輻射育種高產蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產方法
2023-12-09 01:53:26 1
專利名稱：輻射育種高產蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產方法
技術領域：
本發明涉及ー種食用菌種源的生產方法，尤其涉及一種輻射育種高產蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產方法。屬於食用菌藥用菌遺傳育種領域。
背景技術：
冬蟲夏草Cordyceps sinensis是我國傳統的名貴藥材,分布於西藏、青海、四川、甘肅、雲南等地，具有特殊的藥理作用和治療功效。也是藥食調補佳品。其中蟲草素是最獨特而重要的藥物成分。近年來由於人類活動範圍的擴大，生態環境的惡化，導致野生冬蟲夏草持續減少， 價格也持續飆升。到2010年優質蟲草已經銷售到16萬元/公斤(幹)。為解決冬蟲夏草資源緊缺問題，人們很早就開始關注蛹蟲草，從1986年起，人們把野生蛹蟲草採集回來，通過組織分離獲得菌種，20多年裡，蛹蟲草栽培獲得重大技術突破。目前它已經成為冬蟲夏草的最佳替代品。全世界已知蟲草類有350餘種，我國目前有62種，但最為昂貴的只有冬蟲夏草和蛹蟲草。北蟲草即蛹蟲草Cordycepsmilitaris (L. ) Link、又稱之北冬蟲夏草,它是蟲草屬中兩個模式種之一。2007年我國正式將北蟲草列為新資源食品。它被認為是目前唯一能替代冬蟲夏草的蟲草屬真菌。北蟲草在世界上廣泛分布，它能夠寄生在多種鱗翅目昆蟲的幼蟲及其蛹體上，在我國各地分布較廣，主要分布剝蝕丘陵地帯、海抜50-400米之間、氣候屬於北溫帯、半溼潤大陸性氣候、毎年只有林區在鬱閉、避風的地段才能有北蟲草集中發生，而傳統的冬蟲夏草主產於我國青海、雲貴高原的橫斷山區及祁連山等海抜4500-5000 米以上的高原灌叢或草甸地帶、寄生在凍土層中的蝙蝠蛾幼蟲體上，遺憾的是對於這種名貴中藥材至今未能實現有效的子實體人工培養及規模化生產，但是國內外對已經成為誘發蟲草子實體的種類研究認為，北蟲草食用和藥用價值可與傳統的冬蟲夏草媲美，它不僅在藥效成分種類上與傳統冬蟲夏草相近外，而且是在已報導的350餘種蟲草菌中唯一能大量形成蟲草素的種，因此它與傳統冬蟲夏草一祥，能滋補人體，而且能有效地抑制腫瘤和病毒，並具有多種藥理功能，是傳統冬蟲夏草的最理想代用品，但野生的北冬蟲夏草與傳統的冬蟲夏草一祥，在自然界中稀少，價格昂貴，因此，人工培育具有自然形態的北冬蟲夏草子實體，意義重大，經濟效益顯著！蟲草素是蟲草屬藥用真菌中獨有的藥物成分，是ー種核苷類抗生素，具有較好的抗病毒功能；能抑制枯草桿菌，鳥結核桿菌和艾氏腹水癌細胞，並對KB細胞培養和Hep#2 細胞有毒性作用，可影響mRNA的形成以至蛋白質的合成，這ー機制與蟲草素抗腫瘤有夫， 1997年美國已將蟲草素用於一期臨床試驗，治療急性前B和前T淋巴細胞白血病患者；同時，蟲草素還表現出極強的抗真菌，抗HIV-I型病毒和選擇性抑制梭菌屬細菌活性。經檢測人工栽培的北蟲草富含蟲草素，其含量高於冬蟲夏草。目前北蟲草的人工栽培技術已經相當成熟，但在如何提高北蟲草內在品質方面尚有大量工作需要去做，其中如何提高北蟲草內蟲草素含量就是ー個重要課題。資料顯示，目前科技工作者在提高蟲草素方面主要是通過向培養基中添加一定數量的蛋白源，但這種做法提高幅度有限，從2008年起，我們主要通過培育北蟲草新品種來提高蟲草素含量，具體做法就是對現有蟲草種源進行輻射育種，再通過液相色譜檢測法篩選蟲草素產率高的新菌株。本專利所提及的高產蟲草素北蟲草新菌株ycc Gy 1016的生產方法就是在上述背景下選育而成。批量多次重複的栽培結果表明，在相同栽培培養基和管理條件下，採用ycc Gy 1016和ycc-01兩個不同品種進行栽培，所獲得的蟲草幹品中蟲草素含量差異明顯，與種源本身產生蟲草素能力成正相關。
發明內容
