在體內具有抗腫瘤活性的抗人TROP‑2抗體的製作方法

2023-12-09 03:55:26

本申請是中國專利申請201280057258.4的分案申請，原申請201280057258.4的申請日為2012年11月21日，其名稱為「在體內具有抗腫瘤活性的抗人trop-2抗體」。

本發明涉及具有抗腫瘤活性的抗人trop-2抗體、特別涉及在體內具有抗腫瘤活性的抗人trop-2抗體。此外，本發明涉及產生該抗體的雜交瘤、及該抗體的用途。

背景技術：

人trop-2(tacstd2，ga733-1，egp-1)(以下也記作htrop-2。)為已知在各種上皮細胞癌腫中過度表達的、由323胺基酸殘基(參照序列號2)構成的1次跨膜型的1型細胞膜蛋白。以前即已明確，存在與人滋養層細胞(trophoblasts)和癌細胞所表現的免疫抵抗有關的細胞膜蛋白(非專利文獻1)，已經鑑定出一種被抗人絨毛膜癌細胞株bewo的細胞膜蛋白的小鼠單克隆抗體(162-25.3、162-46.2)識別的抗原分子，為在人滋養層細胞(trophoblasts)中表達的分子之一，被命名為trop-2(非專利文獻2)。此後，相同分子被其它研究者發現，將被免疫胃癌細胞sw948而得的小鼠單克隆抗體ga733識別的稱為腫瘤抗原ga733-1(非專利文獻3)、將被非小細胞肺癌的細胞免疫而獲得的小鼠單克隆抗體rs7-3g11識別的稱為上皮糖蛋白(epithelial/carcinomaantigen，egp-1)(非專利文獻4)，1995年克隆了trop-2的基因，確認了它們為同一分子(非專利文獻5)。此外，闡明了其在癌細胞中具有放大細胞內鈣信號的作用(非專利文獻6)，也被稱為腫瘤相關鈣信號傳導蛋白(tumor-associatedcalciumsignaltransducer)2，tacstd2。

htrop-2基因定位在染色體1p32上，與具有約50％同源性的ga733-2(還作為tacstd1、上皮糖蛋白egp-2、epcam及trop-1而已知)一起構成tacstd基因家族(非專利文獻7)。htrop-2蛋白(323胺基酸殘基；序列號2)具有約36kd的分子量，包含親水性的信號肽(第1～26位的胺基酸)、細胞外結構域(第27～274位的胺基酸)、細胞跨膜結構域(第275～297位的胺基酸)以及細胞內結構域(第298～323位的胺基酸)。細胞外結構域中存在4個非均質n結合糖基化位點，添加糖鏈後，表觀分子量增加11～13kd(非專利文獻5)。tacstd基因家族中，細胞外結構域具有特徵性的甲狀腺球蛋白(ty)序列，通常認為其與癌細胞的增殖、浸潤、轉移有關。

截至目前，尚未鑑定出htrop-2的生理學上的配體，分子功能尚未闡明，但已經公開了其在腫瘤細胞中傳遞鈣信號(非專利文獻6)，此外，由於細胞內絲氨酸303號殘基通過屬於ca2+依賴性蛋白激酶的蛋白激酶c(pkc)而磷酸化(非專利文獻4)以及細胞內結構域具有pip2結合序列，表明其具有腫瘤細胞中的信號傳遞功能(非專利文獻8)。

通過免疫組化(ihc)及流式細胞術等解析，已經報導了htrop-2在胃癌、肺癌、大腸癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰癌、肝癌、食道癌等多種上皮源癌腫中過度表達。與此相對，顯示出正常組織中的表達則僅限於上皮區域的細胞，表達水平也比癌腫中低，表明trop-2與腫瘤形成有關(專利文獻1～3和9)。

此外，作為臨床試樣的生物學標誌的htrop-2的表達與大腸癌(非專利文獻10及11)、胰臟癌(非專利文獻12)、口腔癌(非專利文獻13)的惡性程度有關，在htrop-2高表達時，癌的轉移、復發頻率顯著高。此外，在使用cdna微陣列技術的大規模基因表達分析中，已經鑑定出，其為與正常的卵巢上皮相比在卵巢的重度乳頭狀癌中最為高度過度表達的基因組之一(非專利文獻14)。

進而，近年通過使用大腸癌細胞的模型證明了htrop-2在腫瘤形成中的重要作用(非專利文獻15)。htrop-2的表達促進腫瘤細胞的錨著非依賴性細胞增殖，是移植到免疫缺陷小鼠皮下的癌細胞的腫瘤形成及增殖所必需的，表明其可能是功能性腫瘤抗原，可能成為新的治療靶標。

截至目前，已經報告了幾種抗htrop-2抗體的抗腫瘤效果的研究。就rs7抗體(專利文獻1)而言，使用經放射性物質標記的抗體在體內模型中進行了試驗，在裸小鼠異種移植模型中顯示出抗腫瘤活性，但沒有報告僅抗體(裸抗體)時的抗腫瘤效果。

此外，報告了與細胞毒素結合的抗htrop-2單克隆抗體br110(專利文獻2)對於人癌細胞株h3619、h2987、mcf-7、h3396及h2981的體外實驗中的細胞毒性，但體內數據方面，對於裸抗體或br110的免疫複合物則均未公開。

近年還報導了：由通過用人卵巢癌組織免疫小鼠而得的雜交瘤細胞株ar47a6.4.2或ar52a301.5產生的分離單克隆抗體與htrop-2結合，初次以裸抗體形式顯示體外的細胞毒性，並且在裸小鼠異種移植模型中顯示抗腫瘤活性(專利文獻3和4)。但是，這些文獻中，在移植了胰臟癌細胞株bxpc-3及pl45、前列腺癌細胞pc-3、乳腺癌細胞mcf-7以及大腸癌細胞colo205的小鼠異種移植模型中，雖然僅抗體時顯示出抗腫瘤效果，但是除了在bxpc-3細胞移植中顯示出治療效果以外，均止步於通過抗體的預防性投與而部分地(約40～60％)抑制腫瘤形成及增殖，此外，所需抗體量也為20mg/kg左右，為非常高的用量。

由以上的現有技術，雖然已經明確抗htrop-2抗體可能作為抗腫瘤抗體，但同時所有的抗htrop-2抗體均並非是以裸抗體形式以抗體單獨在體內顯示出抗腫瘤效果，表明對htrop-2的作用根據抗體的結合位點、親和性、單克隆抗體的性質而不同。

專利文獻1：美國專利第6653104號

專利文獻2：美國專利第5840854號

專利文獻3：美國專利第7420040號

專利文獻4：美國專利第7420041號

非專利文獻1：faulkwp,etal.,proc.natl.acad.sci.usa,75(4),p.1947-1951(1978)

非專利文獻2：lipinskim,etal.,proc.natl.acad.sci.usa,78(8),p.5147-5150(1981)

非專利文獻3：linnenbachaj,etal.,proc.natl.acad.sci.usa,86(1),p.27-31(1989)

非專利文獻4：basua,etal.,int.j.cancer,62(4),p.472-479(1995)

非專利文獻5：fornarom,etal.,int.j.cancer,62(5),p.610-618(1995)

非專利文獻6：ripanie,etal.,int.j.cancer,76(5),p.671-676(1998)

非專利文獻7：calabreseg,etal.,cellgenet.,92(1-2),p.164-165(2001)

非專利文獻8：elsewedytetal.,int.j.cancer,75(2),p.324-330(1998)

非專利文獻9：cubasr,etal.,biochim.biophys.acta.,1796(2),p.309-314(2009)

非專利文獻10：ohmachitetal.,clin.cancerres.,12(10),p.3057-3063(2006)

非專利文獻11：fangyj,etal.,int.j.colorectaldis.,24(8),p.875-884(2009)

非專利文獻12：fongd,etal.,br.j.cancer,99(8),p.1290-1295(2008)

非專利文獻13：fongd,etal.,mod.pathol.,21(2),p.186-191(2008)

非專利文獻14：santinad,etal.,int.j.cancer,112(1),p.14-25(2004)

非專利文獻15：wangj,etal.,mol.cancerther.,7(2),p.280-285(2008)

技術實現要素：

發明要解決的問題

在這樣的狀況下，期望開發在體內具有高抗腫瘤活性的抗htrop-2抗體(抗htrop-2單克隆抗體)，具體而言，特別是以裸抗體形式在僅抗體時即具有在體內的抗腫瘤效果且以低用量具有該效果的抗htrop-2抗體、特別是人源化的該抗體等。

本發明是考慮了上述狀況而作出的，提供以下所示的抗htrop-2抗體(抗htrop-2單克隆抗體)、產生該抗體的雜交瘤、該抗體的片段、該抗體等與藥劑的複合物(immunoconjugate)、腫瘤的診斷用或治療用藥物組合物、腫瘤的檢測方法、腫瘤的檢測用或診斷用試劑盒等。

(1)一種抗人trop-2抗體，h鏈v區的胺基酸序列包含序列號92或98所示的胺基酸序列，l鏈v區的胺基酸序列包含序列號93所示的胺基酸序列。

上述(1)的抗體的h鏈v區的cdr1～3的胺基酸序列分別依次為序列號36～38所示的胺基酸序列、和/或抗體的l鏈v區的cdr1～3的胺基酸序列分別依次為序列號41～43所示的胺基酸序列。

(2)一種抗人trop-2抗體，h鏈v區的胺基酸序列包含序列號94或95所示的胺基酸序列，l鏈v區的胺基酸序列包含序列號96所示的胺基酸序列。

上述(2)的抗體的h鏈v區的cdr1～3的胺基酸序列分別依次為序列號66～68所示的胺基酸序列、和/或抗體的l鏈v區的cdr1～3的胺基酸序列分別依次為序列號71～73所示的胺基酸序列。

上述(1)和(2)的抗體可以列舉出例如人源化抗體。

上述(1)和(2)的抗體可以列舉出例如在體內具有抗腫瘤活性的抗體。

上述(1)和(2)的抗體可以列舉出例如以5～20mg/kg體重的投與量顯示50％以上的腫瘤生長抑制活性的抗體。這裡，用於顯示該腫瘤生長抑制活性的投與次數例如最多為每周1次。

上述(1)和(2)的抗體可以列舉出例如以10mg/kg體重的單次投與顯示50％以上的腫瘤生長抑制活性的抗體。

上述(1)和(2)的抗體可以列舉出例如對2種以上的人腫瘤細胞株具有抗腫瘤活性的抗體。

上述(1)和(2)的抗體可以列舉出例如解離常數(kd值)為1.0×10-10m以下的抗體。

上述(1)和(2)的抗體可以列舉出例如單克隆抗體。

這裡，作為上述腫瘤，可以列舉出例如選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人膽管癌組成的組中的至少1種，其中可以優選列舉出選自人胰癌、人大腸癌、人乳腺癌、人肺癌及人卵巢癌組成的組中的至少1種。

此外，作為上述腫瘤，可以列舉出例如復發癌或轉移癌。

此外，作為上述腫瘤細胞株，可以列舉出例如選自人胰癌細胞株pk-59、人胰癌細胞株bxpc-3、人胰癌細胞株kp-3l、人胰癌細胞株kp-2、人胰癌細胞株pk-1、人胰癌細胞株pk-45h、人胰癌細胞株pk-45p、人胰癌細胞株tcc-pan2、人胰癌細胞株suit-2、人大腸癌細胞株caco-2、人大腸癌細胞株sw480、人大腸癌細胞株dld-1、人大腸癌細胞株hct116、人乳腺癌細胞株jimt-1、人乳腺癌細胞株hcc1143、人乳腺癌細胞株mcf-7、人乳腺癌細胞株mda-mb-468、人前列腺癌細胞株du145及人前列腺癌細胞株pc-3、人肺癌細胞株calu-3、人卵巢癌細胞株sk-ov-3及人膽管癌細胞株tfk-1組成的組中的至少2種，其中可以優選列舉出選自人胰癌細胞株pk-59、人胰癌細胞株bxpc-3、人大腸癌細胞株sw480、人肺癌細胞株calu-3、人乳腺癌細胞株mda-mb-468及人卵巢癌細胞株sk-ov-3組成的組中的至少2種。

(3)來源於上述(1)和(2)的抗體的抗體片段。

上述(3)的抗體片段可以列舉出例如包含序列號92或98所示的胺基酸序列、和/或序列號93所示的胺基酸序列的片段；或者包含序列號94或95所示的胺基酸序列、和/或序列號96所示的胺基酸序列的片段。

(4)一種抗體-藥劑複合物，其包含上述(1)和(2)的抗體以及具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的物質。

(5)一種抗體片段-藥劑複合物，其包含上述(3)的抗體片段以及具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的物質。

在上述(4)和(5)的複合物中，作為腫瘤，可以列舉出例如選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人膽管癌組成的組中的至少1種，其中可以優選列舉出選自人胰癌、人大腸癌、人乳腺癌、人肺癌及人卵巢癌組成的組中的至少1種。此外，作為腫瘤，還可以列舉出例如復發癌或轉移癌。

(6)一種藥物組合物，其含有選自上述(1)和(2)的抗體、上述(3)的抗體片段、以及上述(4)和(5)的複合物組成的組中的至少1種。

上述(6)的藥物組合物可以列舉出例如用於腫瘤的治療的藥物組合物、沒有體重減少的副作用的組合物、用於腫瘤的診斷的組合物。這裡，作為腫瘤，可以列舉出例如選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人膽管癌組成的組中的至少1種，其中可以優選列舉出選自人胰癌、人大腸癌、人乳腺癌、人肺癌及人卵巢癌組成的組中的至少1種。此外，作為腫瘤，還可以列舉出復發癌或轉移癌。

(7)一種腫瘤治療劑，其包含選自上述(1)和(2)的抗體、上述(3)的抗體片段、以及上述(4)和(5)的複合物組成的組中的至少1種。

上述(7)的腫瘤治療劑可以列舉出例如沒有體重減少的副作用的腫瘤治療劑。這裡，作為腫瘤，可以列舉出例如選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人膽管癌組成的組中的至少1種，其中可以優選列舉出選自人胰癌、人大腸癌、人乳腺癌、人肺癌及人卵巢癌組成的組中的至少1種。

(8)一種腫瘤診斷劑，其包含選自上述(1)和(2)的抗體、上述(3)的抗體片段、以及上述(4)和(5)的複合物組成的組中的至少1種。

在上述(8)的腫瘤診斷劑中，作為腫瘤，可以列舉出例如選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人膽管癌組成的組中的至少1種，其中可以優選列舉出選自人胰癌、人大腸癌、人乳腺癌、人肺癌及人卵巢癌組成的組中的至少1種。

(9)一種腫瘤的檢測方法，其特徵在於，使選自上述(1)和(2)的抗體、上述(3)的抗體片段、以及上述(4)和(5)的複合物組成的組中的至少1種與由生物體採集的試樣反應，並檢測發生反應的抗體和/或抗體片段的信號。

在上述(9)的腫瘤的檢測方法中，作為腫瘤，可以列舉出例如選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人膽管癌組成的組中的至少1種，其中可以優選列舉出選自人胰癌、人大腸癌、人乳腺癌、人肺癌及人卵巢癌組成的組中的至少1種。

(10)一種腫瘤的治療用、診斷用或檢測用試劑盒，其包含選自上述(1)和(2)的抗體、上述(3)的抗體片段、以及上述(4)和(5)的複合物組成的組中的至少1種。

在上述(10)的腫瘤的治療用、診斷用或檢測用試劑盒中，作為腫瘤，可以列舉出例如選自人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人膽管癌組成的組中的至少1種，其中可以優選列舉出選自人胰癌、人大腸癌、人乳腺癌、人肺癌及人卵巢癌組成的組中的至少1種。

