用於原發性肝癌基因治療的腺病毒載體及使用方法

2023-12-10 04:30:06 1

專利名稱：：用於原發性肝癌基因治療的腺病毒載體及使用方法
技術領域：
：本發明涉及腫瘤的基因治療及病毒治療領域，具體涉及到，通過腫瘤特異性啟動子調控腺病毒載體在特定條件下進行病毒複製和外源插入基因表達的技術，即利用甲胎蛋白啟動子調控腺病毒載體，在表達甲胎蛋白的原發肝癌細胞中特異性地進行病毒複製和外源插入基因表達，從而在表達甲胎蛋白的肝癌細胞中，因受甲胎蛋白啟動子控制而特異性地進行病毒複製和外源插入基因表達，從而殺死肝癌細胞的技術。
背景技術：
：惡性腫瘤嚴重威脅人類健康，是僅次於心血管疾病的人類第二號「殺手」，傳統的腫瘤治療方法有相當的局限性，例如，放、化療殺死腫瘤細胞的同時，對腫瘤患者身體的毒副作用極強。近年來分子生物學以及其它學科的發展，人們對各種基因的功能及其與疾病之間的關係逐漸了解，腫瘤的生物治療迅速發展，其中主要包括腫瘤免疫治療和基因治療等方面，前者包括抗癌效應細胞的激活、細胞因子的誘發、抗癌抗體(即導向治療)的篩選、新型疫苗的研製等方法，後者包括病毒載體和非病毒載體的治療等方法。以病毒為載體的惡性腫瘤的基因治療，載體可以高效地、特異性地進入腫瘤細胞，並表達所攜帶的治療用外源基因，或特異性地在腫瘤細胞中複製、繁殖，進而殺死腫瘤細胞。目前常見的基因治療病毒載體有逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體和腺相關病毒載體，其中研究的最多的是腺病毒載體。人的腺病毒根據顆粒表面表位的不同分為50個血清型，分別歸A-F6個亞屬。每個亞屬的成員之間可相互交換遺傳物質，但在不同的亞屬之間不能相互重組。人5型腺病毒屬人腺病毒C亞屬。腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，其基因組長度約為36kb，分早期轉錄區(E區)和晚期轉錄區(L區)，早期轉錄區詳細可分為6個獨立的區域E1A、E1B、E2(E2A和E2B)、E3、E4。刪除了E1區和E3區的腺病毒載體，通常被稱為第一代腺病毒載體，這種載體可插入並表達長度不超過8kb的外源基因，這種腺病毒載體本身不能複製產生子代病毒，並具有下列特點可感染多種類型細胞，包括靜止期不分裂的細胞；基因組不與宿主細胞的基因組發生隨機整合，較為安全；易於大規模生產，可獲得較高滴度的病毒。無論何種基因治療載體，如何改進並提高其在腫瘤細胞中的特異性，是該載體能否安全應用於臨床的關鍵。為達到此目的，人們通過基因工程方法，不斷改造腺病毒載體或者使改造後的病毒能在腫瘤細胞中特異性複製增殖，而在正常細胞內不能複製增殖，成為一種所謂溶瘤性病毒，如Onyx公司的Onyx-015病毒，特異殺傷p53基因突變的腫瘤細胞；或者，通過改造腺病毒基因組本身(LieberAetal.)，通過腺病毒纖毛結構的修飾(CurielD、etal.)，以及通過使用外源腫瘤特異性啟動子控制重組腺病毒的複製(YuDCetal.)，實現腫瘤特異性載體的目的，如Calydon公司的CN706病毒，通過前列腺腫瘤特異性啟動子SPA的作用，特異殺傷前列腺癌細胞。原發肝癌細胞與正常肝癌細胞的一個重要區別是，超過70％的原發肝癌細胞表達甲胎蛋白，而正常肝細胞則不表達，只有胚胎肝細胞中有甲胎蛋白的表達，這是癌細胞幼稚化的一種體現，在臨床診斷中，甲胎蛋白的檢測是原發肝癌診斷的重要手段之一。我們將腺病毒載體基因組中自身啟動子基因刪除，替換成甲胎蛋白啟動子，使重組後的受控於甲胎蛋白啟動子的腺病毒載體，只能在表達甲胎蛋白的情況下，因啟動子被激活而進行複製和表達，在正常的肝細胞中，因沒有甲胎蛋白的存在，腺病毒載體不能複製和表達，由此達到了對肝細胞選擇性殺傷的目的。應用甲胎蛋白啟動子控制腺病毒產生肝癌組織特異性，是常見的抗肝癌腫瘤基因治療研究方法。但由於甲胎蛋白啟動子結構複雜，不同部位作用不同，具有不同功能，使得人們對甲胎蛋白啟動子的肝癌特異性產生很大置疑。我們對常用的甲胎蛋白啟動子進行了改進，使用一種具有特殊結構的甲胎蛋白啟動子，它含有增強子(Enhancer)、沉默子(Silencer)及啟動子核心區(Corepromoter)等全部功能元件。此外，為了增強該啟動子的特異性，我們在重組腺病毒載體的基因組中甲胎蛋白啟動子基因序列的上遊插入了特殊的基因調控元件——隔離子(Insulator)，使其達到了很高的特異性。作為腫瘤基因治療的載體，一方面要求具有腫瘤特異性；另一方面，應具有抗腫瘤特性，即在腫瘤特異性啟動子控制條件下，將所攜帶的相關的抗腫瘤基因，在腫瘤細胞內特異性表達，從而有效地殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞沒有殺傷作用。在此，我們將Ad5型腺病毒的E1a基因和腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TNF-relatedapoptosis-inducingligand，簡稱TRAIL)基因通過基因工程手段，與腺病毒基因組進行基因重組，可以實現上述目標。人類腺病毒5型E1a基因，位於腺病毒線性雙鏈DNA基因組的左端，具有84％的保守性。該基因產生兩種主要的mRNA，大小分別為13S和12S，分別編碼289和243個胺基酸的兩個蛋白，這兩個蛋白通過激活病毒基因的表達，促使病毒的複製(ShenkT，1996)。這兩個蛋白是腺病毒最初表達的蛋白，具有激活腺病毒其它基因，特別是E2區和E4區基因的功能，是腺病毒複製的關鍵。