本發明為了解決目前為提高北蟲草的蟲草素含量，所採用的通過向培養基中添加一定數量的蛋白源其提高幅度有限，效果不理想的技術問題，提供一種輻射育種高產蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產方法，通過低劑量銫137放射性元素輻射後篩選獲得，定名為 ycc Gy 1016 ;具體生產方法是通過下述步驟實現的I)選擇目前生產中廣泛使用的北蟲草品種ycc-01作為輻射育種的出發菌株；2) ycc-01培養基配方葡萄糖20克、蛋白腖5克、酵母浸粉3克、磷酸ニ氫鉀3克、 硫酸鎂2克、複合維生素100毫克及蒸餾水1000毫升，按常規方法生產液體種源；3)按常規方法製備加富PDA培養基，取直徑10釐米培養皿同步高壓滅菌，倒平板、 冷卻後塗布稀釋1000-3000倍的含有分生孢子的液體種源菌液0. 1-0. 5毫升，均勻塗布於平板上，在18-25°C避光定植培養24-36小時，然後轉入輻射處理；4)輻射源選擇低劑量銫137，劑量50Gy-500Gy，距離30cm，照射2_300s，照射後在 20°C暗培養2-7天，然後轉入光照培養，光照強度4000-6000勒克斯，培養時間2_4天，然後根據菌落生長形態進行菌落篩選；5)菌落篩選，在宏觀層面，選擇菌落生長正常，邊緣整齊、菌絲不徒長，菌絲轉色深的菌落；在微觀層面通過顯微鏡進行觀察，選擇菌絲粗細均勻、細胞核數量多、菌絲分枝適度、分生孢子著生呈念珠狀態，選擇符合上述要求的菌落挑取保存；6)將挑取菌落進行編號，按常規方法擴繁母種和液體菌種，並進行栽培對出草正常，子實體形態正常、產量高的菌落製備液體菌種，培養基配方為葡萄糖20克，蛋白腖5 克，酵母浸粉3克，磷酸ニ氫鉀3克，硫酸鎂2克，蒸餾水1000毫升，以出發菌株ycc-01為對照，常規培養後測定菌絲體中蟲草素含量和液體培養基中蟲草素含量；7)經過檢測，對蟲草素含量高菌落進行提純、復壯；按常規製備液體菌種，按每瓶鮮蠶蛹10個、幹小麥20克、飲用水30毫升，滅菌後接種，按常規培養，待出草後選子實體形態好的，進行組織分離獲取種源；8)對選擇出的產生蟲草素高的組織分離種源進行遺傳穩定性評價實驗，最後篩選得到一株高產蟲草素的新菌株，定名為ycc Gy 1016新菌株。本發明的特點及有益效果ycc Gy 1016菌株與出發菌株ycc-01相比,在出草方面形態正常，產量性狀在0. 05水平比較差異不顯著，蟲草素產率在0. 05水平比較，差異達到顯著水平。經檢測菌株ycc Gy 1016產生蟲草素能力是出發菌株ycc-01的3. 8倍。這一成果對於人工生產功能性北蟲草具有重要價值，應用前景廣闊。具體結果ycc Gy 1016菌株生物轉化率為5. 62克(幹)/45克小麥，出發菌株ycc-01生物轉化率為5. 68克(幹)/45克小麥；yCC Gy 1016菌株蟲草素產率481. 6毫克 /公斤，ycc-01菌株蟲草素產率126. 3毫克/公斤。
圖lyCCGyl016和YCC-01菌種轉代次數對子實體產量的影響曲線2蟲草素標準曲線3轉代次數對yCCGyl016和YCC-Ol菌種蟲草素含量曲線圖
具體實施例方式輻射育種高產蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產方法，通過低劑量銫137放射性元素輻射後篩選獲得，定名為..ice Gy 1016 ;具體生產方法是通過下述步驟實現的I)選擇目前生產中廣泛使用的北蟲草品種ycc-01作為輻射育種的出發菌株；2) ycc-01培養基配方葡萄糖20克、蛋白腖5克、酵母浸粉3克、磷酸ニ氫鉀3克、 硫酸鎂2克、複合維生素100毫克及蒸餾水1000毫升，按常規方法生產液體種源；3)按常規方法製備加富PDA培養基，取直徑10釐米培養皿同步高壓滅菌，倒平板、 冷卻後塗布稀釋1000-3000倍的含有分生孢子的液體種源菌液0. 1-0. 