(11)編碼上述(1)和(2)的抗體的多核苷酸。

(12)編碼上述(3)的抗體片段的多核苷酸。

(13)包含上述(11)或(12)的多核苷酸的重組載體。

(14)包含上述(13)的重組載體的轉化體。

附圖說明

圖1為表示抗htrop-2單克隆抗體(k5-70)的抗原親和性(kd：解離常數)測定的圖。abt：抗體(總計)，agf：抗原(游離)

圖2為表示產生抗htrop-2單克隆抗體的雜交瘤培養上清的、與huh-7細胞(trop-2陰性)和huh-7-htrop-2細胞的反應性的圖。塗成黑色的柱狀圖表示huh-7細胞，黑色線的柱狀圖表示huh-7-htrop-2細胞。

圖3是表示抗htrop-2單克隆抗體的、與在細胞表面表達內源性htrop-2的人胰臟癌細胞株(pk-59細胞)的反應性的圖。塗成黑色的柱狀圖表示僅二抗(pe標記抗小鼠igg)，黑色線的柱狀圖表示與各抗htrop-2單克隆抗體反應。

圖4是表示抗htrop-2單克隆抗體的、與在細胞表面表達內源性htrop-2的人胰臟癌細胞株(bxpc-3細胞)的反應性的圖。塗成黑色的柱狀圖表示僅二抗(pe標記抗小鼠igg)、黑色線的柱狀圖表示與各抗htrop-2單克隆抗體反應。

圖5是表示抗htrop-2單克隆抗體(k5-70)與人胰臟癌細胞株的反應性的圖。塗成黑色的柱狀圖表示僅二抗(pe標記抗小鼠igg)、黑色線的柱狀圖表示與抗htrop-2單克隆抗體反應。

圖6是表示抗htrop-2單克隆抗體(k5-70)與人大腸癌細胞株(colo320，caco2，sw480，dld1，cw2，hct116)，人乳腺癌(jimt-1，hcc1143)及人前列腺癌細胞株(pc-3，du145)的反應性的圖。塗成黑色的柱狀圖表示僅二抗(pe標記抗小鼠igg)，黑色線的柱狀圖表示與抗htrop-2單克隆抗體反應。

圖7是調查抗htrop-2單克隆抗體與小鼠trop-2的交叉反應性的圖。細胞使用的是在cho-k1細胞中瞬時表達小鼠trop-2基因的細胞，作為陽性對照抗體，使用的是與小鼠trop-2顯示交叉性的t2-102抗體(小鼠igg1)。塗成黑色的柱狀圖表示僅二抗(pe標記抗小鼠igg)，黑色線的柱狀圖表示與各抗htrop-2單克隆抗體反應。

圖8是調查抗htrop-2單克隆抗體與人epcam/trop-1的交叉反應性的圖。細胞使用的是在cho-k1細胞中瞬時表達人epcam/trop-1基因的細胞，作為陽性對照抗體，使用的是pe標記抗人epcam單克隆抗體(becton，dickinsonandcompany)。塗成黑色的柱狀圖表示僅二抗(pe標記抗小鼠igg)，黑色線的柱狀圖表示與各抗htrop-2單克隆抗體反應。

圖9是表示抗htrop-2抗體(t6-16，t5-86，k5-70，k5-107)的人胰臟癌細胞株(pk-59細胞)的細胞增殖抑制活性的圖。migg表示對照抗體(小鼠igg)，yy01：市售的抗htrop-2抗體(santacruz)。白色柱：0μg/ml，灰色柱：0.1μg/ml,黑色柱：1μg/ml。以相對於不添加抗體(0μg/ml)時的值的比例來表示。誤差棒表示標準偏差。*p<0.05，**p<0.01(利用學生t檢驗)

圖10為表示抗htrop-2抗體(t6-16，k5-70)的人胰臟癌細胞株(pk-59細胞)的劃痕試驗的圖。

a.表示pk-59細胞的劃痕區域的照片的代表例。0天：表示剛劃痕後的代表例。migg(1天)：劃痕後在培養基中添加對照抗體(小鼠igg、1μg/ml)的1天後(24小時後)的照片。k5-70(1天)：表示劃痕後在培養基中添加k5-70抗體(1μg/ml)的1天後(24小時後)的照片。t6-16(1天)：表示劃痕後在培養基中添加t6-16抗體(1μg/ml)的1天後(24小時後)的照片。照片中所示箭頭表示劃痕區域的寬度。

b.通過圖像解析軟體(scionimage)解析劃痕區域的面積，以該值為基礎並將對照抗體(migg)添加組0天設為基準值1而算出各被測抗體中的值。

*p<0.05,**p<0.01(利用學生t檢驗)

圖11為表示人胰臟癌細胞株pk-59細胞的幹細胞標誌的表達的facs的圖。a：為表示pk-59細胞中的epcam的表達的facs的圖。塗成黑色的柱狀圖表示僅二抗(pe標記抗小鼠igg)，黑色線表示與抗人epcam抗體(becton，dickinsonandcompany)反應時的柱狀圖。b、c：表示pk-59細胞中的p-糖蛋白/mcr1(b)及abcg2(c)的表達的facs的圖。藍色的柱狀圖表示僅二抗，紅色的柱狀圖表示與抗人p-糖蛋白/mdr1抗體(bdpharmingen)(b)、抗人abcg2抗體(bdpharmingen)(c)反應的情況。d：為使用作為胰臟癌幹細胞標誌的fitc標記抗人cd24抗體(bdpharmingen)和pe標記抗人cd44抗體(bdpharmingen)對pk-59細胞進行二重染色的facs圖。d圖中的數字表示各組分的細胞的存在比例。

圖12為在使用pk-59細胞的異種移植治療模型中對新的抗htrop-2單克隆抗體克隆k5-70(小鼠igg2a)的抗腫瘤活性進行評價的圖。

a：表示對照組(●：小鼠igg)和k5-70抗體(10mg/kg體重)投與組(○)的腫瘤經時生長(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。*p<0.05，**p<0.01(利用學生t檢驗)

b：是對在a的試驗中第21天(21天)(實驗最後一天)時各小鼠的腫瘤重量作圖而得的圖。各曲線上所示的數值為平均值±標準偏差。**p<0.01(利用學生t檢驗)

圖13是在使用了pk-59細胞的異種移植治療模型中對a.克隆k5-107，b.克隆t6-16，c.克隆k5-116-2-1的抗腫瘤活性進行評價的圖。●表示對照組(小鼠igg)，○表示抗htrop-2抗體(10mg/kg體重)投與組。圖中的箭頭表示抗體投與期間，各曲線上所示的數值為平均值±標準偏差。*p<0.05(利用學生t檢驗)

圖14為在使用pk-59細胞的異種移植預防模型中對克隆k5-70(a)、克隆t6-16(b)及克隆k5-116-2-1(c)的抗腫瘤活性進行評價的圖。●表示對照組(小鼠igg)、○表示抗htrop-2抗體(10mg/kg體重)投與組。圖中的箭頭表示抗體投與期間，各曲線上所示的數值為平均值±標準偏差。**p<0.01(利用學生t檢驗)

圖15為在使用bxpc-3細胞的異種移植預防及治療模型中對克隆k5-70的抗腫瘤活性進行評價的圖。a：表示在預防模型中對照組(●：小鼠igg)和k5-70抗體(10mg/kg體重)投與組(○)的腫瘤經時生長(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。**p<0.01(利用學生t檢驗)b：表示在治療模型中對照組(●：小鼠igg)和k5-70抗體(10mg/kg體重)投與組(○)的腫瘤經時生長(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。*p<0.05(利用學生t檢驗)

圖16為表示在使用pk-59細胞的異種移植預防模型中克隆k5-70的用量依賴性的抗腫瘤活性的圖。腫瘤體積以平均值±標準偏差來表示。

a：表示對照組(●：小鼠igg)和各用量時的k5-70抗體投與組(□：1mg/kg體重、△：5mg/kg體重)的腫瘤經時生長(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。*p<0.05(利用學生t檢驗)，**p<0.01(利用學生t檢驗)

b：為對在a的試驗中第17天(17天)(實驗最後一天)時各小鼠的腫瘤重量作圖而得的圖。各曲線上所示的數值為平均值±標準偏差。**p<0.01(利用學生t檢驗)

圖17為實驗中使用的人/小鼠嵌合trop-2蛋白的示意圖。sp：信號序列，ty結構域：1型甲狀腺球蛋白區域(thyroglobulintype1region)，tm：跨膜區域，c：細胞內區域。用塗滿黑色表示的區域為來自於htrop-2的多肽。以白色空心表示的區域為來自於小鼠trop-2的多肽。嵌合蛋白的示意圖的上段所示數字表示小鼠trop-2蛋白的胺基酸號，下段表示htrop-2蛋白的胺基酸號。

圖18為使用人/小鼠嵌合trop-2的抗htrop-2單克隆抗體結合區域的鑑定結果圖。使用恆定表達人/小鼠嵌合trop2-c(hmtrop2-c)及小鼠/人嵌合trop2-d(mhtrop2-d)蛋白的hek293細胞，研究與圖中所示的抗htrop-2單克隆抗體的反應性。陰性對照使用的是小鼠igg2b。

圖19是表示抗htrop-2單克隆抗體的抗體結合區域的鑑定結果的圖。

使用將htrop-2基因及各人/小鼠嵌合trop-2基因導入hek293細胞並使其瞬時表達的細胞進行facs解析。對於(a)k5-70、k5-107、t5-86及k5-116-2-1抗體，研究與htrop-2(上段)、hmtrop-2-a(中段)及hmtrop-2-b(下段)的反應性。使用小鼠igg2b作為陰性對照。對於(b)t6-4和t6-16抗體，研究與htrop-2(上段)、mhtrop-2-e(中段)及mhtrop-2-f(下段)的反應性。使用小鼠igg2b作為陰性對照。

圖20是表示人正常組織中的htrop-2的表達的圖。使用抗htrop-2單克隆抗體克隆k5-63-17進行人正常組織陣列的免疫染色。(a)皮膚、(b)食道、(c)腎臟(皮質)、(d)腎臟(髓質)、(e)胰臟、(f)前列腺、(g)膀胱、(h)扁桃腺、(i)心臟、(j)肝臟(倍率：×200)

圖21是表示癌組織中的htrop-2的表達的圖。使用抗htrop-2單克隆抗體克隆k5-63-17進行人癌組織陣列的免疫染色。(a)乳腺癌、(b)肺癌、(c)食道癌、(d)胃癌、(e)胰臟癌、(f)大腸癌、(g)膀胱癌、(h)前列腺癌、(i)卵巢癌(倍率：×100)

圖22為表示在使用pk-59細胞的異種移植預防模型中單次投與克隆k5-70的抗腫瘤活性的圖。

a.表示對照組(●：小鼠igg)和k5-70抗體(10mg/kg體重)投與組(○)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。箭頭表示投與抗體。*p<0.05(利用學生t檢驗),**p<0.01(利用學生t檢驗)。

b.為對在a的試驗中第28天(28天)(實驗最後一天)時的各小鼠的腫瘤重量作圖而得的圖。**p<0.01(利用學生t檢驗)。

c.表示對照組(●：小鼠igg)和k5-70抗體(10mg/kg體重)投與組(○)的各個體的腫瘤經時形成。箭頭表示投與抗體。

圖23為表示克隆k5-70在使用人大腸癌細胞sw480細胞的異種移植治療模型中的抗腫瘤活性的圖。

a：表示對照組(●：小鼠igg)和k5-70抗體(10mg/kg體重)投與組(○)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。**p<0.01(利用學生t檢驗)

b：為對在a的試驗中第44天(44天)(實驗最後一天)時的各小鼠中的腫瘤重量作圖而得的圖。**p<0.01(利用學生t檢驗)

圖24是表示克隆k5-116-2-1在使用sw480細胞的異種移植治療模型中的抗腫瘤活性的圖。

a：表示對照組(●：小鼠igg)和k5-116-2-1抗體(10mg/kg體重)投與組(○)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。**p<0.01(利用學生t檢驗)

b：為對在a的試驗中第42天(42天)(實驗最後一天)時的各小鼠中的腫瘤重量作圖而得的圖。**p<0.01(利用學生t檢驗)

圖25為表示克隆t6-16在使用sw480細胞的異種移植治療模型中的抗腫瘤活性的圖。

a：表示對照組(●：小鼠igg)和t6-16抗體(10mg/kg體重)投與組(○)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。*p<0.05(利用學生t檢驗)

b：為對在a的試驗中第42天(42天)(實驗最後一天)時的各小鼠中的腫瘤重量作圖而得的圖。*p<0.05(利用學生t檢驗)

圖26為表示克隆k5-70在使用sw480細胞的異種移植治療模型中的用量依賴性的抗腫瘤活性的圖。

a：表示對照組(●：小鼠igg)和k5-70抗體投與組(○：1mg/kg體重，△：5mg/kg體重，□：10mg/kg體重)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。*p<0.05(利用學生t檢驗)

b：為對在a的試驗中第42天(42天)(實驗最後一天)時的各小鼠的腫瘤重量作圖而得的圖。*p<0.05(利用學生t檢驗)

圖27為表示克隆k5-70在使用sw480細胞的異種移植治療模型中的抗腫瘤活性的圖。

a：為表示每周1次的投與間隔時的k5-70抗體的抗腫瘤活性的圖。表示對照組(●：小鼠igg)和k5-70抗體(10mg/kg)投與組(○)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。箭頭(10，17，24，31，38天)表示k5-70抗體的投與。*p<0.05，利用學生t檢驗。

b：為表示每10天1次(q10d)、或每2周1次(q14d)的投與間隔時的k5-70抗體的抗腫瘤活性的圖。表示對照組(●：小鼠igg、10mg/kg)和k5-70抗體投與組(○：q10d、10mg/kg，△：q14d、10mg/kg)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。塗成黑色的箭頭(▼；9，19，29天)和空心的箭頭(▽；9，23，37天)表示投與k5-70抗體。*p<0.05，**p<0.01，利用學生t檢驗。

圖28為表示克隆t6-16在使用sw480細胞的異種移植治療模型中的用量依賴性的抗腫瘤活性的圖。

a：表示對照組(●：小鼠igg)和t6-16抗體投與組(○：1mg/kg體重，△：5mg/kg體重，□：10mg/kg體重)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。**p<0.01(利用學生t檢驗)

b：為對在a的試驗中第43天(43天)(實驗最後一天)時的各小鼠中的腫瘤重量作圖而得的圖。**p<0.01(利用學生t檢驗)

圖29為表示克隆t6-16在使用sw480細胞的異種移植治療模型中的抗腫瘤活性的圖。表示對照組(●：小鼠igg10mg/kg體重)、t6-16抗體(10mg/kg體重)投與組(○：q7d，△：q10d)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。箭頭(10，17，24，31，38天)、及箭頭(10，20，30，40天)表示投與t6-16抗體。對照組每3天進行1次投與。*p<0.05，**p<0.01，利用學生t檢驗。

圖30為表示克隆k5-70在使用人前列腺癌細胞du-145細胞的異種移植預防模型中的抗腫瘤活性的圖。

a：表示對照組(●：小鼠igg)和k5-70抗體(10mg/kg體重)投與組(○)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。*p<0.05(利用學生t檢驗)

b：為對在a的試驗中第40天(40天)(實驗最後一天)時的各小鼠的腫瘤重量作圖而得的圖。*p<0.05(利用學生t檢驗)

圖31為表示克隆k5-70在使用pk-59細胞的肝轉移模型的轉移抑制活性的圖。

a：表示細胞移植6周後對照組(●：小鼠igg)摘出的肝臟圖，b：表示細胞移植6周後k5-70抗體(10mg/kg體重)投與組摘出的肝臟圖。箭頭表示肝轉移灶。

圖32為表示k5-70在使用sw480細胞的異種移植模型中、在鹽酸伊立替康投與後癌復發模型中的抗腫瘤活性的圖。為表示無處置組(◆)、和鹽酸伊立替康(40mg/kg)投與後k5-70抗體(○：10mg/kg體重)、或小鼠igg投與組(●：10mg/kg體重)的腫瘤經時形成的圖(平均值±標準偏差)。箭頭(11，14，17天)表示投與鹽酸伊立替康。k5-70抗體或小鼠igg從第20天開始每3天進行1次投與。箭頭表示抗體投與期間。*p<0.05，**p<0.01，利用學生t檢驗。