E1a基因編碼的蛋白有3個轉化必須的區域非保守胺基酸末端(aa2-24)；保守區1(CR1；aa40-80)；保守區2(CR2；aa120-140)。E1a基因編碼的蛋白的不同功能區域與細胞內的兩類蛋白結合，從而使E1a編碼的蛋白活化，發揮其功能轉錄協同激活劑p300/CBP家族，與E1a基因的蛋白N末端和CR1結合，Rb家族與CR1和CR2結合，這些反應從功能上影響不同的生長調節途徑，從而促進分化。雖然細胞實驗表明，E1a在E1b和ras基因產物的協同作用下，可以使正常的胚胎成纖維細胞系惡性轉化，接種於裸鼠時成瘤(YuDHungMC，1998)，但E1a基因本身不能使細胞系惡性轉化(ChangJYetal.，1996)，迄今為止，沒有證據表明E1a基因是致癌基因，相反，近年來發現E1a是具有抑癌作用的基因，它可以通過多種途徑抑制腫瘤的形成和轉移。E1a基因對腫瘤的抑制是通過以下幾個方面實現的1.通過依賴p53的機制抑制腫瘤。當細胞DNA損傷時，p53基因可誘導細胞進入G1期，抑制細胞增殖直到DNA損傷得到修復，如果損傷的DNA得不到修復，p53能活化誘導細胞凋亡的基因使細胞發生凋亡。而E1a基因可以維持p53野生型構象，使p53蛋白處於較高的水平。這可能是E1a基因蛋白與細胞內P300蛋白結合的結果。2.通過非依賴p53的機制抑制腫瘤，可能與細胞內一些基因的激活或失活有關，從而促進細胞的凋亡，目前機制尚不清楚(RicardoSPetal.，1996)。3.E1a基因通過調節腫瘤細胞的免疫反應抑制腫瘤。E1a基因能明顯增加NIH3T3細胞對TNF細胞毒性的敏感性，通過NK細胞和激活巨噬細胞影響靶細胞對非依賴TNF溶細胞機制的易感性(ChenMJetal.，1987)。4.E1a基因可通過將腫瘤細胞轉變為上皮細胞表型，抑制不同人類腫瘤細胞的惡性行為(YuDHungMC，1998)。5.E1a基因通過抑制蛋白酶基因表達抑制腫瘤侵襲，如IV型膠原酶、纖溶酶原激活劑、間質膠原酶、尿激酶及溶基質素等(YuDHungMC，1998，RicardoSPetal.，1996)。6.E1a基因可通過增強轉移抑制基因nm23的表達抑制轉移(SteegPSetal.，1988)。此外，E1a基因可使腫瘤細胞對放射治療和化學治療的敏感性增加。其作用途徑1.通過阻斷NB-的活性。轉錄因子NB-與腫瘤細胞對放射治療和化學治療的抗拒性有關，射線和一些化學治療藥物能激活NF-κB的活性，使腫瘤細胞對放射治療和化學治療產生抗拒性，而E1a基因可以阻斷NF-κB的活性，從而提高腫瘤細胞對放射治療和化學治療的敏感性(ShaoRPetal.，1997)。2.通過改變細胞內某些基因的活性。如erbB2基因的表達下降，野生型p53水平增加。Ricardo等(RicardoSPetal.，1996)研究表明E1a基因提高腫瘤細胞對放射治療和化學治療的敏感性，不依賴p53的狀態、H-ras和其他腫瘤基因的改變，甚至在HPV-E6基因高表達的癌細胞中，E1a基因的表達可使腫瘤細胞對DNA損傷類藥物和放射線的敏感性提高4～10倍。因此，人們開始廣泛研究E1a基因對腫瘤的抑制作用在用人類卵巢癌細胞株建立的裸鼠瘤模型中，通過局部注射脂質體介導的E1a基因，腫瘤的生長和播散較對照組明顯受到抑制(YuDetal.，1995)；人類氣管內肺癌裸鼠模型中，通過尾靜脈注射脂質體介導的E1a基因，取得了較好的生物治療效果(ChangJYetal.，1996)；脂質體介導E1a基因治療轉移性乳腺癌、上皮性卵巢癌表明腫瘤生長受到抑制(UenoNTetal.，1998)；E1a基因的對頭頸腫瘤的治療於1996年獲FDA批准用於臨床研究，用E1a基因治療7例不可切除和復發的頭頸癌患者，以四組不同的劑量(15、30、60和120μgDNA/cm3腫瘤)進行瘤體注射，未發現明顯的毒性作用；評估的6例患者中，4例腫瘤得到控制，1例部分縮小，1例有較小的改變(YooGHetal.，1998)。E1a不僅靜脈注射在動物模型中取得了較好的治療效果，未見明顯的毒副作用，臨床研究也表現出肯定的療效，通過多種途徑，作用於不同基因，E1a在腫瘤治療中應該具有光明前景。本發明中，我們選用了具有抑制腫瘤作用的E1a基因作為外源治療用插入基因之一的同時，選用了近來較為引人注目的細胞凋亡相關基因作為另外一個外源治療用插入基因，二者有機結合的目的在於，提高腫瘤治療效果。凋亡是細胞自殺的過程，它使多細胞生物在組織中控制一定細胞數並消除個別威脅生物生存的細胞。細胞在嚴重DNA損傷後凋亡啟動失敗而導致惡性腫瘤的發生(EvanGetal.，1998)。某些細胞表面具獨特傳感器，被稱為死亡受體，它能探測細胞外的死亡信號(凋亡激活因子)，並能迅速啟動細胞的內在凋亡過程(AshkenaziAetDixitVM，1998)，近期研究發現了一種凋亡激活因子-TRAIL(TNF-relatedapoptosis-inducingligand)蛋白，是一II型膜蛋白。真核表達的全長膜蛋白TRAIL和pmol可溶性TRAIL能迅速誘導多種腫瘤細胞凋亡(WileySRetal.，1995；PittiRMetal.，1996)。TRAIL在許多組織有表達，其受體均不與其他細胞毒配體如TNF-α結合(AshkenaziAetDixitVM，1998)。正常和腫瘤組織均表達TRAIL的DR5、DR4受體，並介導TRAIL的凋亡作用(PanGetal.，1997)，而TRAIL的DcR1和DcR2受體，在正常組織(含肝組織)中高表達，在胚胎(含胎肝)及腫瘤組織中低表達。