5毫升，均勻塗布於平板上，在18-25°C避光定植培養24-36小時，然後轉入輻射處理；4)輻射源選擇低劑量銫137，劑量50Gy_500Gy，距離30cm，照射2_300s，照射後在 20°C暗培養2-7天，然後轉入光照培養，光照強度4000-6000勒克斯，培養時間2_4天，選擇菌落生長正常，菌絲不徒長，菌絲轉色深的菌落，挑取保存；5)菌落篩選，在宏觀層面，選擇菌落生長正常，邊緣整齊、菌絲不徒長，菌絲轉色深的菌落；在微觀層面通過顯微鏡進行觀察，選擇菌絲粗細均勻、細胞核數量多、菌絲分枝適度、分生孢子著生呈念珠狀態，選擇符合上述要求的菌落挑取保存；6)將挑取菌落進行編號，按常規方法擴繁母種和液體菌種，並進行栽培對出草正常，子實體形態正常、產量高的菌落製備液體菌種，培養基配方為葡萄糖20克，蛋白腖5 克，酵母浸粉3克，磷酸ニ氫鉀3克，硫酸鎂2克，蒸餾水1000毫升，以出發菌株ycc-01為對照，常規培養後測定菌絲體中蟲草素含量和液體培養基中蟲草素含量；7)經過檢測，對蟲草素含量高菌落進行提純、復壯；按常規製備液體菌種，按每瓶鮮蠶蛹10個、幹小麥20克、飲用水30毫升，滅菌後接種，按常規培養，待出草後選子實體形態好的，進行組織分離獲取種源；8)對選擇出的產生蟲草素高的組織分離種源進行遺傳穩定性評價實驗，最後篩選得到一株高產蟲草素的新菌株，定名為ycc Gy 1016新菌株。其中所述遺傳穩定性評價實驗，指按如下步驟程序操作，至少連續栽培3個批次，來確認種源種性的穩定性。 I)採用馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白腖3g，酵母膏2g，磷酸ニ氫鉀2g，硫酸鎂lg， 水IOOOmL配方按常規繁育生產用液體菌種。2)採用750毫升的玻璃罐頭瓶為容器，每瓶45克小麥，加水70毫升，I. 05公斤/ 平方釐米壓カ滅菌60分鐘，冷卻接種。3)菌瓶先放於20°C避光培養6天，然後轉入光暗交叉培養，每天白天以4000勒克斯強度光照，晚上暗培養，環境溼度85%，每天通風3次。4)整個生產周期60天，子實體長度控制在8-12釐米，其它按常規操作，每批採用後抽樣測定產量和蟲草素含量。實施例I本專利申請保護的是ー株能夠提高蟲草素含量的北蟲草新品種的生產方法。該品種是通過低劑量銫137放射性元素輻射後篩選獲得，定名為yCC Gyl016。具體實現步驟是首先選擇目前生產中廣泛使用的北蟲草品種ycc-01作為輻射育種的出發菌株；將ycc-01利用如下培養基配方葡萄糖20克、蛋白腖5克、酵母浸粉3克、磷酸 ニ氫鉀3克、硫酸鎂2克、複合維生素100毫克及蒸餾水1000毫升，按常規方法生產液體種源；再按常規方法製備加富PDA培養基，取直徑10釐米培養皿同步高壓滅菌，倒平板、 冷卻後塗布稀釋2500倍的含有分生孢子的液體種源菌液0. 3毫升，均勻塗布於平板上，在 18-25°C避光定植培養24-36小時，然後轉入輻射處理；輻射源選擇低劑量銫137，劑量50Gy，距離30cm，照射300s，照射後在20°C暗培養 7天，然後轉入光照培養，光照強度4000勒克斯，培養時間4天，選擇菌落生長正常，菌絲不徒長，菌絲轉色深的菌落，挑取保存；進行菌落篩選，在宏觀層面，選擇菌落生長正常，邊緣整齊、菌絲不徒長，菌絲轉色深的菌落；在微觀層面通過顯微鏡進行觀察，選擇菌絲粗細均勻、細胞核數量多、菌絲分枝適度、分生孢子著生呈念珠狀態，選擇符合上述要求的菌落挑取保存；將挑取菌落進行編號，按常規方法擴繁母種和液體菌種，並進行栽培對出草正常， 子實體形態正常、產量高的菌落製備液體菌種，培養基配方為葡萄糖20克，蛋白腖5克，酵母浸粉3克，磷酸ニ氫鉀3克，硫酸鎂2克，蒸餾水1000毫升，以出發菌株ycc-01為對照， 常規培養後測定菌絲體中蟲草素含量和液體培養基中蟲草素含量；其蟲草素測定方法採用高效液相色譜法。經過檢測，對蟲草素含量高菌落進行提純、復壯；按常規製備液體菌種，按每瓶鮮蠶蛹10個、幹小麥20克、飲用水30毫升，滅菌後接種，按常規培養，待出草後選子實體形態好的，進行組織分離獲取種源。對選擇出的產生蟲草素高的組織分離種源進行遺傳穩定性評價實驗，最後篩選得到一株高產蟲草素的新菌株，定名為ycc Gy 1016新菌株。