圖33為表示克隆k5-70h鏈可變區(vh)的cdna鹼基序列(序列號34)和推定胺基酸序列(序列號35)的圖。信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的穀氨醯胺(q)表示成熟肽的n末端胺基酸殘基。cdr序列(下劃線；iywin，niypsdsytnynqkfkd，tsmady)按照kabat等(sequencesofproteinsofimmunologicalinterests，fifthedition，nihpublicationno.91-3242，u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定義來確定。克隆k5-70vh的cdr1～3的胺基酸序列依次如序列號36～38所示。

圖34為表示克隆k5-70l鏈可變區(vl)的cdna鹼基序列(序列號39)和推定胺基酸序列(序列號40)的圖。信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的天冬氨酸(d)表示成熟肽的n末端胺基酸殘基。cdr序列(下劃線；rasqsigtsih，yasesis，qqsnswpft)按照kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定義來確定。克隆k5-70vl的cdr1～3的胺基酸序列分別依次如序列號41～43所示。

圖35為表示克隆k5-107h鏈可變區(vh)的cdna鹼基序列(序列號44)和推定胺基酸序列(序列號45)的圖。信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的穀氨醯胺(q)表示成熟肽的n末端胺基酸殘基。cdr序列(下劃線；sywmh，niypgggytnydekfks，ssvfdy)按照kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定義來確定。克隆k5-107vh的cdr1～3的胺基酸序列分別依次如序列號46～48所示。

圖36為表示克隆k5-107l鏈可變區(vl)的cdna鹼基序列(序列號49)和推定胺基酸序列(序列號50)的圖。信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的天冬氨酸(d)表示成熟肽的n末端胺基酸殘基。cdr序列(下劃線；rasqnigtsih，yasesis，qqsnswpft)按照kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定義來確定。克隆k5-107vl的cdr1～3的胺基酸序列分別依次如序列號51～53所示。

圖37為表示克隆k5-116-2-1h鏈可變區(vh)的cdna鹼基序列(序列號54)和推定胺基酸序列(序列號55)的圖。信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的穀氨醯胺(q)表示成熟肽的n末端胺基酸殘基。cdr序列(下劃線；sywit，niypsdsytnynqkfrd，lfdy)按照kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定義來確定。克隆k5-116-2-1vh的cdr1～3的胺基酸序列分別依次如序列號56～58所示。

圖38為表示克隆k5-116-2-1l鏈可變區(vl)的cdna鹼基序列(序列號59)和推定胺基酸序列(序列號60)的圖。信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的天冬氨酸(d)表示成熟肽的n末端胺基酸殘基。cdr序列(下劃線；rasqsigtsih，yasesis，qqsnswpft)按照kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定義來確定。克隆k5-116-2-1vl的cdr1～3的胺基酸序列分別依次如序列號61～63所示。

圖39為表示克隆t6-16h鏈可變區(vh)的cdna鹼基序列(序列號64)和推定胺基酸序列(序列號65)的圖。信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的穀氨醯胺酸(e)表示成熟肽的n末端胺基酸殘基。cdr序列(下劃線；dynmh，yiypynggtgynqrfks，edygsspsyamdy)按照kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定義來確定。克隆t6-16vh的cdr1～3的胺基酸序列分別依次如序列號66～68所示。

圖40為表示克隆t6-16l鏈可變區(vl)的cdna鹼基序列(序列號69)和推定胺基酸序列(序列號70)的圖。信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的天冬氨酸(d)表示成熟肽的n末端胺基酸殘基。cdr序列(下劃線；rssqslvhgngntylh，kvsnrfs，sqtthvpt)按照kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定義來確定。克隆t6-16vl的cdr1～3的胺基酸序列分別依次如序列號71～73所示。

圖41為示出關於克隆k5-70的h鏈可變區(k5-70vh)的胺基酸序列(序列號35)、人源化k5-70的h鏈可變區(huk5-70vh)的胺基酸序列(序列號75)、及人源化抗體製作中使用的接納體(genbank登錄號no.da980102；序列號84)的h鏈可變區(da980102vh)的胺基酸序列(序列號85)的、比對的圖(予以說明，圖中的所有胺基酸序列均為各h鏈可變區的胺基酸序列的一部分(具體而言，除信號肽部分外的成熟蛋白部分的胺基酸序列)。)。

k5-70vh中以下劃線表示的胺基酸序列表示由kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991)所定義的cdr序列。此外，在胺基酸序列上部記載的編號表示根據上述kabat等的定義的胺基酸的位置號。da980102vh中的各cdr序列在圖中用---表示，省略了記載。huk5-70vh中的以下劃線表示的胺基酸被預測對cdr的結構維持很重要，因而維持了k5-70vh的序列。此外，關於huk5-70vh中的以雙下劃線表示的胺基酸，對應的da980102vh的胺基酸(蛋氨酸(m))在該位置較少見，為了降低抗原性，置換成屬於相同亞組的典型胺基酸亮氨酸(l)。

圖42為示出關於克隆k5-70的l鏈可變區(k5-70vl)的胺基酸序列(序列號40)、人源化k5-70的l鏈可變區(huk5-70vl)的胺基酸序列(序列號77)、及人源化抗體製作中使用的接納體(genbank登錄號no.l41174；序列號86)的l鏈可變區(l41174vl)的胺基酸序列(序列號87；genbank登錄號no.aaa64877)的、比對的圖(予以說明，圖中的所有胺基酸序列均為各l鏈可變區的胺基酸序列的一部分(具體而言，除信號肽部分外的成熟蛋白部分的胺基酸序列)。)。

k5-70vl中以下劃線表示的胺基酸序列表示由kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991)所定義的cdr序列。此外，在胺基酸序列上部記載的編號表示根據上述kabat等的定義的胺基酸的位置號。l41174vl中的各cdr序列在圖中用---表示，省略了記載。huk5-70vl中的以下劃線表示的胺基酸被預測對cdr的結構維持很重要，因而維持了k5-70vl的序列。

圖43為示出關於克隆t6-16的h鏈可變區(t6-16vh)的胺基酸序列(序列號65)、2種人源化t6-16的h鏈可變區(hut6-16vh1、hut6-16vh2)的胺基酸序列(分別依次為序列號79、序列號81)、及人源化抗體製作中使用的接納體(genbank登錄號no.da935238；序列號88)的h鏈可變區(da935238vh)的胺基酸序列(序列號89)的、比對的圖(予以說明，圖中的所有胺基酸序列均為各h鏈可變區的胺基酸序列的一部分(具體而言，除信號肽部分外的成熟蛋白部分的胺基酸序列)。)。

hut6-16vh中以下劃線表示的胺基酸序列表示由kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991)所定義的cdr序列。此外，在胺基酸序列上部記載的編號表示根據上述kabat等的定義的胺基酸的位置號。da935238vh中的各cdr序列在圖中用---表示，省略了記載。hut6-16vh1和hut6-16vh2中的以下劃線表示的胺基酸被預測對cdr的結構維持很重要，因而維持了t6-16vh的序列。此外，關於hut6-16vh1中的位於73位的位置的賴氨酸(k)，在hut6-16vh2中被置換成來自作為接納體序列的da935238vh的蘇氨酸(t)。

圖44為示出關於克隆t6-16的l鏈可變區(t6-16vl)的胺基酸序列(序列號70)、人源化t6-16的l鏈可變區(hut6-16vl)的胺基酸序列(序列號83)、及人源化抗體製作中使用的接納體(genbank登錄號no.m99608；序列號90)的l鏈可變區(m99608vl)的胺基酸序列(序列號91；genbank登錄號no.aaa60341)的、比對的圖(予以說明，圖中的所有胺基酸序列均為各l鏈可變區的胺基酸序列的一部分(具體而言，除信號肽部分外的成熟蛋白部分的胺基酸序列)。)。

t6-16vl中以下劃線表示的胺基酸序列表示由kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991)所定義的cdr序列。此外，在胺基酸序列上部記載的編號表示根據上述kabat等的定義的胺基酸的位置號。m99608vl中的各cdr序列在圖中用---表示，省略了記載。

圖45為表示huk5-70vh的基因序列(序列號74)及胺基酸序列(序列號75)的圖。

各行的上段表示基因序列(cdna序列)，下段表示胺基酸序列。該胺基酸序列中，信號肽部分畫有虛線的下劃線，各cdr序列(cdr1～3)畫有實線的下劃線(除去該信號肽部分的僅成熟蛋白部分的胺基酸序列示於序列號92)。予以說明，在huk5-70vh基因的5』末端附加了ecori位點(gaattc)及kozak序列(accacc)，在3』末端附加了nhei位點(gctagc)。

圖46為表示huk5-70vl的基因序列(序列號76)及胺基酸序列(序列號77)的圖。

各行的上段表示基因序列(cdna序列)，下段表示胺基酸序列。該胺基酸序列中，信號肽部分畫有虛線的下劃線，各cdr序列(cdr1～3)畫有實線的下劃線(除去該信號肽部分的僅成熟蛋白部分的胺基酸序列示於序列號93)。予以說明，在huk5-70vl基因的5』末端附加了agei位點(accggt)及kozak序列(accacc)，在3』末端附加了bsiwi位點(cgtacg)。

圖47為表示hut6-16vh1的基因序列(序列號78)及胺基酸序列(序列號79)的圖。

各行的上段表示基因序列(cdna序列)，下段表示胺基酸序列。該胺基酸序列中，信號肽部分畫有虛線的下劃線，各cdr序列(cdr1～3)畫有實線的下劃線(除去該信號肽部分的僅成熟蛋白部分的胺基酸序列示於序列號94)。予以說明，在hut6-16vh1基因的5』末端附加了ecori位點(gaattc)及kozak序列(accacc)，在3』末端附加了nhei位點(gctagc)。

圖48為表示hut6-16vh2的基因序列(序列號80)及胺基酸序列(序列號81)的圖。

各行的上段表示基因序列(cdna序列)，下段表示胺基酸序列。該胺基酸序列中，信號肽部分畫有虛線的下劃線，各cdr序列(cdr1～3)畫有實線的下劃線(除去該信號肽部分的僅成熟蛋白部分的胺基酸序列示於序列號95)。予以說明，在hut6-16vh2基因的5』末端附加了ecori位點(gaattc)及kozak序列(accacc)，在3』末端附加了nhei位點(gctagc)。

圖49為表示hut6-16vl的基因序列(序列號82)及胺基酸序列(序列號83)的圖。

各行的上段表示基因序列(cdna序列)，下段表示胺基酸序列。該胺基酸序列中，信號肽部分畫有虛線的下劃線，各cdr序列(cdr1～3)畫有實線的下劃線(除去該信號肽部分的僅成熟蛋白部分的胺基酸序列示於序列號96)。予以說明，在hut6-16vl基因的5』末端附加了agei位點(accggt)及kozak序列(accacc)，在3』末端附加了bsiwi位點(cgtacg)。

圖50為表示確認了huk5-70抗體、hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體的表達的結果圖。

(a)在293f細胞中導入表達載體pfuse-chig-huk5-70及pfuse2-clig-huk5-70，通過蛋白印跡法研究了培養上清中的huk5-70抗體的表達。條帶1為未進行基因導入的293f細胞的培養上清(陰性對照)，條帶2為導入了上述表達載體的293f細胞的培養上清。huk5-70抗體的重鏈及輕鏈蛋白質用生物素標記的抗人iggf(ab』)2抗體進行了檢測。

(b)以表達載體pfuse-chig-hut6-16-1及pfuse2-clig-hut6-16(條帶3)、pfuse-chig-hut6-16-2及pfuse2-clig-hut6-16(條帶4)的組合分別對293f細胞進行導入，通過蛋白印跡法研究了hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體的表達。hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體的重鏈蛋白質用生物素標記的抗人iggfc抗體進行了檢測，hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體的輕鏈蛋白質用生物素標記的抗人iggf(ab』)2抗體進行了檢測。

圖51為表示純化的huk5-70抗體、hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體的考馬斯亮藍染色的結果的圖。

利用sds-page將純化後的huk5-70抗體(條帶1)、hut6-16-1抗體(條帶2)及hut6-16-2抗體(條帶3)各1μg分別展開，進行考馬斯亮藍染色。

圖52為表示使用了流式細胞儀的huk5-70抗體、hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體的抗原結合能力的解析結果的圖。

使用圖中所示的各抗體，通過facs解析研究了對於hek293-htrop-2細胞(a)及pk-59細胞(b)的反應性。陰性對照為僅二抗(塗成黑色)，各抗體的反應性用灰色線表示。

圖53為表示使用了elisa法的huk5-70抗體的抗原結合能力的測定結果的圖。

通過抗原固相化elisa法對k5-70抗體及huk5-70抗體的抗原結合能力進行了研究。▲表示k5-70抗體的測定結果，●表示huk5-70抗體的測定結果。

圖54為表示使用了elisa法的hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體的抗原結合能力的測定結果的圖。

通過抗原固相化elisa法對t6-16抗體、hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體的抗原結合能力進行了研究。▲表示t6-16抗體的測定結果，●表示hut6-16-1抗體的測定結果，■表示hut6-16-2抗體的測定結果。

圖55為表示人源化抗htrop-2抗體(huk5-70抗體)在使用人大腸癌細胞sw480細胞的異種移植治療模型中的抗腫瘤活性的圖。

a：表示對照組(●：pbs)和huk5-70抗體(10mg/kg體重)投與組(○)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。*p<0.05,**p<0.01(利用學生t檢驗)

b：為對在a的試驗中第39天(39天)(實驗最後一天)時的各小鼠的腫瘤重量作圖而得的圖。*p<0.05(利用學生t檢驗)

圖56為表示人源化抗htrop-2抗體(huk5-70)在使用人大腸癌細胞sw480細胞的異種移植治療模型中的用量依賴性的抗腫瘤活性的圖。

a：表示對照組(●：pbs)和huk5-70抗體投與組(○：1mg/kg體重，△：5mg/kg體重，□：10mg/kg體重)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。**p<0.01(利用學生t檢驗)

b：為對在a的試驗中癌細胞移植後第48天(48天)(實驗最後一天)時的各小鼠中的腫瘤重量作圖而得的圖。**p<0.01(利用學生t檢驗)

圖57為表示人源化抗htrop-2抗體(hut6-16-2)在使用人大腸癌細胞sw480細胞的異種移植治療模型中的用量依賴性的抗腫瘤活性的圖。

a：表示對照組(●：pbs)和hut6-16-2抗體投與組(○：1mg/kg體重，△：5mg/kg體重，□：10mg/kg體重)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。**p<0.01(利用學生t檢驗)

b：為對在a的試驗中癌細胞移植後第48天(48天)(實驗最後一天)時的各小鼠中的腫瘤重量作圖而得的圖。**p<0.05(利用學生t檢驗)

圖58為表示小鼠抗htrop-2抗體(k5-70及t6-16)在使用人卵巢癌細胞sk-ov-3細胞的異種移植治療模型中的抗腫瘤活性的圖。

a：表示對照組(●：pbs)、k5-70抗體(10mg/kg體重)投與組(○)及t6-16抗體(10mg/kg體重)投與組(△)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。**p<0.01(利用學生t檢驗)

b：為對在a的試驗中癌細胞移植後第56天(56天)(實驗最後一天)時的各小鼠中的腫瘤重量作圖而得的圖。**p<0.05(利用學生t檢驗)