尤為重要的是，DcR1和DcR2受體不能傳遞死亡信號，為具保護性作用的「誘餌」受體，使得正常細胞免於被殺傷。轉染實驗已證實這一保護性作用(SheridanJPetal.，1997；PanGetal.，1997)。根據TRAIL及其多種受體的表達推測，正常組織對其誘導凋亡作用不敏感(LarsEFetal.，2000)，同時，TRAIL殺傷瘤細胞與其家族其它因子一樣不依賴於p53，這樣可以更有效地殺傷一些p53發生突變了的細胞(RohnTAetal.，2001)。腫瘤的基因治療，關鍵問題在於對腫瘤細胞的選擇特異性和殺傷有效性兩個方面。本發明通過使用甲胎蛋白啟動子插入病毒載體，控制外源插入基因的表達，具有特異性殺傷肝癌細胞的特徵，同時，外源插入的治療用基因，選用已經進入臨床研究的E1a基因和具有凋亡激活作用的TRAIL基因，通過內部核糖體進入位點IRES基因的調控作用，同時分別表達這兩種基因編碼的蛋白，增強了對腫瘤細胞殺傷作用的有效性。即，將5型腺病毒的E1區啟動子刪除，代之以甲胎蛋白啟動子，研究甲胎蛋白啟動子及隔離子的腫瘤特異性，並在它們基因序列的下遊連接E1a和TRAIL，得到Ad.HS4.AFP.E1a/TRAIL重組腺病毒載體構建。研究表明，該重組腺病毒載體，具有在原發肝癌細胞中因甲胎蛋白的表達而特異性調控了甲胎蛋白啟動子進行腺病毒複製的特點，使得該啟動子控制下的兩種不同治療用基因得以表達，有效增強了特定條件下，即原發肝癌細胞中，該病毒載體對腫瘤細胞的殺傷作用。本發明還提供了含有此腫瘤特異性的病毒載體及可用藥用載體共同使用。本發明還提供了此腫瘤特異性的病毒載體在用於腫瘤治療的藥物組合治療用途。本發明還提供了類似的腫瘤特異性的病毒載體在用於腫瘤治療中的用途。本發明還提供了類似的腫瘤特異性的病毒載體在用於腫瘤治療中與其它藥物和/或可用藥用載體的組合治療用途。圖1.重組腺病毒Ad.HS4.AFP.E1a/TRAIL結構示意圖。其中，HS4為雞的β-球蛋白隔離子基因，AFP為甲胎蛋白啟動子基因，分別由2個增強子、6-8個沉默子及啟動子核心區基因構成，E1a是5型腺病毒早期基因E1a區基因，IRES為內部核糖體進入位點基因，TRAIL為腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體，ΔE3表示5型腺病毒早期基因E3區基因刪除。圖2.通過活細胞比色檢測試驗研究感染係數MOI為100(TCID50)時，AFP陰性/陽性細胞中細胞毒特異性。HepG2，Hep3B，SMMC-7721，BEL-7404分別為肝癌細胞系，L-02為人的正常肝細胞，LS174T為人結腸癌細胞，Hek293為人胚腎細胞。上述細胞在96孔板中培養至每孔104個細胞時，分別加入AdHS4.AFP.E1a/TRAIL，dl1520，或培養液作為對照，6天後，進行MTS法檢測490nm吸光值，結果為三次不同試驗重複的結果均值。圖3.不同TCID50感染係數MOI條件下重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL對不同肝癌細胞系的劑量依賴細胞毒性作用。Hep3B，HepG2是AFP高表達細胞系，BEL-7404，SMMC-7721是AFP低表達細胞系，上述細胞在96孔板中培養至每孔104個細胞時，分別用MOI1000，100，10，1的AdHS4.AFP.E1A/TRAIL進行感染，感染後連續6天進行MTS法檢測490nm吸光值，結果為三次不同試驗重複的結果均值。圖4.E1A，TRAIL和Caspase-3表達的RT-PCR分析。BEL-7404，HepG2和L02細胞經MOI為100TCID50的Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL(如圖所示)感染或不感染(作為對照)48h，E1A、TRAIL和Caspase-3轉錄的定量分析，以β-actin為內部對照。圖5.通過Caspase-3酶活性的比色檢測研究TRAIL的凋亡作用。HepG2，Hep3B，SMMC-7721，BEL-7404分別為肝癌細胞系，上述細胞在6孔板中培養至每孔2×106個細胞時，通過低營養培養基培養和蚜腸黴素的阻礙，使得細胞生長趨於同步，然後更換細胞培養液，同時分別進行MOI為100的AdHS4.AFP.E1a/TRAIL，dl1520感染和培養液對照，感染30小時後，收集細胞，裂解細胞，用CaspaceTM檢測比色試劑盒檢測Caspase的活性，經405nm吸光值檢測得到結果，凋亡作用通過縱坐標單位為pmol/mg/min的自由pNA物來表示，結果為二次不同試驗重複的結果均值。圖6.重組腺病毒Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL在BEL-7404移植瘤中的複製能力以及Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL和dl1520E1A表達量的比較。對荷BEL-7404瘤的無胸腺裸小鼠的移植瘤分別進行Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL(1.0×107TCID50/mm3，C和F)，dl1520(1.0×107TCID50/mm3，B和E)，或者PBS(A和D，作為背景對照)注射，連續注射5天。