狼毒不定根的誘導及組織培養的方法

2023-12-09 08:22:56 3

專利名稱：狼毒不定根的誘導及組織培養的方法
技術領域：
本發明涉及的是一種細胞工程技術領域的方法，特別是涉及一種狼毒不定根的誘導及組織培養的方法。
背景技術：
狼毒是我國特有的、貴重中藥材之一，含殺蟲、殺菌及抗癌等多種生物活性物質。 二職類化合物Prostratin (圖I)最早由Cashmore等人從紐西蘭植物稻花一種(Pimelea prostrata)中分離得到。近年來，人們在太平洋島國薩摩亞的Mamala樹Homalanthus nutans中也分離到了該二職類化合物並且發現Prostratin能夠激活潛伏的HIV病毒,表現出良好的抗HIV的活性，有望開發成一種新藥，但人們經研究發現Mamala樹資源很少，其中的Prostratin的含量很低。我國的學者發現狼毒(Euphorbia fischeriana)的根中也含有Prostratin,但其Prostratin的含量也很低。由於狼毒大戟的生長受地理條件的限制， 資源十分有限，導致藥材供不應求，不能滿足醫藥市場的需求。為解決資源緊缺的問題，研究生物技術培養狼毒的方法成為當務之急。規模化藥用植物組織培養可以解決以上問題， 通過組織培養方法可以獲得有效成分含量高、生產周期短的狼毒組織培養物，從而代替野生或人工土地栽培的狼毒，既可解決佔地問題，又可解決狼毒藥材的資源問題，具有重要的經濟價值、生態效益和社會效益。
不定根培養是上世紀80年代發展起來的一項細胞工程技術。不定根是一種分化的植物器官，是由植物的愈傷組織誘導而來。和懸浮培養細胞相比較，藥用植物的不定根其有效成分含量很穩定；和大田人工栽培的植物相比，不僅有效成分含量高而穩定，而且不定根培養不受氣候、土地等因素的影響，可以周年大規模生產，適合於藥用植物尤其是狼毒這種根類藥材的組織培養和規模化生產，以獲得狼毒藥材的替代物或生產其 主要有效成分。
經對現有文獻的檢索發現，目前除戴傳超等人進行了藥用植物京大戟(Euphorbia pekinensis)懸浮細胞培養的研究外(見戴傳超、餘伯陽、薛菲、蔣繼宏，藥用植物大戟懸浮細胞的培養，南京林業大學學報(自然科學版)，2005，29 (2) :57-60)，尚無狼毒 (Euphorbia fischeriana)細胞、組織培養和生產方法的文獻報導，也未見有涉及狼毒 (Euphorbia fischeriana)不定根誘導及不定根培養體系建立的文獻報導。發明內容
本發明的目的在於針對狼毒(Euphorbia fischeriana)不定根細胞工程生產技術，提供一種狼毒不定根的誘導及組織培養的方法。使其來自於自大田栽培狼毒植物的種子的無菌小苗在愈傷組織誘導基上誘導形成愈傷組織，並使狼毒愈傷組織在不定根誘導培養基上誘導形成不定根，形成一種規模大、周期短、質量可控、成本低的不定根生產方法。
本發明是通過下述技術方案實現的，包括如下具體步驟
(I)狼毒無菌小苗的獲得取野生狼毒植株的種子置於MS固體培養基上，於光照培養條件下萌發成無菌小苗；
(2)狼毒愈傷組織的誘導具體為取步驟(I)獲得的3釐米長的狼毒無菌小苗置於含2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6-苄氨基腺嘌呤出-BA)三種植物生長調節劑和椰子汁的MS固體培養基上，於無菌避光條件下誘導形成愈傷組織；
(3)狼毒不定根的誘導取步驟(2)獲得的狼毒愈傷組織置於含吲哚丁酸和椰子汁的MS固體培養基上，於無菌避光條件下誘導形成不定根；
(4)狼毒不定根的培養取步驟(3)獲得的狼毒不定根置於含有吲哚丁酸的MS固體培養基上，於無菌避光條件下培養。
步驟⑴中所述的小苗為誘導自野生狼毒植株的種子。