圖59為表示小鼠抗htrop-2抗體(k5-70及t6-16)在使用人乳腺癌細胞mda-mb-468細胞的異種移植治療模型中的抗腫瘤活性的圖。

a：表示對照組(●：pbs)、k5-70抗體(10mg/kg體重)投與組(○)及t6-16抗體(10mg/kg體重)投與組(△)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。**p<0.01(利用學生t檢驗)

b：為對在a的試驗中癌細胞移植後第54天(54天)(實驗最後一天)時的各小鼠中的腫瘤重量作圖而得的圖。*p<0.05，**p<0.01(利用學生t檢驗)

圖60為表示小鼠抗htrop-2抗體(k5-70及t6-16)在使用人肺癌細胞calu-3細胞的異種移植治療模型中的抗腫瘤活性的圖。

a：表示對照組(●：pbs)、k5-70抗體(10mg/kg體重)投與組(○)及t6-16抗體(10mg/kg體重)投與組(△)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。*p<0.05，**p<0.01(利用學生t檢驗)

b：為對在a的試驗中癌細胞移植後第41天(41天)(實驗最後一天)時的各小鼠中的腫瘤重量作圖而得的圖。*p<0.05，**p<0.01(利用學生t檢驗)

圖61為表示小鼠抗htrop-2抗體k5-70在使用人膽管癌細胞tfk-1細胞的異種移植預防模型中的抗腫瘤活性的圖。

a：表示對照組(●：pbs)及k5-70抗體(10mg/kg體重)投與組(○)的腫瘤經時形成(平均值±標準偏差)。箭頭表示抗體投與期間。**p<0.01(利用學生t檢驗)

b：為對在a的試驗中癌細胞移植後第31天(31天)(實驗最後一天)時的各小鼠中的腫瘤重量作圖而得的圖。**p<0.01(利用學生t檢驗)

圖62為利用低濃度抗原固相化elisa對huk5-70及hut6-16-2抗體的結合活性進行研究的結果。將96孔板用0.1μg/ml的重組htacstd2-fc-his蛋白進行包覆，從20μg/ml開始製備各2倍的稀釋系列，使所得到的被測抗體(k5-70、huk5-70、t6-16及hut6-16-2抗體)反應。(a)使用k5-70(▲)及huk5-70(●)抗體作為被測抗體，(b)使用t6-16(▲)及hut6-16-2抗體(●)作為被測抗體。

圖63為表示htrop-2對於k5-70及huk5-70抗體的結合活性的elisa的結果。在96孔板中通過抗小鼠igg(γ鏈特異性的)及抗人igg1(fcγ特異性的)將k5-70及huk5-70抗體固相化，使從5μg/ml開始製備2倍稀釋系列而得到的htrop-2-ec-his蛋白反應。利用抗his標籤抗體檢測了htrop-2-ec-his蛋白的結合。(▲)k5-70抗體、(●)huk5-70抗體

圖64為表示通過基因合成製作的k5-70vh基因的鹼基序列(上段；序列號99)和k5-70vh的胺基酸序列(下段；序列號35)的圖。該鹼基序列中，在5』末端附加了ecori位點(gaattc)及kozak序列(accacc)，在3』末端附加了nhei位點(gctagc)。該胺基酸序列用單個字母標記表示，n末端側的信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的穀氨醯胺(q)表示成熟肽的n末端胺基酸殘基。cdr序列(下劃線；iywin，niypsdsytnynqkfkd，tsmady)按照kabat等(sequencesofproteinsofimmunologicalinterests，fifthedition，nihpublicationno.91-3242，u.s.departmentofhealthandhumanservices，1991)的定義來確定。克隆k5-70vh的cdr1～3的胺基酸序列分別依次如序列號36～38所示。

圖65為表示通過基因合成製作的k5-70vl基因的鹼基序列(上段；序列號100)和k5-70vl的胺基酸序列(下段；序列號40)的圖。該鹼基序列中，在5』末端附加了agei位點(accggt)及kozak序列(accacc)，在3』末端附加了bsiwi位點(cgtacg)。該胺基酸序列用單個字母標記表示，n末端側的信號肽用斜體表示。畫有雙下劃線的天冬氨酸(d)表示成熟肽的n末端胺基酸殘基。cdr序列(下劃線；rasqsigtsih，yasesis，qqsnswpft)按照kabat等(如上所述；u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991)的定義來決定。克隆k5-70vl的cdr1～3的胺基酸序列分別依次如序列號41～43所示。

圖66為表示chk5-70、huk5-70、huvh/muvl(將huk5-70抗體的vl置換成k5-70抗體的vl)及muvh/huvl(將huk5-70抗體的vh置換成k5-70抗體的vh)抗體對於htrop-2的結合活性的圖。將96孔板用0.1μg/ml的重組htacstd2-fc-his蛋白包覆，將瞬時表達被測抗體(chk5-70、huk5-70、huvh/muvl及muvh/huvl抗體)的細胞的培養上清按照1、0.1、0.01、0.001μg/ml的抗體濃度進行稀釋並使其反應。(▲)chk5-70抗體、(△)muvh/huvl抗體、(○)huvh/muvl抗體、(●)huk5-70抗體

圖67為表示huk5-70vh及其胺基酸置換突變體的胺基酸序列的圖。胺基酸用單個字母標記表示。各胺基酸置換突變體中，與huk5-70vh的胺基酸相同的胺基酸用「-「表示，僅所置換的胺基酸用單個字母標記表示。序列上部的數字表示胺基酸號(kabat等1991)。

圖68為表示chk5-70、huk5-70、huk5-70vha40r(將huk5-70抗體的vh的40位的丙氨酸置換成精氨酸的突變體)及huk5-70vhr44g抗體(將huk5-70抗體的vh的44位的精氨酸置換成甘氨酸的突變體)對於htrop-2的結合活性的圖的。將96孔板用0.1μg/ml的重組htacstd2-fc-his蛋白進行包覆，將瞬時表達被測抗體(chk5-70、huk5-70、huk5-70vha40r及huk5-70vhr44g抗體)的細胞的培養上清從0.5μg/ml開始製作2倍稀釋系列(6點)並使其反應。(▲)chk5-70抗體、(△)huk5-70vhr44g抗體、(○)huk5-70vha40r抗體、(●)huk5-70抗體

圖69為表示通過基因合成製作的huk5-70vhr44g基因的鹼基序列(上段)和胺基酸序列(下段)。在5』末端附加了ecori位點(gaattc)及kozak序列(accacc)，在3』末端附加了nhei位點(gctagc)。胺基酸序列用單個字母標記表示。n末端的信號肽用斜體表示，成熟vh的n末端側的胺基酸(q：穀氨醯胺)用雙下劃線表示，cdr序列(kabat等、1991)用下劃線表示。

圖70為純化huk5-70-2抗體的sds-page的圖。在還原條件下利用11％sds-page凝膠展開huk5-70-2抗體1μg。條帶1：分子量標誌(precisionplusdualstandard(bio-rad))，條帶2：huk5-70-2抗體。圖的左側的數值表示分子量。

圖71為表示k5-70、huk5-70及huk5-70-2抗體對於htrop-2的結合活性的圖。將96孔板用0.1μg/ml的重組htacstd2-fc-his蛋白進行包覆，將純化後的被測抗體(k5-70、huk5-70及huk5-70-2抗體)從1μg/ml開始製作2倍稀釋系列(10點)並使其反應。(■)k5-70抗體、(△)huk5-70-2抗體、(●)huk5-70抗體

圖72a為表示使用人源化抗htrop-2抗體(白色柱：huk5-70，黑色柱：hut6-16-2)的adcc活性的圖。詳細而言，表示在人大腸癌細胞株sw480中加入huk5-70抗體及hut6-16-2抗體(均為0、0.1、0.3、1、3、10μg/ml)和健康人末梢血單核細胞並培養6小時，測定釋放至培養上清的ldh的活性，從而測定adcc活性的結果(平均值±標準誤差(n＝3)，：效靶比(e/t)＝40)。抗體濃度0表示不添加抗體。*p<0.05，**p<0.01(利用學生t檢驗)

圖72b為表示使用人源化抗htrop-2抗體(白色柱：huk5-70，灰色柱：huk5-70-2，黑色柱：hut6-16-2)的adcc活性的圖。詳細而言，表示在人胰臟癌細胞株(pk-59)中加入huk5-70抗體、huk5-70-2抗體及hut6-16-2抗體(均為0、0.3、1、3、10、30μg/ml)和健康人末梢血單核細胞並培養6小時，測定釋放至培養上清的ldh的活性，從而測定adcc活性的結果(平均值±標準誤差(n＝3)，：效靶比(e/t)＝40)。抗體濃度0表示不添加抗體。**p<0.01(利用學生t檢驗)

圖72c為表示使用人源化抗htrop-2抗體(白色柱：huk5-70，灰色柱：huk5-70-2，黑色柱：hut6-16-2)的adcc活性的圖。詳細而言，表示在人前列腺癌細胞株(pc-3)中加入huk5-70抗體、huk5-70-2抗體及hut6-16-2抗體(均為0、0.3、1、3、10、30μg/ml)和健康人末梢血單核細胞並培養6小時，測定釋放至培養上清的ldh的活性，從而測定adcc活性的結果(平均值±標準誤差(n＝3)，：效靶比(e/t)＝40)。抗體濃度0表示不添加抗體。**p<0.01(利用學生t檢驗)

具體實施方式

以下詳細說明本發明。本發明的範圍不受這些說明限制，除了以下例示以外，也可以在不損害本發明主旨的範圍內適當變更實施。

予以說明，本說明書包括作為本申請優先權基礎的美國臨時申請61/562,672號說明書(2011年11月22日提出申請)的全體。此外，本說明書所引用的全部的出版物如現有技術文獻及公開公報、專利公報以及其它專利文獻均作為參照而引入本說明書中。

1.本發明的概要

如前所述，人trop-2(htrop-2)是由全長323胺基酸殘基構成的1次跨膜型的1型膜蛋白。並且已知htrop-2基因及其基因產物在各種癌細胞中表達。

如前所述，希望開發出在體內具有高抗腫瘤活性的抗htrop-2抗體(抗htrop-2單克隆抗體)等的狀況下，本發明人從極其眾多的克隆中進行篩選，從而成功地獲得了在體內具有高抗腫瘤活性的克隆。具體而言，本發明提供在體內特異性識別htrop-2的細胞外區域的單克隆抗體，特別是提供顯示皮摩爾級別(pm)的高親和性的單克隆抗體。與現有的抗htrop-2抗體相比，本發明的抗體為：以僅裸抗體投與時，在更少的用量(例如1/20投與量)下具有顯著的腫瘤生長抑制活性，且在使用多種人癌細胞的荷瘤小鼠治療模型中顯示顯著的腫瘤生長抑制活性的抗htrop-2單克隆抗體(特別是人源化抗體)，從這方面來看是極其有用的。

2.抗htrop-2抗體的製作

(1)抗原的製備

htrop-2的胺基酸序列(序列號2)信息在例如ncbi(genbank)網站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中以「登錄號：np_002344」公布。予以說明，編碼htrop-2的胺基酸序列的鹼基序列(序列號1)的信息在該網站中以「登錄號：nm002353」公布。

作為抗原，可以使用包含htrop-2的胺基酸序列的至少一部分(全部或一部分)的多肽或肽(也簡稱為肽)，可以優選使用包含htrop-2的細胞外區域的胺基酸序列的至少一部分(全部或一部分)的肽。htrop-2的細胞外區域(包括信號肽)是指包含序列號2所示的胺基酸序列中的第1位～第274位的胺基酸的區域(信號肽：第1位～第26位的胺基酸)。這裡，對用作抗原的肽而言，上述「胺基酸序列的至少一部分」的長度沒有特別限定，優選例如包含序列號2所示的胺基酸序列中的第1位～第145位的胺基酸的區域、包含該胺基酸序列中的第146位～第274位的胺基酸的區域等。

作為抗原的肽的製作方法可以是化學合成，也可以通過採用大腸桿菌等的基因工程法合成，可以使用本領域技術人員公知的方法。

進行肽的化學合成時，可以通過肽合成的公知方法進行合成。此外，其合成也可以使用固相合成法和液相合成法中的任意一種。還可以使用市售的肽合成裝置(例如，島津製作所制：pssm-8等)。

在用基因工程學方式合成肽時，首先設計併合成編碼該肽的dna。該設計和合成例如可以使用以包含全長htrop-2基因的載體等作為模板，使用設計為可以合成所希望的dna區域的引物，通過pcr法進行。然後，通過將上述dna連接到適當的載體上而獲得蛋白質表達用重組載體，將該重組載體導入宿主中並使得目的基因可以表達，由此獲得轉化體(sambrookj.etal.，molecularcloning，alaboratorymanual，3rdedition，coldspringharborlaboratorypress，2001)。

使用可以在宿主微生物中自我增殖的噬菌體或質粒作為載體。而且還可以使用動物病毒、昆蟲病毒載體。重組載體的製作可如下進行，即用適當的限制酶切斷純化的dna，插入適當的載體dna的限制酶位點等中而與載體連接。作為轉化時使用的宿主，只要是可以表達目的基因的宿主即可，沒有特別的限定。例如，可以列舉細菌(大腸桿菌、枯草桿菌等)、酵母、動物細胞(cos細胞、cho細胞等)、昆蟲細胞或昆蟲。還可以使用山羊等哺乳動物作為宿主。向宿主導入重組載體的方法是公知的。

然後，培養前述轉化體，從其培養物中收集作為抗原使用的肽。「培養物」是指(a)培養上清、(b)培養細胞或者培養菌體或其破碎物中的任意一種。

培養後，目的肽在菌體內或細胞內產生時，通過破碎菌體或細胞來提取肽。而且，目的肽在菌體外或細胞外產生時，直接使用培養液或通過離心分離等除去菌體或細胞。然後，可以通過單獨使用可以在肽的分離純化中使用的一般的生物化學方法，例如硫酸銨沉澱、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析等或將這些方法組合使用，來分離純化目的肽。

本發明中，還可以使用無細胞合成系統，通過體外翻譯獲得作為抗原的肽。此時，可以使用以rna作為模板的方法和以dna作為模板的方法(轉錄/翻譯)這2種方法。作為無細胞合成系統，可以使用市售的系統，例如expresswaytm系統(invitrogen公司)、puresystem(註冊商標；postgenome研究所)、tnt系統(註冊商標；promega公司)等。

如上所述獲得的肽還可以結合到適當的載體蛋白質，例如牛血清白蛋白(bsa)、鑰孔血藍蛋白(keyholelimpethemocyanin，klh)、人甲狀腺球蛋白、雞γ-球蛋白等。

另外，抗原可以是在htrop-2的胺基酸序列(序列號2)或前述的其部分序列中缺失、置換或添加了1個或多個胺基酸的胺基酸序列而構成的肽。例如，還可以使用htrop-2的胺基酸序列或其部分序列中缺失1個或多個(優選1個或多個(例如1個～10個，更優選1個～5個))胺基酸、1或多個(優選1個或多個(例如1個～10個，更優選1個～5個))胺基酸被其它胺基酸置換、或添加了1個或多個(優選1個或多個(例如1個～10個，更優選1個～5個))其它胺基酸的胺基酸序列所構成的肽。

本發明中，作為用於導入於細胞等的基因，可以列舉編碼htrop-2蛋白或其部分片段的基因、或編碼其突變型的蛋白質或片段的基因。作為這種基因，例如可以使用具有序列號1所示的鹼基序列或其部分序列的基因。

另外，作為用於導入於細胞等的基因，還可以使用與序列號1所示的鹼基序列互補的序列在嚴緊條件下雜交，且編碼具有htrop-2活性的蛋白質的鹼基序列或其部分序列。

「嚴緊條件」是指雜交後洗滌時的條件，緩衝液的鹽(鈉)濃度為10～500mm，溫度為42℃～72℃，優選上述鹽濃度為50～300mm，溫度為55～68℃的條件。

為了在基因中導入突變，可以通過kunkel法或帶缺口的雙鏈體(gappedduplex)法等公知方法進行，例如使用利用定點突變法的突變導入用試劑盒如genetailortmsite-directedmutagenesissystem(invitrogen公司制)、takarasite-directedmutagenesissystem(mutan-k、mutan-superexpresskm等：takarabio公司制)來進行。

