綠豆過敏原抗體及其製備方法與應用的製作方法
2023-12-09 19:00:06
綠豆過敏原抗體及其製備方法與應用的製作方法
【專利摘要】綠豆過敏源蛋白抗體的製備方法，涉及兔抗綠豆過敏原多克隆抗體和鼠抗綠豆過敏原多克隆抗體的製備及其免疫分析方法的建立等方面。本發明建立的檢測分析方法比其他的分析方法簡便、快速、靈敏、準確。綠豆過敏原分別經大白兔與老鼠免疫、取血、分出抗血清、純化製得抗體。該抗體具有良好的特異性和靈敏度，可用於食品中各類綠豆過敏原的快速免疫檢測，具有良好的應用前景。
【專利說明】綠豆過敏原抗體及其製備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於食品過敏原免疫化學和檢測分析【技術領域】；涉及免疫化學，生物化學及物化測試技術等；特別涉及綠豆過敏原蛋白免疫動物特異性抗體的製備及其免疫分析方
法的建立。
【背景技術】
[0002]食品過敏原非常廣泛，據美國FDA統計，目前已經知道能導致人體出現過敏性反應的食品共有170多種，大致可以分為八類:一、奶(牛奶、山羊奶等)；二、堅果類(杏仁、胡桃、山核桃、榛子、松子、慄子、腰果等)；三、花生；四、豆類及其製品(大豆、豌豆、蠶豆等)；五、麩質的穀類；六、禽蛋類及其製品；七、魚類(包括海水魚、淡水魚)；八、甲殼動物及其製品(蝦、對蝦、螃蟹、大小龍蝦、蛤蜊等)。實際上除此之外，其它許多油料作物，例如芝麻、向日葵籽、棉花籽、雜豆類以及禾本科穀物如蕎麥、燕麥、大麥等都是潛在的食品過敏原。90%的過敏都是由上述食品引起的。
[0003]食品過敏原問題屬於食品安全的範疇。由於其種類多，危害廣，症狀複雜，並且與人民的生活生產活動息息相關，當前已經成為社會關注的熱點，越來越多地被提上國務院的議事日程。在此背景下，食品過敏原的研究將越來越受到國內外專家學者的重視。
[0004]首先，食品過敏原基礎研究薄弱，要加強對食品過敏原的監測評價，就要加強食品過敏原的基礎研究。對食品過敏原的結構進行分析鑑定，建立食品過敏原資料庫，將已得到的過敏原結構錄入資料庫，為以後的研究發展提供基礎。針對敏感人群的過敏反應情況，研究食品過敏原激發人體過敏反應的閾值。研究消除過敏物質中過敏原危害的適當前處理方法。過敏原多具有抗熱及蛋白水解酶，生物活性高及皮試反應陽性的特點。
·[0005]全世界相當多的人口以來自於種子的植物蛋白，所以研究種子蛋白過敏性有著極為重要的意義。其中豆類是人類三大食用作物之一，在農作物中的地位僅次於穀類，而豆類中的綠?蛋白質聞達19.5 % -33.1 %。自古以來中國人民喜愛食用綠?，許多傳統食品都以其為原料。尤其夏天，中國人喜歡食用綠豆湯，因為綠豆具有清熱、祛暑、解毒的功效。由於食用頻繁，增加了敏感人群潛在綠豆過敏原致敏的可能性。
[0006]2007年一名男性患者因食用綠豆湯致過敏性喉頭水腫病，症狀為:口唇發麻，四肢痙癢，無力；隨後胸前也出現同樣症狀，且雙上肢出現對稱性風團樣藥疹等過敏性反應。進入醫院就醫後，患者出現吸氣性呼吸困難、嗆咳、口唇發紫，短暫性尿失禁。經過系列搶救治療、護理後，患者很快恢復正常。觀察24h痊癒。
[0007]過敏性喉頭水腫及休克是人體攝入外界某種抗原物質，通過免疫應答短時間內發生的累及多器官臨床危急症候群，屬於過敏型變態反應。通常突然發生且症狀劇烈，如不及時處理，將會危及生命。這種病症的特點是發生快，消退快；由生理功能紊亂引起臨床症狀明顯，如上述患者出現的過敏性蕁麻疹。
[0008]免疫技術是指利用動物免疫反應的特異性原理來建立的各種檢測分析技術，同時包括建立這些技術的各種製備方法。主要包括用於檢測抗原或抗體的免疫檢測技術，研究機體細胞免疫功能和狀態的細胞學免疫技術，以及用來建立免疫檢測法的免疫製備技術(包括抗原和抗體的製備、抗體純化及標記等技術)。
【發明內容】
[0009]需要解決的問題:
