性範圍為10_500μ g/mL。(5)實際樣品檢測取不同奶粉進行實際樣品檢測。對實際樣品進行前處理，加入到金納米體系中，檢測奶粉中的三聚氰胺，測定回收率。本發明的有益效果本發明製備了一種金納米粒子的自組裝材料，可簡單、快速、 靈敏的檢測奶粉中的三聚氰胺。為今後的生產、監管提供了方便，可滿足國內對其生產、監
管的需要。


圖1 單分散的金納米粒子電鏡圖。圖2 加入20 μ g三聚氰胺後的金納米粒子電鏡圖。圖3 三聚氰胺的檢測標準曲線圖。表1:樣品添加回收率。
具體實施例方式實施例1(1)金納米粒子的製備所用的玻璃儀器都經過王水浸泡，雙蒸水清洗，晾乾備 用；製備時，向潔淨的三角燒瓶中加入質量濃度為0. 01%的氯金酸IOOmL,加熱，煮沸，緊接 著加入質量濃度為的檸檬酸三鈉溶液2. 4mL，邊加熱邊攪拌，溶液顏色從淡黃色變成紅 色，反應持續6-8分鐘，最後，溶液冷卻至室溫，用雙蒸水補足到100mL，4°C保藏；所製得的 金納米粒子平均粒徑為20nm。(2)冠醚的衍生化①2-羥甲基-18-冠醚-6-C6_Br的製備稱取4.5mmol、0. Ilg氫化鈉(65%-55%礦物油)溶於5mL 二甲亞碸溶液，加入 1.94mmol(0. 57g)2-羥甲基-18冠醚-6，室溫下攪拌30分鐘，再加入1.55mL、10. Immol 1， 6-二溴己烷，室溫下攪拌過夜。向反應溶液中加入甲醇猝滅，再進行減壓蒸發。殘留液用 50mL 二氯甲烷萃取，用50mL水洗三遍，過後用無水硫酸鎂乾燥10小時，過濾，得到的溶液經 矽膠柱純化(洗脫液為苯/石油醚=1 1)。②2-羥甲基-18冠醚-6-C6-SH的製備 稱取0. 49g、l. 08mmol溶液①溶於IOmL乙醇中，與0. 4g、5. 5mmol硫脲充分混合 後，加熱回流過夜。用0. 4g、7mmol氫氧化鉀加入到殘留液中調節pH，繼續回流2小時，加 IM鹽酸酸化。向反應殘留液中加入50mL 二氯甲烷萃取，50mL水洗三遍，過後用無水硫酸鎂 乾燥10h，過濾。得到的溶液用矽膠柱純化(洗脫液為苯)。(3)金納米粒子偶聯冠醚取20mL金納米粒子，用0. 2mL、0. 5M氫氧化鈉調節至pH8。將衍生化的冠醚②2mL溶解於4. 4mL乙醇中，取2滴加入到調節好pH的金納米粒子溶 液中，室溫下攪拌2天，然後lOOOr/min離心15分鐘，去上清，濾餅用超純水稀釋到原體積， 4°C保存備用。
(4)金納米粒子自組裝和分子識別的比色方法檢測三聚氰胺向偶聯好的金納米 粒子溶液中加入不同濃度的三聚氰胺溶液標準品，金表面的冠醚與銨根離子偶聯，使得分 散的金納米粒子聚集，體系由紅色變為藍色。本專利所使用標準品濃度依次為0、0.5ng/ mL、Ing/mL、100ng/mL、250ng/mL、350ng/mL、500ng/mL、2000ng/mL、4000ng/mL，添加到組裝 的金納米粒子體系中，並對金納米粒子的特徵表面等離子共振峰進行鑑定。可見金納米粒 子的表面等離子共振峰由525nm紅移至698nm，且三聚氰胺濃度越高，698nm處峰的吸收值 (A698)越大，而525nm處峰的吸收值(A525)越小，進而A698ZA525的比值越大，根據A698ZA525的 比值與三聚氰胺的濃度建立標準曲線。本實驗，三聚氰胺的檢測限為6ng/mL，線性範圍為 10-500ng/mLo(5)實際樣品檢測對實際樣品進行前處理，具體操作如下將待測奶粉IOmg用超 純水配成200 μ L溶液，向樣品中加入不同濃度的三聚氰胺標樣，再加入61mM的三氯乙酸和 乙腈。用超聲充分震蕩後，lOOOOr/min離心lOmin，過濾去除上清液後，用三氯乙酸稀釋到 原體積。上述溶液與去離子水體積比1 1混合，再用陽離子交換柱進行純化，將得到的純 化後樣品以1 2體積比加入到金納米粒子自組裝體系中，利用金納米粒子的顏色變化體 系由紅色變為藍色檢測奶粉中的三聚氰胺，測定樣品回收率。表1樣品添加回收率