(2)多克隆抗體的製作

將製備的抗原投與到用於免疫的哺乳動物。哺乳動物沒有特別限定，例如可以列舉大鼠、小鼠和兔等，其中優選小鼠。

每一隻動物的抗原投與量，可以根據佐劑的有無適當設定。作為佐劑，可以列舉弗氏完全佐劑(fca)、弗氏不完全佐劑(fia)、氫氧化鋁佐劑等。免疫主要可以通過注入到靜脈內、腳掌、皮下、腹腔內等來進行。而且，免疫的間隔沒有特別限定，以數天至數周的間隔、優選以1周的間隔進行1～10次、優選進行2～3次免疫。然後，在最後的免疫日起3～7天後，通過酶免疫測定法(elisa或eia)或放射性免疫測定法(ria)等測定抗體效價，可以在出現所希望的抗體效價之日採血，獲得抗血清。在上述抗體的提取方法中，在需要純化抗體時，可以通過適當選擇或組合硫酸銨鹽析法、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等公知方法來進行純化。然後，通過elisa法等測定抗血清中的多克隆抗體的反應性。

(3)單克隆抗體的製作

(3-1)抗體產生細胞的提取

本發明的抗htrop-2抗體並沒有限制，但優選為單克隆抗體。

將製備的抗原投與用於免疫的哺乳動物，例如大鼠、小鼠和兔等。每隻動物的抗原投與量可以根據有無佐劑適當設定。佐劑與上述同樣。免疫方法也與前述同樣。而且，在最後的免疫日起1～60天後，優選為1～14天後，提取抗體產生細胞。作為抗體產生細胞，可以列舉脾細胞、淋巴結細胞和末梢血細胞等，其中優選淋巴結細胞和脾臟細胞。

(3-2)細胞融合

為了獲得雜交瘤(抗體產生細胞株)，進行抗體產生細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合。作為與抗體產生細胞融合的骨髓瘤細胞，可以使用小鼠等動物的一般可以獲得的已建立的細胞株。作為使用的細胞株，優選具有藥劑篩選性，具有未融合的狀態下在hat選擇培養基(含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脫氧核苷)中無法生存而只有在與抗體產生細胞融合的狀態下可以生存的性質的細胞株。

作為骨髓瘤細胞，例如可以列舉p3-x63-ag8.653、p3-x63-ag8(x63)、p3-x63-ag8.u1(p3u1)、p3/nsi/1-ag4-1(ns1)和sp2/0-ag14(sp2/0)等小鼠骨髓瘤細胞株。骨髓瘤細胞的選擇可以適當考慮與抗體產生細胞的適合性而進行。

然後，使骨髓瘤細胞與抗體產生細胞進行細胞融合。細胞融合時，在不含血清的dmem和rpmi-1640培養基等動物細胞用培養基中，混合1×106～1×107個/ml的抗體產生細胞和2×105～2×106個/ml的骨髓瘤細胞。抗體產生細胞與骨髓瘤細胞的細胞比(抗體產生細胞：骨髓瘤細胞)沒有限制，但通常優選為1：1～10：1，更優選為3：1。然後，在細胞融合促進劑的存在下進行融合反應。作為細胞融合促進劑，例如可以使用平均分子量為1000～6000道爾頓(d)的聚乙二醇等。而且，還可以使用利用電刺激(例如電穿孔)的市售的細胞融合裝置，使抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合。

(3-3)雜交瘤的挑選和克隆

從細胞融合處理後的細胞中挑選出目的雜交瘤。作為該方法，將細胞懸浮液用例如含有胎牛血清的rpmi-1640培養基等適當稀釋後，接種於微孔培養板上，在各孔中加入選擇培養基，以後適當更換選擇培養基進行培養。其結果是，在選擇培養基中開始培養後，可以將14天前後開始生長的細胞作為雜交瘤。

然後，在逐步增殖的雜交瘤的培養上清中，篩選是否存在與htrop-2反應的抗體。雜交瘤的篩選可以按照通常的方法，沒有特別限制。例如，可以採集已長出雜交瘤的孔中所含的培養上清的一部分，通過elisa、eia和ria等進行篩選。

融合細胞的克隆可以通過有限稀釋法等進行。通過流式細胞術等判斷與htrop-2顯示出強反應性的抗體，選擇產生該抗體的雜交瘤，建立克隆。

(3-4)單克隆抗體的提取

作為培養已建立的雜交瘤並從獲得的培養物中提取單克隆抗體的方法，可以採取通常的細胞培養法或腹水形成法等。「培養」是指在培養皿或培養瓶中使雜交瘤生長，或如下使雜交瘤在動物的腹腔內增殖。

細胞培養法中，可以在含有10％胎牛血清的rpmi-1640培養基、mem培養基或無血清培養基等動物細胞培養的培養基中，在通常的培養條件(例如37℃、5％co2濃度)下培養雜交瘤7～14天，從其培養上清中獲得抗體。

腹水形成法的情況下，在與骨髓瘤細胞來源的哺乳動物同種系動物的腹腔內投與約1×107個雜交瘤，使雜交瘤大量增殖。並且，優選在2～3周後提取腹水。

在上述抗體的提取方法中，在需要純化抗體時，可以通過適當選擇或組合硫酸銨鹽析法、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析等公知方法來進行純化。

(3-5)具有抗腫瘤活性的克隆的挑選

本發明的抗htrop-2抗體是在體內具有抗腫瘤活性的抗體。

這裡，「抗腫瘤活性」是指使腫瘤細胞(癌細胞)死亡的活性或抑制腫瘤生長的活性。作為抗腫瘤活性，例如可優選列舉癌細胞增殖抑制活性、腫瘤血管生成抑制活性。此外，作為本發明的抗體可以發揮抗腫瘤活性的人腫瘤(腫瘤細胞)的種類，可以列舉已確認htrop-2的表達的公知的各種人腫瘤，沒有特別限定，可以優選列舉出例如人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人膽管癌等各種人腫瘤中的1種或2種以上，更優選為人胰癌、人大腸癌、人前列腺癌、人大腸癌、人乳腺癌、人卵巢癌及人肺癌中的1種或2種以上，進一步優選為人胰癌和/或人大腸癌。進而，作為上述腫瘤的種類，還可以是復發癌、轉移癌，本發明的抗體對於這些腫瘤也可以發揮優異的抗腫瘤活性。

在體內的抗腫瘤活性的確認，例如可以使用在小鼠的皮下移植了所希望的腫瘤細胞的荷瘤小鼠(荷瘤動物治療模型)，通過對該小鼠投與前述獲得的抗體來進行。此時，抗體的投與可以在腫瘤細胞的移植後立即進行(預防模型)，也可以在確認移植腫瘤達到預定體積之後進行(治療模型)。投與方法並沒有限制，例如可以以每3天1次、1周1次、10天1次或2周1次或單次(僅一次)，以5～20mg/kg體重進行腹腔內投與等。預防模型的情況下，可以通過腫瘤形成頻率和腫瘤體積評價抗腫瘤活性的有無和水平。治療模型的情況下，可以根據腫瘤體積評價抗腫瘤活性的有無和水平。

本發明中，作為在體內具有抗腫瘤活性的抗htrop-2抗體，可以優選列舉出例如h鏈v區的cdr1～3的胺基酸序列分別依次為序列號36～38所示的胺基酸序列、和/或l鏈v區的cdr1～3的胺基酸序列分別依次為序列號41～43所示的胺基酸序列的抗體。作為該h鏈v區，優選例如包含序列號35所示的胺基酸序列的區域，作為該l鏈v區，優選例如包含序列號40所示的胺基酸序列的區域。

此外，作為本發明的抗htrop-2抗體的其它形態，可以優選列舉例如h鏈v區的cdr1～3的胺基酸序列分別依次為序列號46～48所示的胺基酸序列、和/或l鏈v區的cdr1～3的胺基酸序列分別依次為序列號51～53所示的胺基酸序列的抗體。作為該h鏈v區，優選例如包含序列號45所示的胺基酸序列的區域，作為該l鏈v區，優選例如包含序列號50所示的胺基酸序列的區域。

同樣地，作為本發明的抗htrop-2抗體的其它形態，可以優選列舉例如h鏈v區的cdr1～3的胺基酸序列分別依次為序列號56～58所示的胺基酸序列、和/或l鏈v區的cdr1～3的胺基酸序列分別依次為序列號61～63所示的胺基酸序列的抗體。作為該h鏈v區，優選例如包含序列號55所示的胺基酸序列的區域，作為該l鏈v區，優選例如包含序列號60所示的胺基酸序列的區域。

同樣地，作為本發明的抗htrop-2抗體的其它形態，可以優選列舉例如h鏈v區的cdr1～3的胺基酸序列分別依次為序列號66～68所示的胺基酸序列，和/或l鏈v區的cdr1～3的胺基酸序列分別依次為序列號71～73所示的胺基酸序列的抗體。作為該h鏈v區，可以列舉出例如包含序列號65所示的胺基酸序列的區域，作為該l鏈v區，可以列舉出例如包含序列號70所示的胺基酸序列的區域。

在本發明中，作為在體內具有抗腫瘤活性的抗htrop-2抗體，更具體而言，可以優選列舉出例如由保藏號為fermbp-11251的雜交瘤產生的抗htrop-2單克隆抗體(克隆名：k5-70)、由保藏號為fermbp-11252的雜交瘤產生的抗htrop-2單克隆抗體(克隆名：k5-107)、由保藏號為fermbp-11253的雜交瘤產生的抗htrop-2單克隆抗體(克隆名：k5-116-2-1)、由保藏號為fermbp-11346的雜交瘤產生的抗htrop-2單克隆抗體(克隆名：t6-16)及由保藏號為fermbp-11254的雜交瘤產生的抗htrop-2單克隆抗體(克隆名：t5-86)等。

這裡，保藏號為fermbp-11251的雜交瘤命名為「小鼠-小鼠雜交瘤(mouse-mousehybridoma)k5-70」，於2010年5月12日保藏，保藏號為fermbp-11252的雜交瘤命名為「小鼠-小鼠雜交瘤(mouse-mousehybridoma)k5-107」，於2010年5月12日保藏，保藏號為fermbp-11253的雜交瘤命名為「小鼠-小鼠雜交瘤(mouse-mousehybridoma)k5-116-2-1」，於2010年5月12日保藏，保藏號為fermbp-11346的雜交瘤命名為「小鼠-小鼠雜交瘤(mouse-mousehybridoma)t6-16」，於2011年3月1日保藏，保藏號為fermbp-11254的雜交瘤命名為「小鼠-小鼠雜交瘤(mouse-mousehybridoma)t5-86」，於2010年5月12日保藏，均保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(〒305-8566茨城縣筑波市東1-1-1中央第6)。

進而，作為本發明的抗htrop-2抗體，還可以優選列舉出例如與由保藏號為fermbp-11251、fermbp-11252、fermbp-11253、fermbp-11346或fermbp-11254的雜交瘤產生的單克隆抗體所結合(識別)的位點(例如表位)結合的抗htrop-2抗體。作為表位，可以優選列舉出下述(3-6)項中例示的表位。

(3-6)抗htrop-2抗體的表位

本發明的抗htrop-2抗體的表位(抗原決定簇)只要是抗原htrop-2的至少一部分即可，沒有特別限制，例如優選為序列號2所示的htrop-2的胺基酸序列中的、除由第252位～第260位的胺基酸構成的區域外的區域的至少一部分，更優選為包含第1位～第69位的胺基酸的區域的至少一部分或包含第100位～第274位的胺基酸的區域(由第252位～第260位的胺基酸構成的區域除外)的至少一部分，進一步優選為包含第27位～第69位的胺基酸的區域的至少一部分或包含第109位～第206位的胺基酸的區域的至少一部分。作為上述表位，特別優選包含序列號2所示的htrop-2的胺基酸序列中的第43位～第65位的胺基酸的區域、包含序列號2所示的htrop-2的胺基酸序列中的第152位～第165位的胺基酸的區域、包含序列號2所示的htrop-2的胺基酸序列中的第171位～第183位的胺基酸的區域、包含序列號2所示的htrop-2的胺基酸序列中的第109位～第120位的胺基酸的區域、包含序列號2所示的htrop-2的胺基酸序列中的第193位～第206位的胺基酸的區域、及包含序列號2所示的htrop-2的胺基酸序列中的第43位～第56位的胺基酸的區域、以及包含上述區域的部分，其中特別優選的是包含序列號2所示的htrop-2的胺基酸序列中的第43位～第65位的胺基酸的區域、包含序列號2所示的htrop-2的胺基酸序列中的第152位～第165位的胺基酸的區域、包含序列號2所示的htrop-2的胺基酸序列中的第171位～第183位的胺基酸的區域、及包含序列號2所示的htrop-2的胺基酸序列中的第109位～第120位的胺基酸的區域、以及包含上述區域的部分。識別該區域的(與該區域或包含該區域的部分結合的)抗htrop-2抗體例如對腫瘤細胞內的內化活性高，在後述的免疫交聯物等用途中極為有用。

(3-7)抗htrop-2抗體的特性

如前所述，本發明的抗htrop-2抗體為以低用量在體內具有高抗腫瘤活性的抗體。具體而言，優選對於荷瘤動物模型以20mg/kg體重以下(優選10mg/kg體重以下，更優選5mg/kg體重以下，進一步優選1mg/kg體重以下)的投與量(裸抗體)顯示50％以上(優選80％以上，更優選90％以上，進一步優選95％以上、特別優選幾乎100％(例如98％以上或99％以上))的腫瘤生長抑制活性。

這裡，腫瘤生長抑制活性(％)例如可以通過下式算出。

腫瘤生長抑制活性(％)＝100－〔(抗體投與組的腫瘤體積或腫瘤重量)÷(對照組的腫瘤體積或腫瘤重量)〕×100

此外，本發明的抗htrop-2抗體優選對2種以上人腫瘤細胞株具有抗腫瘤活性。作為人腫瘤細胞株，沒有限定，可以列舉出例如選自各種人胰癌細胞株、人前列腺癌細胞株、人大腸癌細胞株、人乳腺癌細胞株、人卵巢癌細胞株、人肺癌細胞株及人膽管癌細胞株組成的組中的至少2種，具體而言，可以優選列舉出選自人胰癌細胞株pk-59、人胰癌細胞株bxpc-3、人胰癌細胞株kp-3l、人胰癌細胞株kp-2、人胰癌細胞株pk-1、人胰癌細胞株pk-45h、人胰癌細胞株pk-45p、人胰癌細胞株tcc-pan2、人胰癌細胞株suit-2、人大腸癌細胞株caco-2、人大腸癌細胞株sw480、人大腸癌細胞株dld-1、人大腸癌細胞株hct116、人乳腺癌細胞株jimt-1、人乳腺癌細胞株hcc1143、人乳腺癌細胞株mcf-7、人乳腺癌細胞株mda-mb-468、人前列腺癌細胞株du145、人前列腺癌細胞株pc-3、人卵巢癌細胞株sk-ov-3、人肺癌細胞株calu-3及人膽管癌細胞株tfk-1組成的組中的至少2種。其中，作為前述2種以上人腫瘤細胞株，可以更優選列舉出選自人胰癌細胞株pk-59、人胰癌細胞株bxpc-3、人大腸癌細胞株sw480、人肺癌細胞株calu-3、人乳腺癌細胞株mda-mb-468及人卵巢癌細胞株sk-ov-3組成的組中的至少2種。