所述遺傳穩定性評價實驗，指按如下步驟程序操作，至少連續栽培3個批次，來確認種源種性的穩定性。I)採用馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白腖3g，酵母膏2g，磷酸ニ氫鉀2g，硫酸鎂lg， 水IOOOmL配方按常規繁育生產用液體菌種。2)採用750毫升的玻璃罐頭瓶為容器，每瓶45克小麥，加水70毫升，I. 05公斤/ 平方釐米壓カ滅菌60分鐘，冷卻接種。3)菌瓶先放於20°C避光培養6天，然後轉入光暗交叉培養，每天白天以4000勒克斯強度光照，晚上暗培養，環境溼度85%，每天通風3次。4)整個生產周期60天，子實體長度控制在8-12釐米，其它按常規操作，每批採用後抽樣測定產量和蟲草素含量。經檢測ycc Gy 1016菌株與出發菌株ycc-01相比，在出草方面形態正常，產量性狀在0. 05水平比較差異不顯著，蟲草素產率在0. 05水平比較，差異達到顯著水平。具體結果yCC Gy 1016菌株生物轉化率為5. 62克(幹)/45克小麥，出發菌株ycc-01生物轉化率為5. 68克(幹)/45克小麥；ycc Gy 1016菌株蟲草素產率481. 6毫克/公斤，ycc-01菌株蟲草素產率126. 3暈克/公斤。實施例2輻射育種高產蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產方法，首先選擇目前生產中廣泛使用的北蟲草品種ycc-01作為輻射育種的出發菌株；將ycc-01利用如下培養基配方葡萄糖20克、蛋白腖5克、酵母浸粉3克、磷酸 ニ氫鉀3克、硫酸鎂2克、複合維生素100毫克及蒸餾水1000毫升，按常規方法生產液體種源；再按常規方法製備加富PDA培養基，取直徑10釐米培養皿同步高壓滅菌，倒平板、 冷卻後塗布稀釋3000倍的含有分生孢子的液體種源菌液0. 3毫升，均勻塗布於平板上，在 18-25°C避光定植培養24-36小時，然後轉入輻射處理；輻射源選擇低劑量銫137，劑量500Gy，距離30cm，照射2s，照射後在20°C暗培養6 天，然後轉入光照培養，光照強度5000勒克斯，培養時間3天，選擇菌落生長正常，菌絲不徒長，菌絲轉色深的菌落，挑取保存；其他同實施例I實施例3輻射育種高產蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產方法，首先選擇目前生產中廣泛使用的北蟲草品種ycc-01作為輻射育種的出發菌株；將ycc-01利用如下培養基配方葡萄糖20克、蛋白腖5克、酵母浸粉3克、磷酸 ニ氫鉀3克、硫酸鎂2克、複合維生素100毫克及蒸餾水1000毫升，按常規方法生產液體種源； 再按常規方法製備加富PDA培養基，取直徑10釐米培養皿同步高壓滅菌，倒平板、 冷卻後塗布稀釋3000倍的含有分生孢子的液體種源菌液0. 3毫升，均勻塗布於平板上，在 18-25°C避光定植培養24-36小時，然後轉入輻射處理；輻射源選擇低劑量銫137，劑量200Gy，距離30cm，照射200s，照射後在20°C暗培養 5天，然後轉入光照培養，光照強度6000勒克斯，培養時間2天，選擇菌落生長正常，菌絲不徒長，菌絲轉色深的菌落，挑取保存；其他同實施例I。下面的實驗是對北蟲草誘變菌株yCCGyl016遺傳穩定性及產生蟲草素能力的評價實驗ー北蟲草誘變菌株ycc Gy 1016遺傳穩定性評價I. I遺傳穩定性試驗由於誘變菌株在連續繼代培養時的性狀常常不穩定，所以要對鈷60輻射誘變處理後得到的菌株進行遺傳穩定性試驗。將誘變菌株yccGyl016和對照原始菌株YCC-Ol — 起在PDA斜面上連續轉接10代，每代均進行栽培試驗，結果見表I、表2。
權利要求