權利要求
一種金納米粒子比色法快速檢測奶粉中三聚氰胺含量的方法，其特徵在於利用金納米粒子自組裝和分子識別的比色方法檢測奶粉中的三聚氰胺含量，表面修飾冠醚的金納米粒子，加入三聚氰胺後，依靠冠醚與銨根離子的耦合作用，使得金納米粒子發生自組裝，體系由紅色變為藍色，金納米粒子的特徵吸收峰發生紅移，由此檢測體系中的三聚氰胺；包括以下步驟金納米粒子AuNPs的製備、冠醚的衍生化、金納米粒子偶聯冠醚、運用金納米自組裝和分子識別的比色方法檢測三聚氰胺、和實際樣品檢測；(1)金納米粒子AuNPs的製備所用的玻璃儀器都經過王水浸泡，雙蒸水清洗，晾乾備用；製備時，向潔淨的三角燒瓶中加入質量濃度為0.01％的氯金酸100mL，加熱，煮沸，緊接著加入質量濃度為1％的檸檬酸三鈉溶液2.4mL，邊加熱邊攪拌，溶液顏色從淡黃色變成紅色，反應持續6-8分鐘，然後，溶液冷卻至室溫，雙蒸水補足到100mL，4℃保藏，所製得的金納米粒子平均粒徑為20nm；(2)冠醚的衍生化①2-羥甲基-18-冠醚-6-C6-Br的製備稱取0.11g、即4.5mmol浸在礦物油中的氫化鈉，溶於5mL二甲亞碸溶液中，加入0.57g、即1.94mmol的2-羥甲基-18冠醚-6，室溫下攪拌30分鐘，再加入1.55mL、即10.1mmol的1，6-二溴己烷，室溫下攪拌過夜，向反應溶液中加入甲醇猝滅，再進行減壓蒸發，殘留液用50mL二氯甲烷萃取，用50mL水洗三遍，過後用無水硫酸鎂進行乾燥10小時，過濾，得到的溶液經矽膠柱純化，洗脫液為苯/石油醚體積比1∶1；②2-羥甲基-18冠醚-6-C6-SH的製備稱取0.49g、即1.08mmol溶液①2-羥甲基-18-冠醚-6-C6-Br溶於10mL乙醇中，與0.4g、即5.5mmol硫脲充分混合後，加熱回流過夜；用0.4g、即7mmol氫氧化鉀加入到殘留液中調節pH，繼續回流2小時，加1M鹽酸酸化；向反應殘留液中加入50mL二氯甲烷萃取，50mL水洗三遍，過後用無水硫酸鎂乾燥10小時，過濾；得到的溶液用矽膠柱純化，洗脫液為苯；(3)金納米粒子偶聯冠醚取20mL金納米粒子，用0.5M氫氧化鈉溶液調節至pH 8；將衍生化的冠醚②2-羥甲基-18冠醚-6-C6-SH 2mL溶解於4.4mL乙醇中，取2滴加入到調節好pH的金納米粒子溶液中，室溫下攪拌2天，然後1000r/min離心15分鐘，去上清，濾餅用超純水稀釋到原體積，4℃保存備用；(4)利用金納米粒子自組裝和分子識別的比色方法檢測三聚氰胺向偶聯好的金納米粒子溶液中加入不同濃度的三聚氰胺溶液標準品，金表面的冠醚與銨根離子偶聯，使得分散的金納米粒子聚集，體系由紅色變為藍色；根據A698/A525的比值與三聚氰胺的濃度建立標準曲線，三聚氰胺的檢測限為6ng/mL，線性範圍為10-500ng/mL；(5)實際樣品檢測取不同奶粉進行實際樣品檢測。
全文摘要
一種金納米粒子比色法快速檢測奶粉中三聚氰胺含量的方法，屬於分析化學技術領域。本發明包括金納米粒子(AuNPs)的製備、冠醚的衍生化、金納米粒子偶聯冠醚、運用金納米粒子自組裝和分子識別檢測三聚氰胺；實際樣品檢測等步驟。本發明製備了一種金納米粒子的自組裝材料，根據金納米粒子體系的顏色變化，可簡單、快速、靈敏的檢測奶粉中的三聚氰胺含量，並且大大提高了檢測的靈敏度，達到了高通量的目的，為以後的研究、生產、監管等提供了方便。
文檔編號G01N21/78GK101846631SQ201010196970
公開日2010年9月29日 申請日期2010年6月4日 優先權日2010年6月4日
發明者嚴文靜, 徐麗廣, 朱穎越, 胥傳來, 陳偉 申請人:江南大學