步驟(2)中所述的愈傷組織，是指源於無菌小苗的愈傷組織。
步驟(I)中所述的培養基，是指不含任何植物生長調節劑的MS固體培養基。
步驟(I)中所述的光照培養條件下，是指於24_26°C、3000勒克斯(Iux)光照強度的條件下誘導25-30天。
步驟(2)中所述的培養基，是指含有0.2-2mg/L 2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4_D)、O.1-lmg/L 萘乙酸(NAA)、0· 02-0. 2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和 2_3ml/L 椰子汁的 MS 固體培養基。
步驟(2)中所述的無菌避光條件下，是指於24_26°C無菌避光條件下誘導25_30天。
步驟(3)中所述的培養基，是指含有5-20mg/L吲哚丁酸和l_2ml/L椰子汁的MS固體培養基。
步驟(3)中所述的無菌避光條件下，是指於24_26°C無菌避光條件下誘導25_30天。·0019]步驟(4)中所述的培養基，是指含有l_2mg/L吲哚丁酸的MS固體培養基。
步驟(4)中所述的無菌避光條件下，是指於24_26°C無菌避光條件下誘導25_30天。
本發明方法簡便、效率高，來源於狼毒無菌小苗愈傷組織不定根的誘導率在 90. 0%以上，狼毒有效物質prostratin含量高，建立了完善的不定根培養體系。


圖I為狼毒有效物質prostratin的化學結構圖。
圖2為prostratin標準品的高效液相色譜圖。
圖3為狼毒不定根樣品的高效液相色譜圖。
圖4為狼毒不定根樣品加prostratin標準品後的高效液相色譜圖。
具體實施方式
實施例I :狼毒種子的萌發
取野生狼毒植株的種子，經O. 2% HgCl2消毒12分鐘、用無菌水衝洗3遍後置於不含任何植物生長調節劑的MS固體培養基上，於26°C、3000勒克司(Iux)光照條件下培養25 天，即可萌發成小苗。
實施效果狼毒種子的萌發率達5.0%，所萌發成的無菌小苗具有完整的根、莖、葉，生長正常。
實施例2 :狼毒愈傷組織的誘導將實施例I獲得的3釐米長的狼毒無菌小苗置於含lmg/L 2，4_ 二氯苯氧乙酸(2， 4-D)，0. 5mg/L萘乙酸，O. lmg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)三種植物生長調節劑和3ml/L椰子汁的MS固體培養基上，於24-26°C無菌避光條件下誘導25天，即得到狼毒的愈傷組織。
實施效果狼毒愈傷組織誘導率達80. O %。2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)，萘乙酸， 6-苄氨基腺嘌呤這三種植物生長調節劑和椰子汁的共同作用促進了愈傷組織的形成和生長。
實施例3 :狼毒不定根的誘導
將實施例2獲得的狼毒愈傷組織置於含10mg/L吲哚丁酸這種植物生長調節劑和 2ml/L椰子汁的MS固體培養基上，於24-26°C無菌避光條件誘導培養25天，即得到狼毒的不定根。
實施效果不定根誘導率達90. 0%，不定根細、短，並側向分生出細、短的不定根， 不定根發生輕微的愈傷化。
實施例4 :狼毒不定根固體培養體系的建立
將實施例3獲得的狼毒不定根從其母體愈傷組織上分離，將分離到的不定根置於含有2mg/L吲哚丁酸的MS固體培養基上，於24-26°C無菌避光條件誘導培養25天，即得到大量的狼毒的不定根。
實施效果建立了不定根的體外固體培養體系，側向分生出大量細長的不定根。經高效液相色譜儀分析，所得狼毒不定根中有效物質prostratin的含量為42. 21 μ g/g乾重。
權利要求