荷瘤鼠在最後一次注射給藥後第7天時被處死進行組織病理分析，腫瘤的薄切片用抗E1A抗體(棕色)染色，再用蘇木精(藍色)對其它部分進行復染。E1A定量分析(G)表明，Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL組和dl1520組與PBS組在統計上明顯差異(p＜0.01，*)，同時，Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL組與定量dl1520組也具有統計意義上的差異。具體切片如圖所示。圖7.重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL在體內荷人肝癌細胞BEL-7404瘤裸鼠中抗腫瘤作用的研究。PBS，AdHS4.AFP.E1a/TRAIL(1.0×107TCID50/mm3)，dl1520(1.0×107TCID50/mm3)，或DDP直接注射到AFP低表達的BEL-7404移植瘤瘤內，注射體積為50μl，連續注射5天，DDP連續注射7天，腫瘤體積通過腫瘤直徑的檢測來計算，每周測量2次，注射日的腫瘤體積設定為100％，與陰性對照PBS組相比，其它3組均值均有顯著抑瘤作用(p＜0.01，AVONA)。Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL組與dl1520組相比，其抑瘤作用亦有顯著差異(p＜0.05，studentttest)。參考文獻1.ParkinDM，MuirCS.CancerIncidenceinFiveContinents.Comparabilityandqualityofdata.IARCSciPubl.1992；(120)45-173.2.MathurinP，RixeO，CarbonellN，BernardB，CluzelP，BellinMF，KhayatD，OpolonP，PoynardT..ReviewarticleOverviewofmedicaltreatmentsinunresectablehepatocellularcarcinoma--animpossiblemeta-analysisAlimentPharmacolTher.1998Feb；12(2)111-26.3.AbelevGI.Alpha-fetoproteininontogenesisanditsassociationwithmalignanttumors.AdvCancerRes1971；14295-358.4.HallenbeckPL，ChangYN，HayC，GolightlyD，StewartD，LinJ，PhippsS，ChiangYL.Anoveltumor-specificreplication-restrictedadenoviralvectorforgenetherapyofhepatocellularcarcinoma.HumGeneTher.1999Jul1；10(10)1721-33.5.WatanebeK.，SaitoA.，andTamaokT.Cell-specificenhanceractivityinafarupstreamregionofthehumana-fetoproteingene.J.Biol.Chem.，2624812-4818，19876.NakabayashiH，HashimotoT，MiyaoY，TjongKK，ChanJ，andTamaokiT.Aposition-dependentsilencerplaysamajorroleinrepressinga-fetoproteinexpressioninhumanhepatoma.Mol.Cell.Biol.，115885-5893，1991.7.IdoA，NakataK，KatoY，NakaoK，MurataK，FujitaM，IshiiN，TamaokiT，ShikuH，andNagatakiS.Genetherapyforhepatomacellsusingaretrovirusvectorcarryingherpessimplexvirusthymidinekinasegenneunderthecontrolofhumana-fetoproteingenepromoter.CancerRes.，553105-3109，1995.8.SteinwaerderDS，LieberA.Insulationfromviraltranscriptionalregulatoryelementsimprovesinducibletransgeneexpressionfromadenovirusvectorsinvitroandinvivo.GeneTher.2000Apr；7(7)556-67.9.IdoA，UtoH，MoriuchiA，NagataK，OnagaY，OnagaM，HoriT，HironoS，HayashiK，TamaokiT，TsubouchiH.Genetherapytargetingforhepatocellularcarcinomaselectiveandenhancedsuicidegeneexpressionregulatedbyahypoxia-inducibleenhancerlinkedtoahumanalpha-fetoproteinpromoter.CancerRes.2001Apr1；61(7)3016-2110.YeX，LiangM，Mengx，RenXW，ChenHZ，LiZY，NiSH，AndreLieber，HuF.Insulationfromviraltranscriptionalregulatoryelementsenablesimprovementtohepatomaspeci.cgeneexpressionfromadenovirusvectors.