進而，本發明的抗htrop-2抗體優選解離常數(kd值)為1.0×10-10m以下，更優選1.0×10-11m以下，進一步優選1.0×10-12m以下。這裡，抗體的結合能力(親和性)例如可以通過斯卡查德分析(scatchardanalysis)、稱為biacore的表面等離子體共振傳感器來測定解離常數(kd值)、解離速率常數(kdiss[1/秒])、結合速率常數(kass[1/m.秒])。作為biacore裝置，可以列舉出例如biacore3000、biacore2000、biacorex、biacorej、biacoreq(均為biacore公司)等。就抗體而言，解離常數(kd值)值越小則結合能力(親和性)越強則越優選。kd值可以由kdiss及kass兩個參數確定，例如可以用式：kd[m]＝kdiss/kass表示。予以說明，kd值的計算方法還可以優選採用後述實施例(具體為實施例10)中所述方法。

(4)基因重組抗體和抗體片段

(4-1)基因重組抗體

作為本發明的抗htrop-2抗體的優選方式之一，可以列舉基因重組抗體。作為基因重組抗體，沒有限制，但例如可以列舉嵌合抗體、人源化抗體和人抗體等。

嵌合抗體(即人源化嵌合抗體)是小鼠源抗體的可變區連接(接合)到人來源的恆定區的抗體(參照proc.natl.acad.sci.u.s.a.81，6851-6855,(1984)等)，在製作嵌合體時，可以通過基因重組技術容易地構建，從而獲得這樣連接的抗體。

在製作人源化抗體時，通過從小鼠抗體的可變區將互補性決定區(cdr)移植到人可變區，框架區(fr)為人來源，cdr由小鼠來源的cdr構成，製備重構的可變區(即cdr移植(cdrgrafting))。然後，將這些人源化的重構的人可變區與人恆定區連接。這種人源化抗體的製作方法在本領域中是眾所周知的(參照nature，321，522-525(1986)；j.mol.biol.，196，901-917(1987)；queencetal.，proc.natl.acad.sci.usa，86：10029-10033(1989)；日本特表平4-502408號公報(日本特許第2828340號公報；queen等)等)。

這裡，作為本發明的人源化抗htrop-2抗體中可以使用的小鼠來源的cdr序列，並沒有限定，例如，作為h鏈v區(vh)的cdr1～3可以優選列舉出(分別依次為)序列號36～38所示的胺基酸序列、序列號66～68所示的胺基酸序列，作為l鏈v區(vl)的cdr1～3可以優選列舉出(分別依次為)序列號41～43所示的胺基酸序列、序列號71～73所示的胺基酸序列。

此外，在人源化的重構人可變區中，作為h鏈v區的胺基酸序列，例如可以優選列舉出序列號92所示的胺基酸序列(包含由序列號36～38所示的胺基酸序列構成的cdr1～3；進而包含信號肽的胺基酸序列如序列號75所示)、序列號98所示的胺基酸序列(包含由序列號36～38所示的胺基酸序列構成的cdr1～3；進而包含信號肽的胺基酸序列如序列號97所示)、序列號94所示的胺基酸序列(包含由序列號66～68所示的胺基酸序列構成的cdr1～3；進而包含信號肽的胺基酸序列如序列號79所示)、及序列號95所示的胺基酸序列(包含由序列號66～68所示的胺基酸序列構成的cdr1～3；進而包含信號肽的胺基酸序列如序列號81所示)。這裡，上述序列號98所示的h鏈v區的胺基酸序列為將上述的序列號92所示的h鏈v區的胺基酸序列的第44位的精氨酸(r)置換成甘氨酸(g)的突變型的胺基酸序列。

同樣地，在人源化的重構人可變區中，作為l鏈v區的胺基酸序列，例如可以優選列舉出序列號93所示的胺基酸序列(包含由序列號41～43所示的胺基酸序列構成的cdr1～3；進而包含信號肽的胺基酸序列如序列號77所示)、及序列號96所示的胺基酸序列(包含由序列號71～73所示的胺基酸序列構成的cdr1～3；進而包含信號肽的胺基酸序列如序列號83所示)。

這裡，作為本發明的人源化抗htrop-2抗體的形態，例如優選下述形態：(i)h鏈v區的胺基酸序列包含序列號92所示的胺基酸序列、且l鏈v區的胺基酸序列包含序列號93所示的胺基酸序列的形態；(ii)h鏈v區的胺基酸序列包含序列號98所示的胺基酸序列、且l鏈v區的胺基酸序列包含序列號93所示的胺基酸序列的形態。其中，h鏈v區的胺基酸序列為序列號98所示的胺基酸序列的上述(ii)的人源化抗htrop-2抗體的親合力(avidity)(即，與2個抗原結合臂的運動能力相關的柔軟性)進一步提高，抗原結合活性高，因而特別優選。

同樣地，作為本發明的人源化抗htrop-2抗體的其它形態，例如優選下述形態：(iii)h鏈v區的胺基酸序列包含序列號94所示的胺基酸序列、且l鏈v區的胺基酸序列包含序列號96所示的胺基酸序列的形態；(iv)h鏈v區的胺基酸序列包含序列號95所示的胺基酸序列、且l鏈v區的胺基酸序列包含序列號96所示的胺基酸序列的形態。

關於人抗體(完全人抗體)，一般是v區的抗原結合位點即高變區(hypervariableregion)，v區的其它部分和恆定區的結構具有與人的抗體相同的結構。但是，高變位點也可以來源於其它動物。製作人抗體的技術也是公知的，已建立了通過基因工程學的手法來製作人共通的基因序列的方法。人抗體例如可以通過使用含有具有人抗體的h鏈和l鏈基因的人染色體片段的人抗體產生小鼠的方法(參照tomizuka，k.etal.，naturegenetics，(1977)16，133-143；kuroiwa，y.et.al.，nuc.acidsres.，(1998)26，3447-3448；yoshida，h.et.al.，animalcelltechnology：basicandappliedaspects,(1999)10，69-73(kitagawa，y.,matuda，t.andiijima，s.eds.)，kluweracademicpublishers；tomizuka，k.et.al.，proc.natl.acad.sci.usa，(2000)97，722-727等)和獲得從人抗體文庫挑選的噬菌體展示來源的人抗體的方法(參照wormstone，i.m.et.al，investigativeophthalmology&visualscience.，(2002)43(7)，2301-8；carmen，s.et.al.，briefingsinfunctionalgenomicsandproteomics,(2002)1(2)，189-203；siriwardena，d.et.al.，opthalmology，(2002)109(3)，427-431等)而獲得。

關於上述嵌合抗體、人源化抗體和人抗體，優選為抗體fc區域中的n-糖苷鍵複合型糖鏈為該糖鏈的還原末端的n-乙醯葡糖胺不與巖藻糖結合的糖鏈，具體而言可以列舉在抗體分子的fc區域中具有該巖藻糖的1位不與n-糖苷鍵複合型糖鏈還原末端的n-乙醯氨基葡萄糖的6位發生α結合的糖鏈的基因重組抗體分子所構成的抗體。如果是這種抗體，則可以使adcc活性極大提高。而且，前述的多克隆抗體和單克隆抗體同樣優選這一點(抗體fc區域中n-糖苷鍵複合型糖鏈的特徵)。

(4-2)抗體片段

本發明的抗htrop-2抗體的片段(部分片段)也包含在本發明的抗體中。其中，本發明的抗體片段與本發明的抗htrop-2抗體一樣，具有與htrop-2結合的活性(即可以結合到htrop-2上)，在體內具有抗腫瘤活性。

作為該抗體的片段，是指抗htrop-2多克隆抗體或抗htrop-2單克隆抗體的一部分的區域(即，來源於本發明的抗htrop-2抗體的抗體片段)，例如，可以列舉fab、fab』、f(ab』)2、fv(抗體可變區)、單鏈抗體(h鏈、l鏈、h鏈v區和l鏈v區等)、scfv、雙抗體(diabody)(scfv二聚物)、dsfv(二硫化物穩定化v區)和至少一部分含有互補性決定區(complementaritydeterminingregion：cdr)的肽等。

fab是用蛋白質分解酶中的木瓜蛋白酶處理抗體分子而獲得的片段中，h鏈的n末端側約一半和l鏈全體通過二硫鍵結合的、分子量約為5萬的具有抗原結合活性的抗體片段。而且，還可以通過將編碼抗體的fab的dna插入於原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，通過將該載體導入到原核生物或真核生物而使之表達，製造fab。

f(ab』)2是用蛋白質分解酶中的胃蛋白酶處理抗體分子而獲得的片段中，fab通過鉸鏈區的二硫鍵結合的稍大的、分子量約為10萬的具有抗原結合活性的抗體片段。而且，還可以通過使後述的fab形成硫醚鍵或二硫鍵進行製作。

fab』是切斷上述f(ab』)2的鉸鏈區的二硫鍵的、分子量約為5萬的具有抗原結合活性的抗體片段。而且，還可以通過將編碼抗體的fab』片段的dna插入於原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，通過將該載體導入於原核生物或真核生物而使之表達，製造fab』。

scfv是將1條h鏈v區(vh)和1條l鏈v區(vl)用適當的肽連接子(p)連接的vh-p-vl或vl-p-vh多肽，其是具有抗原結合活性的抗體片段。scfv可以如下製備，即，獲得編碼抗體的vh和vl的cdna，構建編碼scfv的dna，將該dna插入於原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，再將該表達載體導入於原核生物或真核生物中使之表達而進行製造。

雙抗體是scfv二聚化形成的抗體片段，其為具有二價的抗原結合活性的抗體片段。二價的抗原結合活性可以是相同的，也可以是其中一方為不同的抗原結合活性。雙抗體可以如下製備，即，獲得編碼抗體的vh和vl的cdna，構建編碼scfv的dna並使p的胺基酸序列的長度達到8個殘基以下，將該dna插入於原核生物用表達載體或真核生物用表達載體，再將該表達載體導入於原核生物或真核生物使之表達而進行製造。

dsfv是指使vh和vl中的各1個胺基酸殘基被置換成半胱氨酸殘基的多肽通過該半胱氨酸殘基間的二硫鍵結合形成的抗體。被置換成半胱氨酸殘基的胺基酸殘基可以按照reiter等人公開的方法(proteinengineering，7，697-704，1994)，基於抗體的立體結構預測進行選擇。dsfv可以如下製備：獲得編碼抗體的vh和vl的cdna，構建編碼dsfv的dna，將該dna插入到原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，再將該表達載體導入於原核生物或真核生物中使之表達而進行製造。

含有cdr的肽包含vh的cdr(cdr1～3)及vl的cdr(cdr1～3)中的至少1個以上區域而構成，更優選包含vh的全部cdr的肽、及包含vl的全部cdr的肽，特別優選包含vh及vl的全部cdr(共6個區域)的肽。作為cdr的胺基酸序列，可以優選列舉例如前述序列號36～38、41～43、46～48、51～53、56～58、61～63、66～68及71～73所示的胺基酸序列。包含多個cdr的肽可以直接或介由適當的肽連接子結合。含有cdr的肽可以通過構建編碼抗體的vh和vl的cdr的dna，將該dna插入原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，再將該表達載體導入原核生物或真核生物中使之表達而進行製造。此外，含有cdr的肽還可以通過fmoc法(芴甲氧羰基法)和tboc法(叔丁氧羰基法)等化學合成法來製造。

作為本發明的抗體片段，可以是以原有的形狀含有n-糖苷鍵複合型糖鏈為該糖鏈的還原末端的n-乙醯葡糖胺不與巖藻糖結合的糖鏈的抗體fc區域的一部分或全部的抗體片段，而且，也可以是上述抗體片段與n-糖苷鍵複合型糖鏈為該糖鏈的還原末端的n-乙醯氨基葡萄糖不與巖藻糖結合的糖鏈的抗體fc區域的一部分或全部的融合蛋白質。這種抗體片段可以極大地提高adcc活性，因而優選。

以下，在本說明書中的說明中，上述抗體片段也包含於本發明的抗htrop-2抗體中。

3.多核苷酸、重組載體及轉化體

本發明中，還可以提供編碼上述本發明的抗htrop-2抗體、其抗體片段的多核苷酸(基因、dna)。作為該多核苷酸，具體而言，優選為包含編碼作為上述本發明的抗htrop-2抗體或抗體片段的例示所示出的各胺基酸序列的鹼基序列的多核苷酸。此外，本發明的多核苷酸可以僅由編碼本發明的抗htrop-2抗體、抗體片段的多核苷酸構成，也可以一部分包含該多核苷酸、除此以外還包含基因表達所需要的公知的鹼基序列(轉錄啟動子、sd序列、kozak序列、終止子等)，並沒有限定。

作為編碼本發明的抗htrop-2抗體、抗體片段的多核苷酸，與翻譯後的各胺基酸對應的密碼子沒有特別限定，轉錄後，可以包含表示在人等哺乳類中一般使用的密碼子(優選使用頻率高的密碼子)的核苷酸dna，此外，還可以包含表示在大腸桿菌或酵母等微生物、植物等中一般使用的密碼子(優選使用頻率高的密碼子)的核苷酸dna。

本發明中，還可以提供包含上述本發明的多核苷酸的重組載體、包含該重組載體的轉化體。

對於作為重組載體使用的表達載體中引入的多核苷酸(基因、dna)，可以根據需要預先在上遊連接轉錄啟動子、sd序列(宿主為原核細胞的情況)及kozak序列(宿主為真核細胞的情況)，可以在下遊連接終止子，除此以外還可以預先連接增強子、剪接信號、多聚腺苷酸附加信號、選擇標誌等。予以說明，上述轉錄啟動子等基因表達所需要的各要素可以從最初包含於該多核苷酸中，原本包含於表達載體中的情況下也可以對其進行利用，各要素的使用形態沒有特別限定。

作為在表達載體中引入該多核苷酸的方法，例如可以採用使用限制酶的方法、使用拓撲異構酶的方法等利用了公知的基因重組技術的各種方法。此外，作為表達載體，只要是例如質粒dna、噬菌體dna、逆轉錄轉座子dna、逆轉錄病毒載體、人工染色體dna等能夠保持編碼本發明的抗htrop-2抗體、其抗體片段的多核苷酸(基因、dna)則沒有限定，可以適宜選擇使用適合於所使用的宿主細胞的載體。

然後，將所構建的上述重組載體導入宿主中而得到轉化體，對其進行培養，由此可以使本發明的抗htrop-2抗體、其抗體片段表達。予以說明，本發明中所說的「轉化體」是指宿主中導入有外來基因的物質，例如包括通過在宿主中導入質粒dna等(轉化)而導入有外來基因的物質；以及，通過使各種病毒和噬菌體感染宿主(轉導)而導入有外來基因的物質。

作為宿主，只要是導入有上述重組載體後能夠表達本發明的抗htrop-2抗體、其抗體片段則沒有限定，可以適宜選擇，可以列舉出例如人或小鼠等各種動物細胞、各種植物細胞、細菌、酵母、植物細胞等公知的宿主。

將動物細胞作為宿主時，使用例如人成纖維細胞、人胚胎腎細胞、hek293細胞、293f細胞、cho細胞、猴細胞cos-7、vero(非洲綠猴腎細胞)、小鼠l細胞、大鼠gh3、人fl細胞等。此外，還可以使用sf9細胞、sf21細胞等昆蟲細胞。

將細菌作為宿主時，使用例如大腸桿菌、枯草桿菌等。

將酵母作為宿主時，使用例如啤酒酵母(saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)等。

將植物細胞作為宿主時，使用例如菸草by-2細胞等。

得到轉化體的方法沒有限定，可以考慮宿主與表達載體的種類的組合而適宜選擇，例如可以優選列舉出電穿孔法、脂質轉染法、熱休克法、peg法、磷酸鈣法、deae葡聚糖法、以及感染dna病毒或rna病毒等各種病毒的方法等。