1.一種狼毒(Euphorbia fischeriana)不定根的誘導及組織培養的方法,其特徵在於，包括以下具體步驟(1)狼毒無菌小苗的獲得取狼毒的種子置於MS固體培養基上，於光照培養條件下萌發成無菌小苗；(2)狼毒愈傷組織的誘導具體為取步驟(I)獲得的3釐米長的狼毒無菌小苗置於含 2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6-苄氨基腺嘌呤出-BA)三種植物生長調節劑和椰子汁的MS固體培養基上，於無菌避光條件下誘導形成愈傷組織；(3)狼毒不定根的誘導取步驟(2)獲得的狼毒愈傷組織置於含吲哚丁酸和椰子汁的 MS固體培養基上，於無菌避光條件下誘導形成不定根；(4)狼毒不定根的培養取步驟(3)獲得的狼毒不定根置於含有吲哚丁酸的MS固體培養基上，於無菌避光條件下培養。
2.根據權利要求I所述的狼毒不定根的誘導及組織培養的方法，其特徵是，步驟(I)中所述的小苗為誘導自野生狼毒植物的種子。
3.根據權利要求2所述的狼毒不定根的誘導及組織培養的方法，其特徵是，步驟(2)中所述的愈傷組織，是指源於狼毒無菌小苗的愈傷組織。
4.根據權利要求I所述的狼毒不定根的誘導及組織培養的方法，其特徵是，步驟(I)中所述的培養基，是指不含任何植物生長調節劑的MS固體培養基。
5.根據權利要求I所述的狼 毒不定根的誘導及組織培養的方法，其特徵是，步驟(I)中所述的光照培養條件下，是指於24-26°C、3000勒克斯(Iux)光照強度的條件下誘導25-30 天。
6.根據權利要求I所述的狼毒不定根的誘導及組織培養的方法，其特徵是，步驟(2)中所述的培養基，是指含有O. 2-2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)、0. 1-lmg/L萘乙酸(NAA)、 O. 02-0. 2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和2_3ml/L椰子汁的MS固體培養基。
7.根據權利要求I所述的狼毒不定根的誘導及組織培養的方法，其特徵是，步驟(3)中所述的培養基，是指含有5-20mg/L吲哚丁酸和l-2ml/L椰子汁的MS固體培養基。
8.根據權利要求I所述的狼毒不定根的誘導及組織培養的方法，其特徵是，步驟(4)中所述的培養基，是指含有l_2mg/L吲哚丁酸的MS固體培養基。
9.根據權利要求I所述的狼毒不定根的誘導及組織培養的方法，其特徵是，步驟(2)、 步驟(3)、步驟(4)中所述的無菌避光條件下，是指於24-26°C無菌避光條件下培養25-30 天。
全文摘要
本發明涉及一種狼毒(Euphorbia fischeriana)不定根的誘導及組織培養的方法，屬於細胞工程技術領域。包括(1)種子的萌發狼毒種子經HgCl2消毒後置於MS固體培養基上，於光照下萌發；(2)愈傷組織的誘導將步驟(1)獲得的小苗置於含2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、6-苄氨基腺嘌呤和椰子汁的MS固體培養基上，於無菌避光條件下誘導形成愈傷組織；(3)不定根的誘導將步驟(2)獲得的愈傷組織置於含吲哚丁酸和椰子汁的MS固體培養基上，於無菌避光條件下誘導形成不定根；(4)不定根的培養將步驟(3)獲得的不定根置於含有吲哚丁酸的MS固體培養基上培養。本發明方法簡單、有效物質含量高。
文檔編號A01H4/00GK102870672SQ201110193279
公開日2013年1月16日 申請日期2011年7月12日 優先權日2011年7月12日
發明者邱德有, 劉洪偉, 楊豔芳, 張楠 申請人:中國林業科學研究院林業研究所