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications307(2003)759-76411.TakahashiM，SatoT，SagawaT，LuY，SatoY，IyamaS，YamadaY，FukauraJ，TakahashiS，MiyanishiK，YamashitaT，SasakiK，KogawaK，HamadaH，KatoJ，NiitsuY.E1B-55K-deletedadenovirusexpressingE1A-13SbyAFP-enhancer/promoteriscapableofhighlyspecificreplicationinAFP-expressinghepatocellularcarcinomaanderadicationofestablishedtumor.MolTher.2002May；5(5Pt1)627-34.12.KimK，FisherMJ，XuSQ，el-DeiryWS.MoleculardeterminantsofresponsetoTRAILinkillingofnormalandcancercells.ClinCancerRes.2000Feb；6(2)335-46.13.MiuraM，FriedlanderRM，YuanJ.Tumornecrosisfactor-inducedapoptosisismediatedbyaCrmA-sensitivecelldeathpathway.ProcNatlAcadSciUSA.1995Aug29；92(18)8318-22.14.ScaffidiC，FuldaS，SrinivasanA，FriesenC，LiF，TomaselliKJ，DebatinKM，KrammerPH，PeterME.TwoCD95(APO-1/Fas)signalingpathways.EMBOJ.1998Mar16；17(6)1675-87.15.PanG，O′RourkeK，ChinnaiyanAM，GentzR，EbnerR，NiJ，DixitVM.ThereceptorforthecytotoxicligandTRAIL.Science.1997Apr4；276(5309)111-3.16.WalczakH，Degli-EspostiMA，JohnsonRS，SmolakPJ，WaughJY，BoianiN，TimourMS，GerhartMJ，SchooleyKA，SmithCA，GoodwinRG，RauchCT.TRAIL-R2anovelapoptosis-mediatingreceptorforTRAIL.EMBOJ.1997Sep1；16(17)5386-97.17.Degli-EspostiMA，SmolakPJ，WalczakH，WaughJ，HuangCP，DuBoseRF，Go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發明內容本發明中所構建的重組腺病毒載體是經過改造的5型腺病毒。5型腺病毒的基因組含35935個核苷酸，是目前研究的最為清楚的一種病毒，流行病學上主要引起人的呼吸道感染，並具有明顯自愈性的病毒。腺病毒作為疫苗應用於人體已有幾十年的歷史，從未發現有轉化人正常細胞及致癌現象發生。本發明所構建的重組腺病毒載體AdHS4.AFP.E1a/TRAIL如圖1中所示，腺病毒載體自身的E1a啟動子區被刪除，取而代之的是甲胎蛋白啟動子(AFPPromoter)，並在其上遊插入隔離子(Insulator)，是一段雞的β-球蛋白基因序列HS4，用於控制和加強整個重組腺病毒載體的特異性複製和相關基因的特異性表達。甲胎蛋白啟動子的下遊是腺病毒早期基因E1a基因，以及通過內部核糖體進入位點(internalribosomeentrysite，IRES)基因連接的腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體TRAIL基因，E1a基因和TRAIL基因在特異性甲胎蛋白啟動子控制下，經IRES的調控作用，分別同時進行表達，增強了對肝癌細胞的有效殺傷作用。本發明所構建的重組腺病毒載體AdHS4.AFP.E1a/TRAIL已於2003年9月9日提交中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號是V2003010。甲胎蛋白啟動子結構複雜，序列長達8kb。使用不同部分，其肝癌特異性有很大差別。本發明採用基因工程方法，對人甲胎蛋白啟動子結構進行優化，具體而言，即採用2次重複的增強子(Enhancer)，6次重複的沉默子(Silencer)，及甲胎蛋白啟動子核心區(Corepromoter)，共同組成一個全新的，高效的，將5型腺病毒基因組置於該啟動子控制之下，並結合隔離子等調控元件，組成一個特異性在肝癌細胞中複製表達的重組腺病毒。本發明的優點本發明具有殺傷腫瘤特異性強和有效性高的優點。