在得到的轉化體中，重組載體所包含的多核苷酸的密碼子型可以與所使用的宿主的密碼子型一致、也可以不同，沒有限定。

4.抗體-藥劑複合物的製作

作為使用上述本發明的抗htrop-2抗體的免疫交聯物等，可以提供含有該抗體以及具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的物質(化合物等)的抗體-藥劑複合物。予以說明，在預先分別製備該抗體分子以及具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的物質之後，將它們複合化而獲得的物質一般被稱為免疫交聯物。而且，通過使用基因重組技術，將具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的物質中的蛋白質毒素在基因上與抗體基因連接，作為1個蛋白質(融合蛋白質)表達而獲得的物質一般被稱為免疫毒素。

作為具有抗腫瘤活性的物質，可以列舉出例如阿黴素(doxorubicin)、卡奇黴素(calicheamicin)、絲裂黴素(mitomycin)c、auristatine、放射性同位素(ri)等。作為具有細胞殺傷活性的物質，可以列舉出例如皂草素、篦麻毒素、綠膿桿菌外毒素、白喉毒素、放射性同位素(ri)等，其中優選使用皂草素和綠膿桿菌外毒素。予以說明，作為具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的ri，沒有限定，可以列舉出例如90y、111in、125i、3h、35s、14c、186re、188re、189re、177lu、67cu、212bi、213bi、211at、198au、224ac、126i、133i、77br、113min、95ru、97ru、103ru、105ru、107hg、203hg、94mtc、121mte、122mte、125mte、165tm、167tm、168tm、111ag、197pt、109pd、32p、33p、47sc、153sm、177lu、105rh、142pr、143pr、161tb、166ho、199au、57co、58co、51cr、59fe、18f、75se、201tl、225ac、76br、86y、169yb、166dy、212pb及223ra等。

作為抗體-藥劑複合物的製作方法並沒有限定，例如可以列舉通過二硫鍵或腙鍵將抗體與藥劑偶聯的方法等。

上述本發明的抗htrop-2抗體在對表達htrop-2的目標腫瘤細胞內的內化活性方面優異。因此，通過預先使具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的物質複合化，可以使這些物質直接且高選擇地作用於腫瘤細胞。本發明的抗體-藥劑複合物在向目標腫瘤細胞傳送藥劑的能力上極為優異。

予以說明，對細胞內的內化活性可以如下評價，即，通過用羅丹明等對抗體進行螢光標記，用螢光顯微鏡等觀察向細胞內的進入舉動和抗體的定位性。

另外，本發明中還可以提供在抗體-藥劑複合物中使用前述抗體片段代替抗體的抗體片段-藥劑複合物。抗體片段-藥劑複合物的詳細內容可以適當應用上述抗體-藥劑複合物的說明。

以下，在本說明書的說明中，抗體片段-藥劑複合物也包含於本發明的抗體-藥劑複合物中。

5.藥物組合物

本發明的抗htrop-2抗體和抗體-藥劑複合物作為包含於藥物組合物中的有效成分是有用的。

該藥物組合物作為腫瘤的治療用和/或診斷用的藥物組合物是有用的。尤其是，由於本發明的抗htrop-2抗體和含有該抗體的抗體-藥劑複合物具有作為抗腫瘤活性的優異的腫瘤生長抑制活性，因此優選在腫瘤的治療用中使用。即，本發明的抗htrop-2抗體和抗體-藥劑複合物作為包含於腫瘤治療劑和腫瘤診斷劑中的有效成分是有用的。予以說明，本發明中，上述腫瘤的治療還包括抑制腫瘤生長和阻遏腫瘤生長的意思，具體而言，例如若為腫瘤治療劑，則還包括腫瘤生長抑制劑(tumorgrowthinhibitor)和腫瘤生長阻遏劑(tumorgrowthsuppressor)的形態。

本發明的藥物組合物優選以含有本發明的抗htrop-2抗體和/或抗體-藥劑複合物作為有效成分、而且包含藥學上允許的載體的藥物組合物的形態提供。此外，本發明的藥物組合物還可以與公知的抗腫瘤劑並用。通過並用，可以獲得更好的抗腫瘤效果。

作為本發明的藥物組合物的適用對象疾病(腫瘤)，可以列舉確認了表達htrop-2的前述公知的各種人腫瘤。其中，特別優選列舉人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌、人乳腺癌、人卵巢癌、人肺癌及人膽管癌等各種人腫瘤中的1種或2種以上。這些疾病可以是單獨的，也可以是2種以上並發。此外，作為對象的腫瘤還可以是復發癌、轉移癌，本發明的藥物組合物(進而，本發明的抗htrop-2抗體和/或抗體-藥劑複合物)可以有效用作復發癌、轉移癌的治療劑和診斷劑。

所謂「藥學上允許的載體」，可以列舉賦形劑、稀釋劑、增量劑、崩解劑、穩定劑、防腐劑、緩衝劑、乳化劑、芳香劑、著色劑、甜味劑、粘稠劑、矯味劑、增溶劑或其它添加劑等。通過使用1種以上這種載體，可以製備注射劑、液劑、膠囊劑、懸浮劑、乳劑或糖漿劑等形態的藥物組合物。這些藥物組合物可以經口或非經口投與。作為用於非經口投與的其它形態，包括含有1種以上的活性物質的通過常規方法製備的注射劑等。注射劑的情況中，可以通過溶解或懸浮於生理鹽水或市售的注射用蒸餾水等藥學上允許的載體中來製造。

尤其是，對生物體內投與本發明的抗htrop-2抗體來源的抗體片段(其中尤其是低分子的物質)時，在其基礎上還可以使用膠體分散系。膠體分散系可期待具有提高化合物(抗體片段)在生物體內穩定性的效果和將化合物高效輸送到特定的內臟器官、組織或細胞的效果。膠體分散系只要為通常使用的膠體分散系即可，沒有限制，可以列舉聚乙二醇、高分子複合物、高分子凝集體、納米膠囊、微球體、珠子和水包油系的乳化劑、膠束、混合膠束和以包含脂質體在內的脂質為基礎的分散系，優選為具有將化合物高效輸送到特定臟器、組織或細胞的效果的多個脂質體、人工膜的小囊泡(manninoetal.，biotechniques，1988，6，682；blumeandcevc，biochem.etbiophys.acta，1990，1029，91；lappalainenetal.，antiviralres.，1994，23，119；chonnandcullis，currentop.biotech.，1995，6，698)。

本發明的藥物組合物的投與量根據患者的年齡、性別、體重和症狀、治療效果、投與方法、處理時間或藥物組合物所含的本發明的抗htrop-2抗體和抗體-藥劑複合物的種類等而不同。通常，成人每人每次可以在600μg到6000mg的範圍內投與，但並不限於此範圍。

例如通過注射劑投與時，對人患者1次的投與中，可以每1kg體重平均1天以1次～數次投與100μg～100mg的量，還可以優選採用每3天、1周、10天或2周投與1次或單次(總計投與次數為1次)投與的方式。作為投與的形態，可以列舉靜脈內注射、皮下注射、皮內注射、肌肉內注射或腹腔內注射等，優選為靜脈內注射。而且，注射劑根據情況還可以調製成非水性的稀釋劑(例如聚乙二醇、橄欖油等植物油、乙醇等醇類等)、懸浮劑或乳濁劑。這種注射劑的無菌化可以通過過濾器進行過濾殺菌、配合殺菌劑等來進行。注射劑可以製備成使用時調製的形態。即，可以通過冷凍乾燥法等製成無菌的固體組合物，在使用前溶解於無菌的注射用蒸餾水或其它溶劑中使用。

另外，本發明還提供用於製造治療和/或診斷腫瘤的藥物(藥劑)的前述本發明的抗htrop-2抗體和/或抗體-藥劑複合物的應用。而且，本發明還提供治療和/或診斷腫瘤用的前述本發明的抗htrop-2抗體和/或抗體-藥劑複合物。

此外，本發明還提供腫瘤的治療和/或診斷方法，其特徵在於，其使用前述本發明的抗htrop-2抗體和/或抗體-藥劑複合物(即投與患者)，而且，還提供前述本發明的抗htrop-2抗體和/或抗體-藥劑複合物在用於治療和/或診斷腫瘤中的應用。

6.腫瘤的檢測方法

本發明的腫瘤檢測方法的特徵在於，使前述本發明的抗htrop-2抗體與從生物體採集的試樣(以下稱生物體試樣)反應，檢測發生反應的抗體的信號。

如前所述，由於確認了htrop-2在各種腫瘤細胞中特異性表達，htrop-2、尤其是游離htrop-2(htrop-2的細胞外區域部分)可以作為各種腫瘤標誌來使用。其中，優選作為人胰癌、人前列腺癌、人大腸癌和人乳腺癌的標誌來使用。

因此，可以通過使本發明的抗htrop-2抗體與生物體試樣反應，檢測發生反應的抗體的信號來檢測腫瘤。獲得的抗體的信號成為生物體試樣中的抗原量(即htrop-2量或游離htrop-2量)的指標。關於使用本發明的抗體的腫瘤的檢測，首先，使作為試樣的從被驗者中提取的生物體試樣，例如作為檢查對象的組織片或血液等與本發明的抗體通過抗原抗體反應結合。然後，基於結合的抗體量的測定結果測定生物體試樣中的目的抗原量，從而進行。該測定可以按照公知的免疫學測定法進行，可以使用例如免疫沉澱法、免疫凝集法、標記免疫測定法、免疫比濁法、蛋白印跡法、流式細胞術法等。標記免疫測定法中，抗體的信號除了以用標記抗體直接檢測的標記量表示之外，還可以以已知濃度或已知抗體效價的抗體作為標準液相對地表示。即，可以通過測定計測定標準液和試樣，以標準液的值作為基準，相對地表示生物體試樣中的抗體信號。作為標記免疫測定法，可以列舉例如elisa法、ei法、ria法、螢光免疫測定(fia)法、化學發光免疫測定法(luminescenceimmunoassay)等。其中elisa法由於簡便和高靈敏度而尤其優選。

本發明中，可以將通過上述檢測方法獲得的檢測結果作為指標來評價或診斷腫瘤的狀態。例如，檢測結果超過預定的基準值時判斷為腫瘤陽性，在預定的基準值以下時判斷為腫瘤陰性，為陽性時，判斷為有發生任意一種腫瘤的可能性，可以評價腫瘤的狀態。這裡，所謂腫瘤的狀態是指是否患有腫瘤或其進行程度，可以列舉腫瘤發病的有無、進行度、惡性程度、轉移的有無和復發的有無等。

在上述評價時，作為腫瘤的狀態，可以選擇1個，也可以組合選擇多個。關於腫瘤的有無的評價，可以基於所獲得的檢測結果，通過以預定的基準值作為界限，判斷是否患有腫瘤來進行。腫瘤的惡性程度是表示癌進行到何種程度的指標，也可以基於檢測結果，對病期(stage)分類再進行評價，或分類為早期癌或晚期癌再進行評價。例如，還可以將檢測結果作為指標，評價為早期癌或晚期癌。關於腫瘤的轉移，可以通過以檢測結果作為指標，根據在從原發瘤的位置離開的位點是否出現新生物來評價。復發可以根據在間歇期或緩解後檢測結果是否再次超過預定的基準值來評價。

7.腫瘤的檢測用或診斷用試劑盒

本發明的抗htrop-2抗體可以以腫瘤的檢測用或診斷用試劑盒的形態提供。本發明的試劑盒含有抗體，此外還可以含有標記物質、或用於固定抗體或其標記物的固定化試劑等。所謂抗體的標記物質是指用酶、放射性同位素、螢光化合物和化學發光化合物等標記的物質。本發明的試劑盒除了上述構成要素之外，還可以含有用於實施本發明的檢測的其它試劑，例如標記物為酶標記物時，可以含有酶底物(顯色性底物等)、酶底物溶解液、酶反應停止液、或試樣用稀釋液等。而且，還可以含有各種緩衝液、無菌水、各種細胞培養容器、各種反應容器(eppendorf管等)、封閉劑(牛血清白蛋白(bsa)、脫脂乳、山羊血清等血清成分)、洗滌劑、表面活性劑、各種板、疊氮化鈉等防腐劑和實驗操作手冊(說明書)等。

本發明的試劑盒可有效用於進行上述本發明的檢測方法，其有用性極高。

以下，通過列舉實施例對本發明進行更具體的說明，但本發明並不限於此。

〔實施例1〕

[htrop-2基因的克隆]

htrop-2全長基因的分離是通過rt-pcr法由人胎肝(10周大的胚胎)進行的。首先，基於htrop-2基因(genbank登錄號no.nm_002353)的序列設計了以下所示的pcr引物。

正向側引物：5』-ttcctccgccccaccatggc-3』(序列號3)

反向側引物：5』-ctcgagcaagctcggttcctttctc-3』(序列號4)

此時，反向側引物中除去了終止密碼子並添加了xhoi的限制酶消化序列。以由這些引物和人胎肝(10周大的胚胎)製備的總rna(takara)合成的cdna為模板進行pcr反應。然後，利用瓊脂糖凝膠電泳進行展開、進行目標條帶的提取，克隆到pcrii載體(invitrogen)中(pcrii-htrop2)。通過測序，對所克隆的htrop-2的cdna進行了確認。

表達載體的構建：由pcrii-htrop2切出含有htrop-2基因的ecori/xhoi片段，插入到a載體(invitrogen)的ecori/xhoi位點，從而進行構建(pcdna4-htrop2-myc/his)。此外，由pcdna4-htrop2-myc/his切出含有htrop-2基因的hindiii/pmei片段(hindiii切斷位點進行了平滑末端化)，插入到pcdna3.1(+)載體(invitrogen)的pmei位點，從而構建了具有新黴素耐性基因的表達載體(pcdna3.1-htrop2-myc/his)。

〔實施例2〕

[htrop-2基因穩定細胞株的構建]

使用lipofectamine2000試劑(invitrogen)，將按照上述方法製作的編碼htrop-2的全長cdna的表達載體(pcdna3.1-htrop2-myc/his)導入hek293細胞(riken)、huh-7細胞(hsrrb)、7e2-c細胞(wo2005/052156中所記載的)、cho-k1細胞(hsrrb)中，利用抗生素g418(遺傳黴素，gibcobrl)進行選擇後，建立了穩定表達htrop-2的細胞株，從而獲得。

〔實施例3〕

[htrop-2細胞外區域的重組蛋白製作]

通過pcr法對編碼htrop-2細胞外區域的一部分(具體而言，包含序列號2所示的胺基酸序列中的第1位～第263位的胺基酸的區域)的基因片段進行了擴增。擴增中使用的引物如下所示。

正向側引物：5』-ttcctccgccccaccatggc-3』(序列號3)

反向側引物：5』-ctcgagctcgtccaggtaatagatgagcg-3』(序列號5)

此時，反向側引物中添加了xhoi限制酶消化位點。利用瓊脂糖凝膠電泳對由pcr法擴增獲得的dna片段進行展開，使用qiaquick(註冊商標)gelextractionkit(qiagen)進行純化。純化而得的dna片段亞克隆至pcrblunt載體(invitrogen)中(pcrb-htrop-2ec)，確認基因序列。然後，由pcrb-htrop-2ec切出含有編碼htrop-2的細胞外區域的基因片段的ecori/xhoi片段，插入到a載體(invitrogen)的ecori/xhoi位點(pcdna4mh-htrop-2ec)。進而，為了在pcdna4mh-htrop-2ec的bamhi/ecori位點製作nrui限制酶切斷位點，連接、插入以下所示的寡核苷酸。

寡核苷酸1：5』-gatccactagtcgcgagtggtgg-3』(序列號6)

寡核苷酸2：5』-aattccaccactcgcgactagtg-3』(序列號7)