[0010]本發明提供了一種可以有效地檢測綠豆中過敏原的方法，綠豆過敏原免疫動物製備針對綠豆過敏原的特異性抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學反應，從而定性定量地檢測樣本中超微量目標分析物，即可用於樣本測定。其選擇性決定於免疫學反應的特異性，其靈敏度取決於抗體的親合性和標記物的可檢性。因此可以快速準確地分析食品中的綠豆過敏原。該技術研究的關鍵是綠豆過敏原抗體的製備。
[0011]目前，公眾普遍認為雙抗夾心酶聯免疫檢測方法具有簡單、快速、靈敏度高、特異性強，操作簡單，分析容量大、成本低，以及一次檢測樣品量較大的優點，而且不需要貴重儀器，對使用人員的專門技術要求不高，容易普及和推廣。若開發成試劑盒，可廣泛用於現場樣品和大量樣品的快速監測。
[0012]迄今為止，國內外還沒有對食品中綠豆過敏原酶聯免疫檢測方法的報導。本論文將研究建立綠豆致敏蛋白的快速免疫檢測方法從而實現對食品中綠豆致敏蛋白的實時監控，防止潛在的過敏原對敏感人群的健康產生威脅。同時，為健全食品過敏原資料庫作出努力。
[0013]利用純化綠豆過敏原免疫動物，取血清，分離純化得到特異性抗體。
[0014]其中上述人工抗原再經動物免疫，取血，分出抗全血清，純化製得特異性抗體。
[0015]綠豆過敏原特異性抗體的製備方法:
[0016](I)綠豆過敏原兔多抗的製備
[0017]免疫:免疫動物選用雌性大白兔，免疫方法採用皮下和肌肉注射法，初免後進行四次加強免疫，加強免疫分別於初次免疫後2周、4周和6周後免疫三次，此後間隔一個月，第五次免疫完後7-10天時由兔子的耳緣靜脈取血，進行效價檢測；具體做法是:
[0018]初次免疫:取Img上述純化的過敏原蛋白溶於0.9%的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所配製的溶液中，進行動物免疫；
[0019]加強免疫:用0.5mg上述人工抗原溶於0.9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所配製的溶液，進行動物免疫；
[0020]抗體純化:定時監測動物抗體效價，當抗體對一定的包被抗原達到適宜效價時，採集血液，並離心獲得抗血清，使用ProteinA-Sepharose4B免疫層析親利柱對抗血清進行純化，得到純化的兔抗多克隆抗體。
[0021](2)綠豆過敏原鼠多抗
[0022]免疫:免疫動物選用BALB/c小鼠，7_8周大，雌性。潔淨等級:SPF級。注射方式採用腹腔注射；免疫周期:兩周一免；免疫次數:四次；最後一次免疫七天後對小鼠摘眼球取全血。具體做法是:
[0023]初次免疫:取0.1mg純化的過敏原蛋白溶於0.9%的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所配製的溶液中，進行動物免疫；
[0024]加強免疫:取0.1mg純化的過敏原蛋白溶於0.9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所配製的溶液中，進行動物免疫；
[0025]抗體純化:定時監測動物抗體效價，當抗體對一定的包被抗原達到適宜效價時，採集血液，並離心獲得抗血清，使用Protein G-Sepharose親和層析柱對抗血清進行純化,得到了純化的鼠抗多克隆抗體。
[0026]上述製備的綠豆過敏原抗體可用於綠豆過敏原的免疫檢測。
[0027]免疫分析方法的建立和測定條件的優選:
[0028]利用單因素實驗分別確定抗原抗體結合效價、親和性以及ELISA方法的包被抗體、檢測抗體和酶標二抗的最適稀釋倍數。本發明建立了綠豆過敏原的快速免疫檢測方法，確定最佳工作條件，建立標準曲線:即目標分析物濃度對吸光度值相關曲線。