特異性方面本發明中首先選擇使用甲胎蛋白AFP啟動子，使重組腺病毒載體所攜帶的外源插入基因在能夠表達甲胎蛋白的原發性肝癌細胞中進行複製和表達，並且，所使用的甲胎蛋白啟動子是經過研究和改進後的重組的甲胎蛋白啟動子，從其性能上講，其腫瘤特異性較其它文獻報導的強，同時，其啟動功能上有一點優化。在此基礎上，在啟動子上遊插入隔離子，進一步增強了該啟動子的特異性。這裡選擇的是雞的β-球蛋白基因序列HS4，其它類似的隔離子，均可用於增強啟動子特異性的隔離子使用，由此使得腺病毒載體在腫瘤細胞中的複製和表達特異性增強。有效性方面本方面中首先選擇已經進入臨床研究的並已被證明具有有效抑瘤作用的腺病毒早期基因E1a基因作為治療用基因進行表達，同時，在內部核糖體進入位點IRES基因的特殊重要調控作用下，即可應用同一個轉錄單位的情況下，同時分別表達兩種不同基因編碼的蛋白，選擇與細胞凋亡激活相關的TRAIL，加強對腫瘤細胞的殺傷作用。凋亡是細胞自殺的過程，它使多細胞生物在組織中控制一定細胞數並消除個別威脅生物生存的細胞。細胞在嚴重DNA損傷後凋亡啟動失敗而導致惡性腫瘤的發生。TRAIL，即腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體，是一II型膜蛋白，研究表明，可溶性TRAIL能迅速誘導多種腫瘤細胞凋亡。因此，TRAIL與E1a的共同表達，將增強對腫瘤細胞的殺傷效果。本發明同樣適應不同靶向的腫瘤特異性啟動子，針對不同腫瘤的特異性治療，同時選用不同腫瘤抑瘤基因和/或誘導激活基因、免疫相關基因等共同表達，以增強對腫瘤的有效殺傷作用。定義除非另有不同定義，在此使用的所有技術和科學術語的含義與本發明所屬領域中一般技術人員通常所理解的一樣。儘管任何與此描述的相似或相同的任何方法和材料都可用於本發明的實施或試驗。在此僅對優選的方法和材料予以描述。為此本發明就以下術語予以定義在此使用的「隔離子」這一術語，是指編碼任何具有與雞的β-球蛋白隔離子基因序列，即HS4，同樣增強啟動子特異性功能的外源基因序列。在此使用的「外源基因」這一術語，是指插入本發明中所用腺病毒載體中的編碼任何感興趣的、有生物功能的蛋白的基因序列，該插入外源基因所編碼的蛋白，可以具有藥用或其它特徵。所插入的外源基因的長度的上限取決於腺病毒載體的包裝限度。外源基因可通過常規方法，即合成、由天然來源提取、基因克隆等方法製備得到。在此使用的「肝癌特異性基因表達」和「肝癌特異性」這兩個術語，是指腺病毒載體在原發肝癌細胞中的複製和表達。雖然此載體在正常細胞中也會有表達，但表達水平很低，使得載體複製和包裝無法有效進行，以至於可以將這樣低的複製包裝水平忽略不計。在此使用的「第一代腺病毒載體」或「第一代重組腺病毒載體」這一術語，是指刪除了早期基因E1區和E3區的腺病毒載體，該類腺病毒載體不能複製。具體實施例方式實施例I重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL的構建以下描述的重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL，是帶有甲胎蛋白啟動子的5型腺病毒載體，並且，在該啟動子上遊具有HS4隔離子基因，啟動子下遊攜帶外源插入基因為抑瘤作用相關的腺病毒早期E1a基因和細胞凋亡激活相關的腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體TRAIL基因，且二者通過內部核糖體進入位點IRES連接，共同使用同一轉錄單位，分別進行表達。除非另外說明，本發明所採用的技術，均是本領域常規技術，如分子克隆技術、微生物學技術、細胞生物學技術，這些技術在文獻中均有充分解釋。如Sambrook等的《分子克隆實驗室手冊》第二版(1989)等。質粒載體的構建人的甲胎蛋白啟動子基因序列來源於質粒pXZAFP(KanekoSetal.，1995)，人的腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體hTRAIL基因序列來源於質粒pORF.TRAIL(Invivogen)，內部核糖體進入位點IRES來源於質粒pIRES2-EGFP(ClonetechLabotorary)，雞的β-球蛋白隔離子基因HS4來源於質粒pSLJCa(SteinwaerderDSandLieberA，2000)，腺病毒早期基因E1a基因序列來源於質粒pFG140(Microbix)的PCR產物，其擴增引物為5』-GGGACTGAAAATGAGAC-3』和5』-CGCCATGCAAGTTAAACA-3』。所有腺病毒構建所用的質粒pShuttle和拯救AdEasyl載體為AdEasyTM腺病毒載體系統試劑盒(Stratagene)，用於細菌轉化的菌株為BJ5183和XL10-gold。將質粒pORF-TRAIL用限制性內切酶SalI和NheI水解，得到TRAIL的DNA片段，經T4聚合酶作用，補平片段末端，插入pShuttle-pA質粒的AflII水解、T4聚合酶補平的DNA片段，得到質粒pShuttle-TRAIL-pA。將質粒pIRES2-EGFP經XhoI和BstXI限制性內切酶水解及T4聚合酶補平處理，連接到質粒pShuttle-TRAIL-pA的BglII酶切、補平位點，得到質粒pShuttle-IRES-TRAIL-pA。將以質粒pFG140為模板經PCR擴增得到的平端E1a基因插入質粒pShuttle-IRES-TRAIL-pA的EcoRVI平端水解位點，得到質粒pShuttle-E1A-IRES-TRAIL-pA。