1.輻射育種高產蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產方法，通過低劑量銫137放射性元素輻射後篩選獲得，定名為ycc Gy 1016 ;具體生產方法是通過下述步驟實現的1)選擇目前生產中廣泛使用的北蟲草品種ycc-01作為輻射育種的出發菌株；2)ycc-01培養基配方葡萄糖20克、蛋白腖5克、酵母浸粉3克、磷酸ニ氫鉀3克、硫酸鎂2克、複合維生素100毫克及蒸餾水1000毫升，按常規方法生產液體種源；3)按常規方法製備加富PDA培養基，其配方為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蛋白腖3g，酵母膏2g，磷酸ニ氫鉀2g，硫酸鎂lg，水IOOOmL ;取直徑10釐米培養皿同步高壓滅菌，倒平板、冷卻後塗布稀釋1000-3000倍的含有分生孢子的液體種源菌液0. 1-0. 5毫升， 均勻塗布於平板上，在18-25°C避光定植培養24-36小時，然後轉入輻射處理；4)輻射源選擇低劑量銫137，劑量50Gy-500Gy，距離30cm，照射2_300s，照射後在20°C 暗培養2-7天，然後轉入光照培養，光照強度4000-6000勒克斯，培養時間2_4天，然後根據菌落生長形態進行菌落篩選；5)菌落篩選，在宏觀層面，選擇菌落生長正常，邊緣整齊、菌絲不徒長，菌絲轉色深的菌落；在微觀層面通過顯微鏡進行觀察，選擇菌絲粗細均勻、細胞核數量多、菌絲分枝適度、分生孢子著生呈念珠狀態，選擇符合上述要求的菌落挑取保存；6)將挑取菌落進行編號，按常規方法擴繁母種和液體菌種，並進行栽培，對出草正常， 子實體形態正常、產量高的菌落製備液體菌種，培養基配方為葡萄糖20克，蛋白腖5克，酵母浸粉3克，磷酸ニ氫鉀3克，硫酸鎂2克，蒸餾水1000毫升，以出發菌株ycc-01為對照， 常規培養後測定菌絲體中蟲草素含量和液體培養基中蟲草素含量；7)經過檢測，對蟲草素含量高菌落進行提純、復壯；按常規製備液體菌種，按每瓶鮮蠶蛹10個、幹小麥20克、飲用水30毫升，滅菌後接種，按常規培養，待出草後選子實體形態好的，進行組織分離獲取種源；8)對選擇出的產生蟲草素高的組織分離種源進行遺傳穩定性評價實驗，最後篩選得到一株高產蟲草素的新菌株，定名為ycc Gy 1016新菌株。
2.根據權利要求I所述的輻射育種高產蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產方法，其特徵在於所述遺傳穩定性評價實驗，指按如下步驟程序操作，至少連續栽培3個批次，來確認種源種性的穩定性；1)採用馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白腖3g，酵母膏2g，磷酸ニ氫鉀2g，硫酸鎂化，水 IOOOmL配方按常規繁育生產用液體菌種；2)採用750毫升的玻璃罐頭瓶為容器，每瓶45克小麥，加水70毫升，I.05公斤/平方釐米壓カ滅菌60分鐘，冷卻接種；3)菌瓶先放於20°C避光培養6天，然後轉入光暗交叉培養，每天白天以4000勒克斯強度光照，晚上暗培養，環境溼度85%，每天通風3次；4)整個生產周期60天，子實體長度控制在8-12釐米，其它按常規操作，每批採用後抽樣測定產量和蟲草素含量。
全文摘要
輻射育種高產蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產方法，是為了解決目前為提高北蟲草的蟲草素含量，所採用的通過向培養基中添加一定數量的蛋白源其提高幅度有限，效果不理想的技術問題而設計的。該方法通過輻射、誘變和篩選實現培育目標菌株的目的。目標菌株yccGy1016是通過對出發菌株ycc-01進行特點參數的輻射處理和對變異菌落的篩選純化，以及對產生蟲草素指標的科學檢測和栽培穩定性的評價，最後獲得該專利所提及的高產蟲草素北蟲草新菌株的生產方法。經檢測菌株ycc Gy 1016產生蟲草素能力是出發菌株ycc-01的3.8倍。這一成果對於人工生產功能性北蟲草具有重要價值，應用前景廣闊。
文檔編號A01G1/04GK102599005SQ20111002281
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月20日 優先權日2011年1月20日
發明者劉詩揚, 徐方旭, 李鋒, 王俊偉, 王升厚, 董忠生 申請人:瀋陽師範大學