[0029]對於雙抗體夾心酶聯免疫檢測方法,檢測限(limit ofdetection, L0D)定義為空白加三倍標準偏差，定量限(limit ofquantif ication，L0Q)定義為空白加十倍標準偏差，然後將上述值帶入標準曲線中求出相應的值。可以根據上述實驗得到的標準曲線確定檢測的線性範圍，計算檢測限和定量限。
[0030]抗體特異性:抗體的特異性通過交叉反應測定。本實驗選擇九種食品用於交叉反應的測定，這九種食品均屬於八大食品過敏原，也是日常生活中最常見的食品。主要包括以下九種:雞蛋，花生，白芝麻，綠豆，燕麥，牛奶，大豆，大米和小麥。按照提取綠豆蛋白的方法提取上述九種食品的蛋白。蛋白溶液濃度的確定考馬斯亮藍G-250蛋白定量法，用BSA作為標準蛋白。每種蛋白用？85稀釋成三個濃度，1(^8/1^、1118/1^和0.1118/mL，用PBS作陰性對照。然後用於已建立的雙抗體夾心酶聯免疫檢測方法，在雙波長方式(450-650nm)下,用酶標儀讀取吸光度值,如果交叉反應物孔的吸光度值P (positive)是陰性孔值N (negative)的2倍以上，即P/N > 2，洗明抗體對此種蛋白有交叉；若P/N < 2，則表示抗體沒有交叉，特異性好。
`[0031]上述製備的抗體可用於綠豆蛋白的免疫檢測方法中，其方法如下:
[0032]((I)包被:純化後的兔抗綠豆蛋白抗體經包被液稀釋，然後以ΙΟΟμ L/well包被於酶標板上。4°C孵育12-16小時後棄去孔中液體，用PBST洗液洗板3次，每次2分鐘。
[0033](2)封閉:在酶標板中加入200 μ L/well封閉液,室溫封閉I小時後棄去封閉液，用PBST洗液洗板3次，每次2分鐘。
[0034](3)加樣:加入梯度稀釋的綠豆蛋白溶液，100μ L/well ο室溫孵育I小時後棄去孔中液體，用PBST洗液洗板4次，每次2分鐘。
[0035](4)加鼠抗血清:將鼠抗綠豆蛋白血清用PBS稀釋，加入酶標板中100μ L/well，室溫孵育I小時，然後用PBST洗液洗板4次，每次2分鐘。
[0036](5)加酶標二抗:加入PBS稀釋10000倍的HRP標記的羊抗鼠二抗，100 μ L/well,室溫反應30分鐘後用PBST洗液洗板5次，每次2分鐘。
[0037](6)顯色:提前15分鐘配製好底物溶液，每孔中加入100μ L，室溫暗處顯色20分鐘。
[0038](7)終止:在每孔中加50 μ L終止液。
[0039](8)讀數:在雙波長方式(450_650nm)下用酶標儀讀取吸光度值(0D值)。
[0040]根據測量得到的吸光度值，繪製吸光度值與蛋白濃度的曲線。【專利附圖】
【附圖說明】:
[0041]圖1:不同濃度的綠豆過敏原蛋白與吸光度值關係曲線
[0042]有益效果:
[0043]與其他同類方法相比，本發明具有特異、靈敏、準確、快速、方便、廉價等特點。製備特異性良好的抗體是本檢測方法的基礎。其抗體具有良好的特異性和靈敏度，對建立的雙抗體夾心酶聯免疫檢測方法進行評價:檢測限為4.99ng/mL，定量限為15.47ng/mL，檢測曲線的線性範圍為19.53-312.5ng/mL。
[0044]本發明提供的快速檢測方法操作簡便、快速，而且檢測的精確度可達90%以上，非常適合現場檢測的需要。因此，本發明不僅在實驗室檢測中表現出色，並為開發出成本低廉、檢測效率高、操作簡便的酶聯免疫快速檢測工具，奠定了基礎，具有良好的應用前景；既有經濟效益又有社會效益。
【具體實施方式】
[0045].靈敏度和特異性分析:
[0046](I)靈敏度
[0047]在確定的最優條件下，建立了如圖所示的ELISA方法的標準曲線，由方程可以求出方法的靈敏度，檢測限為4.99ng/mL，定量限為15.47ng/mL，檢測曲線的線性範圍為19.53-312.5ng/mL。
[0048](2)特異性