來自於質粒pXZAFP的、帶有增強子、沉默子和核心啟動子區域的AFP啟動子基因，經SalI和AflII水解後，連接到質粒pShuttle-E1A-IRES-TRAIL-pA相應位點，得到質粒pShuttle-AFP-E1A-IRES-TRAIL-pA。然後將來自於質粒pSLJca的XbaI酶切水解位點的HS4基因，經補平後插入質粒pShuttle-AFP-E1A-IRES-TRAIL-pA的XhoI補平位點，得到最終質粒pShuttle-HS4-AFP-E1A-IRES-TRAIL-pA。重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL的構建將質粒pShuttle-HS4-AFP-E1A-IRES-TRAIL-pA經PmeI限制性內切酶的進一步酶切水解線性化，與拯救質粒AdEasy1在大腸桿菌BJ5183中進行同源重組，經分析得到的正確克隆將轉化到大腸桿菌XL10-Gold中進行進一步的擴增和純化。純化所得質粒經PacI酶切線性化後，轉染到人胚腎細胞中，經轉錄、翻譯和包裝，得到重組的腺病毒載體，經進一步的酶切分析鑑定後，將所構建的正確重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL進一步在AE25細胞中擴增，經CsCl梯度離心，透析和滴度標定(TCID50/ml)，分裝儲藏於-80℃(DirkSSetal.，2000)。實施例II重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL在肝癌細胞中的特異性作用研究MTS法檢測重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL對不同腫瘤細胞中的影響為了檢測重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL的腫瘤特異殺傷性，通過使用MTS(Promega)試劑盒檢測活細胞在感染係數MOI為100(TCID50)時，AFP陰性/陽性細胞中該病毒的細胞毒特異性。HepG2，Hep3B，SMMC-7721，BEL-7404分別為肝癌細胞系，L-02為人的正常肝細胞，LS174T為人結腸癌細胞，Hek293為人胚腎細胞。上述細胞在96孔板中接種至每孔104個細胞，24hr後，分別用AdHS4.AFP.E1a/TRAIL，dl1520感染，或培養液作為對照，在不同時間點加入MTS試劑，37℃保溫一小時後，進行490nm吸光值檢測(BIO-RAD)，結果見圖2。MTS法檢測重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL對不同肝癌細胞的劑量依賴特異性影響在不同TCID50感染係數MOI條件下重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL對不同肝癌細胞系的劑量依賴細胞毒性作用。Hep3B，HepG2是AFP高表達細胞系，BEL-7404，SMMC-7721是AFP低表達細胞系，上述細胞在96孔板中培養至每孔104個細胞時，分別用MOI1000，100，10，1的AdHS4.AFP.E1a/TRAIL進行感染，感染後連續6天進行MTS法檢測490nm吸光值，結果見圖3。CaspaceTM法檢測重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL中因TRAIL表達引起的肝癌細胞的凋亡作用研究為了檢測TRAIL編碼的蛋白的活性，分別將肝癌細胞系HepG2，Hep3B，SMMC-7721，BEL-7404接種在6孔板中培養至每孔2×106個細胞時，通過低營養培養基，使得細胞生長趨於同步，0.5％FBSMEM培養12hr，換10％FBSMEM培養液繼續培養9hr，加入Aphidicolin(4ug/ml)培養12hr，更換0.5％FBSMEM培養液培養6hr，然後更換正常細胞培養液，同時分別加入MOI為100的AdHS4.AFP.E1a/TRAIL，dl1520和培養液對照，感染30小時後，收集細胞，裂解細胞(1％NP40，20mMHepes，PH7.4，2mMEDTA，蛋白酶抑制劑混合物(Roche))，4℃離心後其上清進行蛋白含量檢測(PierceBiotechnology)，30-50μg用於CaspaceTM檢測比色試劑盒檢測Caspase的活性，底物為Ac-DEVD-pNA(Promega)，經405nm吸光值檢測得到結果，見圖4，凋亡作用通過縱坐標單位為pmol/mg/min的自由pNA物來表示。實施例III重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL在荷肝癌移植瘤裸鼠中的抗腫瘤作用研究重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL在體內荷人肝癌細胞BEL-7404瘤裸鼠中抗腫瘤作用的研究6周齡的BALB/C裸鼠，接種1×107BEL-7404細胞懸浮液100μl。成瘤後，當移植瘤長至80-200mm3時，進行隨機分組，每組7-12隻裸鼠，PBS，AdHS4.AFP.E1a/TRAIL(1.0×107TCID50/mm3)，dl1520(1.0×107TCID50/mm3)，或DDP直接注射到移植瘤瘤內，注射體積為50μl，連續注射5天，DDP連續注射7天，腫瘤體積通過腫瘤直徑的檢測來計算，每周測量2次，第31天時處死所有荷瘤裸鼠，注射日的腫瘤體積設定為100％，與陰性對照組相比，其它3組均有顯著抑瘤作用，結果見圖5。