[0049]本實驗選擇九種食·品用於交叉反應的測定，這九種食品均屬於八大食品過敏原，也是日常生活中最常見的易致敏食品。將上述九種蛋白用PBS稀釋成三個濃度，10 μ g/mL、I μ g/mL和0.1 μ g/mL，用PBS作陰性對照。用於雙抗體夾心酶聯免疫檢測方法，讀取吸光度值。交叉反應結果見下表。可見，抗體特異性很好。
[0050]雙抗夾心酶聯免疫檢測方法交叉反應
[0051]
【權利要求】
1.綠豆過敏原多克隆抗體使用綠豆過敏原蛋白作為免疫原免疫兔子和小鼠進行製備。
2.權利要求1所述的綠豆過敏原蛋白兔多抗的製備方法，其特徵在於使用下述步驟製得: 初次免疫:取Img純化的綠豆過敏原蛋白溶於0.9%的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所配製的溶液中，採用皮下和肌肉注免疫雌性大白兔； 加強免疫:用0.5mg上述人工抗原溶於0.9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所配製的溶液，初免後進行四次加強免疫，加強免疫分別於初次免疫後2周、4周和6周後免疫三次，此後間隔一個月，第五次免疫完後7-10天時由兔子的耳緣靜脈取血，進行效價檢測進行動物免疫； 抗體純化:定時監測動物抗體效價，當抗體對綠豆過敏原蛋白的效價達到1: 150000時，採集血液，並離心獲得抗血清，使用ProteinA-Sepharose4B免疫層析親利柱對抗血清進行純化，得到純化的兔抗多克隆抗體。
3.權利要求1所述的綠豆過敏原蛋白鼠多抗的製備方法，其特徵在於是用下述步驟製得: 免疫:免疫動物選用，，。潔淨等級=SPF級。注射方式；免疫周期: 初次免疫:取0.1mg上述純化的綠豆過敏原蛋白溶於0.9%的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所配製的溶液中，採用腹腔注射免疫7-8周大BALB/c雌性小鼠； 加強免疫:取0.1mg上述純化的過敏原蛋白溶於0.9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所配製的溶液中，在除免後進行加強免疫，此後每兩周一免，免疫四次；最後一次免疫七天後對小鼠摘眼球取全血； 抗體純化:定時監測動物抗體效價，當抗體對一定的包被抗原達到適宜效價時，採集血液，並離心獲得抗血清。
4.權利要求1所述的綠豆蛋白過敏原和抗體在免疫檢測方法中的應用，其特徵在於方法如下: (1)包被:純化後的兔抗綠?蛋白抗體經包被液稀釋，然後以100μ L/well包被於酶標板上。4°C孵育12-16小時後棄去孔中液體，用PBST洗液洗板3次，每次2分鐘。 (2)封閉:在酶標板中加入200μ L/well封閉液,室溫封閉I小時後棄去封閉液,用PBST洗液洗板3次，每次2分鐘。 (3)加樣:加入梯度稀釋的綠豆蛋白溶液，100μ L/well。室溫孵育I小時後棄去孔中液體，用PBST洗液洗板4次，每次2分鐘。 (4)加鼠抗血清:將鼠抗綠豆蛋白血清用PBS稀釋，加入酶標板中100μ L/well，室溫孵育I小時，然後用PBST洗液洗板4次，每次2分鐘。 (5)加酶標二抗:加入PBS稀釋10000倍的HRP標記的羊抗鼠二抗，100μ L/well，室溫反應30分鐘後用PBST洗液洗板5次，每次2分鐘。 (6)顯色:提前15分鐘配製好底物溶液，每孔中加入100μ L，室溫暗處顯色20分鐘。 (7)終止:在每孔中加50uL終止液。 (8)讀數:在雙波長方式(450-650nm)下用酶標儀讀取吸光度值(OD值)。
【文檔編號】G01N33/531GK103792363SQ201210425604
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年10月31日 優先權日:2012年10月31日
【發明者】王碩, 張燕, 生威, 王俊平, 張潔瓊 申請人:天津科技大學