儘管本發明為了便於明確理解而通過舉例方式在某些方面做了詳細描述，但顯然在權利要求的範圍內進行一定的變化和修飾是可行的。權利要求1.一種重組腺病毒載體，其E1和/或E3區基因，及E1區啟動子刪除，並攜帶可在腫瘤中特異性複製表達的一個或兩個外源插入基因。2.權利要求1中所述腺病毒載體，其病毒基因組的複製與表達由外源啟動子控制。3.權利要求2中所述腺病毒載體，其病毒基因組中外源啟動子序列上遊具有隔離子(insulator)，用以增強外源啟動子的特異性。4.權利要求1中所述攜帶的多種外源插入基因，不同外源插入基因之間由具有重要基因調控作用的腦心肌炎病毒(encephalomyocarditisvirus，ECMV)的內部核糖體進入位點(internalribosomeentrysite，IRES)連接，形成基因雙順反表達結構，使不同基因使用同一單位同時分別進行轉錄並表達。5.權利要求2中所述腺病毒載體，由下列元件組成a)腺病毒左側倒置末端重複序列b)腺病毒包裝序列，位於a)中左側倒置末端重複序列的下遊3』端c)隔離子序列，位於b)中腺病毒包裝序列的下遊3』端d)外源插入啟動子及其調控序列，位於c)中隔離子序列的下遊3』端e)外源插入基因序列一，位於d)中外源插入啟動子及其調控序列的下遊3』端，並受該外源插入啟動子調控f)外源插入內部核糖體進入位點IRES基因序列，位於e)中外源插入基因序列一的下遊3』端，用於控制其下遊外源插入基因序列的同時分別表達g)外源插入基因序列二，位於f)中內部核糖體進入位點的下遊3』端，並受該調控基因控制，與e)中外源插入基因序列一同時分別表達h)外源插入基因序列表達終止位點多聚腺苷序列，位於g)中外源插入基因序列二的下遊3』端i)一個或一個以上腺病毒基因序列，位於上述元件(a至h)基因序列的下遊3』端j)腺病毒右側倒置末端重複序列，位於重組腺病毒基因的3』端6.權利要求2中所述腺病毒載體，其具有的外源啟動子是腫瘤相關的特異性啟動子。7.權利要求2中所述腺病毒載體，其具有的外源啟動子是甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)啟動子序列。8.權利要求2中所述腺病毒載體，其具有的外源甲胎蛋白啟動子序列由增強子(enhancer)序列、沉默子(silencer)序列和啟動子核心區(corepromoter)序列三個元件部分構成。9.權利要求2中所述腺病毒載體，其具有的外源甲胎蛋白啟動子序列中增強子序列重複2次，沉默子序列重複6至8次。10.權利要求4中所述腺病毒載體，其中的隔離子序列是雞的β-球蛋白隔離子基因序列，即HS4，或其它具有相同功能的外源基因序列。11.權利要求4中所述腺病毒載體，其中的某個外源插入基因序列表達一個或多個基因產物。12.權利要求4中所述腺病毒載體，其外源插入基因序列的終止位點是雙向的SV40多聚腺苷序列。13.權利要求4中所述腺病毒載體，其外源插入基因序列的終止位點是雙向的多聚腺苷序列。14.權利要求4中所述腺病毒載體，其腫瘤特異性啟動子控制的外源插入基因產物是可以促進腺病毒載體複製的相關基因及用於直接或間接殺傷腫瘤的相關基因產物，包括a)細胞凋亡相關基因產物，或/和b)細胞裂解基因產物，或/和c)細胞因子基因產物，或/和d)熱休克蛋白類免疫治療相關基因產物，或/和e)前藥基因類基因產物。f)病毒基因。15.權利要求3中所述腺病毒載體，其受外源插入啟動子控制的外源插入基因是腺病毒E1a基因。16.權利要求3中所述腺病毒載體，其受外源插入啟動子控制的外源插入基因是腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TumorNecrosisFactor-RelatedApoptosis-InducingLigand，TRAIL)基因。。17.權利要求3中所述腺病毒載體，其中的外源插入基因是受IRES調控的、可同時分別表達的腺病毒E1a基因和腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TumorNecrosisFactor-RelatedApoptosis-InducingLigand，TRAIL)基因。18.對腫瘤細胞的選擇性殺死，其中包括通過將上述權利要求2-15中任意一種重組腺病毒載體與腫瘤細胞的攜帶細胞群體接觸，即可產生一種被感染的腫瘤細胞的細胞群體。19.殺死腫瘤細胞的藥物組合，將上述權利要求5-16中任意一種重組腺病毒載體與其它可用藥用載體共同使用。20.權利要求17中所述與重組腺病毒載體通過藥物組合殺死腫瘤細胞，包括a)與免疫抑制劑接觸的腫瘤細胞；b)與放射性治療物接觸的腫瘤細胞；或c)與化學治療化合物接觸的腫瘤細胞。21.權利要求5-16中任意一種重組腺病毒載體，用於腫瘤的藥物組合治療用途。全文摘要本發明「用於原發性肝癌基因治療的腺病毒載體及使用方法」，提供了基於溶瘤病毒療法的治療原發性肝癌的方法和組合物。本發明構建了一種基因重組腺病毒，其中含有甲胎蛋白啟動子基因和治療基因。研究表明，該重組病毒可以特異性的殺傷表達甲胎蛋白的原發性肝癌細胞。此基因重組腺病毒可用於原發肝癌的基因治療。文檔編號A61K35/76GK1570122SQ0315089公開日2005年1月26日申請日期2003年9月10日優先權日2003年9月10日發明者梁旻,孟夏,任曉維,胡放申請人:上海三維生物技術有限公司