同樣地在pcdna4mh-htrop-2ec的pmei位點插入pbglii連接子(takara)(pcdna4mh-nb-htrop-2ec)。為了使用杆狀病毒(baculovirus)製作重組蛋白，由pcdna4mh-nb-htrop-2ec切出含有編碼htrop-2的細胞外區域的基因片段的nrui/bglii片段，插入到ppsc8載體(日本農產工業)的nrui/bglii位點(ppsc8-htrop2ec)。委託日本農產工業來進行使用杆狀病毒製作htrop-2細胞外區域的重組蛋白。

htrop-2細胞外區域的重組蛋白的純化如下進行。在含有重組蛋白的培養上清中加入nisepharose6fastflow(gehealthcare)，在4℃下進行2小時結合。然後，使用econo柱(biorad)，用含有20mm咪唑的磷酸緩衝液洗滌，用含有300mm咪唑的磷酸緩衝液進行洗脫，從而進行純化。

〔實施例4〕

[人epcamcdna的分離和表達載體的構建]

人epcam全長基因的分離是通過rt-pcr法由人胎肝(10周大的胚胎)進行的。首先，基於人epcam基因(genbank登錄號no.nm002354)的序列設計了以下所示的pcr引物。

正向側引物：5』-tcctcgtgtcccactcccgg-3』(序列號8)

反向側引物：5』-ctcgagtgcattgagttccctatgc-3』(序列號9)

此時，反向側引物中除去了終止密碼子並添加了xhoi的限制酶消化序列。以由這些引物和人胎肝(10周大的胚胎)源的總rna(takara)合成的cdna為模板進行pcr反應。然後，利用瓊脂糖凝膠電泳進行展開、進行目標條帶的提取，克隆到pcrii載體(invitrogen)中(pcrii-hepcam)。通過測序對克隆的人epcam的cdna進行了確認。

表達載體的構建：由pcrii-hepcam切出含有人epcam基因的ecori/xhoi片段，插入到a載體(invitrogen)的ecori/xhoi位點，從而進行構建(pcdna4-hepcam-myc/his)。此外，由pcdna4-hepcam-myc/his切出含有人epcam基因的hindiii/pmei片段(hindiii切斷位點進行了平滑末端化)，插入到pcdna3.1(+)載體(invitrogen)的pmei位點，從而構建了具有新黴素耐性基因的表達載體(pcdna3.1-hepcam-myc/his)。

〔實施例5〕

[抗htrop-2單克隆抗體的製作]

作為免疫原，使用了htrop-2穩定表達細胞株(hek293-htrop-2細胞、cho-k1-htrop-2細胞、7e2-c-htrop-2細胞)、在細胞表面內源性表達htrop-2蛋白的人胰臟癌細胞株(pk-59，rcb1901；由rikencellbank購入)、或通過上述方法製作的htrop-2的細胞外區域的重組蛋白。

在htrop-2穩定表達細胞株時將1×107細胞、在重組htrop-2蛋白時將20μg蛋白分別與免疫輔助劑titermaxgold(funakoshi株式會社)以1：1混合，製備乳濁液，注射到小鼠(c57/bl6，balb/c)的兩腳掌或腹腔內(初次免疫)。在對兩腳掌短期免疫時，從初次免疫起3天後及10天後進行加強免疫，在最後一次免疫的次日，取出兩膝窩的淋巴結，製備淋巴細胞。在向腹腔內長期免疫時，從初次免疫起以每周1次的比例進行加強免疫(在1～2個月內實施)，按照常規方法由脾臟分離b細胞。加強免疫時，在細胞免疫的情況下使用5×106細胞的用pbs懸浮的細胞懸浮液，在蛋白質抗原的情況下，使用5μg的pbs溶液。

將製備的淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞株(p3-x63-ag8.653)以3：1的比例混合，用聚乙二醇法進行細胞融合，用含有hat(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脫氧核苷)的甲基纖維素培養基(商品名：clonacell-hycloningmediumd；stemcell)培養7～28天，將增殖出來的雜交瘤的單一集落一個一個地挑到96孔平底培養板中，使用含有hat的液體選擇培養基在5％co2培養箱中培養。對來自於增殖出來的單一集落的雜交瘤的培養上清，利用cellelisa(後述)進行一次篩選、通過使用huh-7-htrop-2細胞pk-59的facs解析進行2次篩選，從而建立了300種產生識別在活細胞的細胞表面表達的htrop-2蛋白的抗htrop-2單克隆抗體的雜交瘤。

〔實施例6〕

[使用cellelisa進行的一次篩選]

在96孔培養板(bdfalcon)中，以3×104細胞/孔交替接種cho-k1細胞(htrop-2陰性對照：由japanhealthsciencesfoundation購入)、和cho-k1-htrop-2細胞(或huh-7細胞(htrop-2陰性對照：由japanhealthsciencesfoundation購入)和huh-7-htrop-2細胞)，在5％co2、37℃下培養1～2天。通過傾析除去細胞培養液，接下來用冰冷pbs洗滌後，用4％多聚甲醛-pbs處理5分鐘，從而將細胞固定，用冰冷pbs洗滌後，作為elisa板。之後，按照常規方法進行elisa法。具體如下所示。

首先，在室溫下用2％脫脂乳-pbs溶液進行30分鐘～1小時封閉。接下來，加入雜交瘤培養上清，在室溫下反應1小時後，用0.1％tween20-pbs溶液洗滌3次。加入作為二抗的用封閉溶液稀釋1000倍的辣根過氧化物酶(hrp)標記抗小鼠igg(gehealthcarebiosciences)，在室溫下反應1小時後，用0.1％tween20-pbs溶液洗滌3次。添加tmb(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺：sigma)底物溶液進行顯色反應，加入1m硫酸使反應停止。使用酶標儀model550(biorad)測定吸光度(405nm)。將相對於陰性對照顯示高吸光度值的雜交瘤培養上清的相應雜交瘤在24孔平底培養板中進行擴大培養，轉移到使用facs解析進行的二次篩選(後述)。

〔實施例7〕

[使用facs解析進行的二次篩選]

對上述用cellelisa進行的一次篩選中為陽性的雜交瘤，使用facs解析進行二次篩選。就細胞而言，以不表達htrop-2的人肝癌細胞株huh-7細胞為陰性對照，以相對於表達htrop-2的穩定細胞株huh-7-htrop-2細胞的反應性為指標進行評價，接下來以與在細胞表面內源性表達htrop-2蛋白的人胰臟癌細胞株pk-59細胞(rcb1901；由rikencellbank購入)的反應性進行評價。

通過胰蛋白酶處理將細胞從培養皿剝離，製備細胞懸浮液(細胞密度2×106細胞/ml)。使在使用cellelisa進行的一次篩選中顯示陽性反應的雜交瘤上清和細胞懸浮液100μl於4℃反應20分鐘。用pbs洗滌後，使之與pe標記抗小鼠igg(bdpharmingen)(0.1μg)反應(4℃，30分鐘)後，用facscalibur(becton，dickinsonandcompany)解析。

最終，建立了約300種產生識別在活細胞的細胞表面表達的htrop-2蛋白的抗htrop-2單克隆抗體的雜交瘤。

〔實施例8〕

[同種型的鑑定]

使用小鼠單克隆抗體同種型測定試劑盒(serotec公司)並按照試劑盒所附方法進行製作的抗htrop-2單克隆抗體的同種型的鑑定。

〔實施例9〕

[trop-2抗體的腹水化及抗體純化]

在預先(7天前)投與2,6,10,14-四甲基十五烷(pristane)的balb/c裸小鼠的腹腔內投與3×106個按照上述方法製作的雜交瘤的克隆，採集2周後的腹水。進而，進行辛酸沉澱、使用蛋白g柱(hitrapproteing；gehealthcarebiosciences)或蛋白a柱(hitrapproteina；gehealthcarebiosciences)進行親和純化，從而由該腹水獲得各雜交瘤克隆所產生的抗htrop-2單克隆抗體。

〔實施例10〕

[抗原親和性的測定(kd值的測定)]

通過使用了elisa的方法計算所製作的抗htrop-2單克隆抗體的抗原親和性(kd值)(djavadi-ohaniancel.etal(1996)，inantibodyengineering，chapter4，pp77-97.irlpress，oxford)。

具體而言，在96孔培養板(corning)中添加純化的重組htrop-2蛋白(0.1μg/ml)，將抗原固定化(室溫、1小時，或4℃、一晚)。然後，用pbs洗滌3次，加入2％脫脂乳(pbs溶液)進行封閉(室溫，1小時)。用pbs洗滌2次後，在上述elisa板中添加預先混合抗原溶液(純化htrop-2蛋白；50，25，12.5，6.25，3.125nm)和抗htrop-2單克隆抗體的各克隆(0.5nm)並使其平衡化的抗原-抗體複合物，並使之反應(室溫，1小時)。用pbs洗滌3次後，使之與用封閉液稀釋的hrp標記抗小鼠igg(最終濃度1μg/ml)(gehealthcarebiosciences)反應(室溫，1小時)。接下來用0.1％tween20-pbs溶液洗滌3次後，添加tmb(3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺：sigma)底物溶液，進行顯色反應，加入1m硫酸使反應停止。使用酶標儀model550(biorad)測定吸光度。

解離常數(kd)的計算式如下所示。

基於質量作用定律，抗原抗體反應如下表示。

kd＝k2/k1＝agf×abf/ag-ab＝agf×abf/x....(2)

式(2)中，agf表示游離抗原的濃度，abf表示游離抗體的濃度，ag-ab表示抗原-抗體複合物的濃度，當設ag-ab＝x時，游離抗體濃度為

abf＝abt-x.......(3)

式(2)變為：

kd＝agf×(abt-×)/×.......(4)

對式(4)的兩邊乘以x/kd×abt時，

x/abt＝agf×(1-×/abt)×1/kd

x/abt×1/agf＝(1-x/abt)×1/kd.......(5)

在式(5)中，當設x＝x/abt、y＝x/abt×agf時，

y＝(1-x)×1/kd.......(6)

由式(6)算出kd值。

按照上述方法測定了所製作的300克隆的抗htrop-2單克隆抗體的kd值，結果kd值顯示為1×10-10(m)以下的克隆為133克隆，kd值顯示為1×10-11(m)以下的克隆為59克隆，kd值顯示為1×10-12(m)以下的克隆為2克隆。

在體內顯示腫瘤生長抑制活性的抗htrop-2單克隆抗體中，k5-70(小鼠igg2a)、t6-16(小鼠igg2a)、k5-107(小鼠igg1)、k5-116-2-1(小鼠igg2a)、及t5-86(小鼠igg1)的kd值分別依次為6.8×10-12(m)、4.3×10-12(m)、4.7×10-12(m)、2.69×10-11(m)、及8.49×10-11(m)(圖1、表1)。

[表1]

抗htrop-2單克隆抗體的kd值

〔實施例11〕

[抗htrop-2單克隆抗體與人癌細胞株的反應性]

人癌細胞株(人腫瘤細胞株)使用了由日本衛生科學基金會(japanhealthsciencesfoundation，hsrrb)、riken細胞庫(riken)，美國模式培養物保藏所(americantypeculturecollection，atcc)、歐洲細胞培養物收藏中心(europeancollectionofcellcultures，ecacc)、德國典型菌種保藏中心(germancollectionofmicroorganismsandcellcultures，dsmz)獲得的細胞株。具體列舉如下。

huh-1(hsrrb),huh-6(hsrrb),huh-7(hsrrb),jhh-5(hsrrb),jhh-6(hsrrb),jhh-7(hsrrb),hle(hsrrb),hlf(hsrrb),hepg2(hsrrb),alexander(hsrrb),kp-1n(hsrrb),kp-1nl(hsrrb),kp-2(hsrrb),kp-3(hsrrb),kp-3l(hsrrb),pk-1(riken),panc-1(riken),miapaca-2(hsrrb),pk-59(riken),pk-45h(riken),pk-45p(riken),bxpc-3(atcc),suit-2(hsrrb),tcc-pan2(hsrrb),sw480(atcc),dld-1(hsrrb),lovo(hsrrb),colo-320(riken),caco-2(riken),cw-2(riken),hct116(atcc),hcc-56(hsrrb),mcf-7(hsrrb),jimt-1(dsmz),hcc1143(atcc),a549(hsrrb),du145(riken),pc-3(hsrrb)

對於癌細胞，通過胰蛋白酶處理而由培養皿剝離，並製備細胞懸浮液(細胞密度為2×106細胞/ml)。在細胞懸浮液100μl中加入抗htrop-2單克隆抗體(0.1μg)，4℃下反應20分鐘。用pbs洗滌後，與pe標記抗小鼠igg(bdpharmingen)(0.1μg)反應(4℃、30分鐘)，然後通過facscalibur(becton，dickinsonandcompany)解析。

所製作的抗htrop-2抗體均不與不內源性表達htrop-2的人肝癌細胞株huh-7結合，另一方面，顯示出與表達htrop-2基因的穩定細胞株huh-7-htrop-2細胞結合(圖2)。接下來，通過facs解析對所製作的htrop-2單克隆抗體與人癌細胞株(在細胞表面內源性表達的htrop-2蛋白)的反應性進行研究，結果顯示所製作的300種抗htrop-2單克隆抗體均與人胰臟癌細胞株(pk-59、bxpc-3)結合，特別是，和僅pe標記抗小鼠igg(bdpharmingen)反應時相比，在體內顯示腫瘤生長抑制活性的k5-70、t6-16、k5-107、k5-116-2-1、t5-86抗體在pk-59細胞的情況下平均螢光強度為k5-70(44倍)、t6-16(59倍)、k5-107(89倍)、k5-116-2-1(122倍)、t5-86(15倍)(圖3)，在bxpc-3細胞的情況下為k5-70(45倍)、t6-16(25倍)、k5-107(90倍)、k5-116-2-1(121倍)、t5-86(10倍)，各抗體均顯示為強結合性(圖4)。

在pk-59和bxpc-3以外的人癌細胞株中，在胰臟癌細胞株12種之中，與kp-2、kp-3l、pk-1、pk-45h、suit-2、tcc-pan2結合，不與kp-1n、kp-1nl、kp-3、panc-1、mia-paca2結合(圖5)。在人大腸癌細胞株的情況下，與caco-2、sw480、dld-1、hct116結合，不與colo-320、cw-2結合(圖6)。此外，與jimt-1、hcc1143(均為人乳腺癌細胞株)、pc-3、du145(均為人前列腺癌細胞株)結合，識別在多種人癌細胞株的細胞表面內源性表達的htrop-2蛋白(圖6)。

〔實施例12〕

[與小鼠trop-2蛋白、人trop-1/epcam蛋白的交叉反應性]

為了調查所製作的htrop-2單克隆抗體的特異性，通過facs解析研究了與和htrop-2蛋白在胺基酸序列方面顯示80％同源性的小鼠trop-2蛋白、與htrop-2蛋白在胺基酸序列方面顯示50％同源性的人trop-1/epcam的反應性。

具體而言，將包含小鼠trop-2基因(genbank登錄號no.nm_020047、y08830)的全長cdna的表達載體(小鼠trop-2-pcdna3.1(+)，東京大學分子細胞生物學研究所惠贈)、以及包含人trop-1/epcam基因(genbank登錄號no.nm_002354)的全長cdna的表達載體(pcdna3.1-hepcam-myc/his)分別使用lipofectamine2000試劑(invitrogen)對cho-k1細胞進行瞬時基因導入，24～48小時後通過胰蛋白酶處理由培養皿剝離細胞，製備細胞懸浮液，依次與所製作的htrop-2單克隆抗體(0.1μg)、pe標記抗小鼠igg反應後，通過facscalibur進行解析。

在瞬時表達小鼠trop-2基因的cho-k1細胞中，用作陽性對照的與小鼠trop-2顯示交叉反應的t2-102抗體(小鼠igg1)顯示出強烈結合，另一方面，k5-70、t6-16、k5-107、k5-116-2-1、t5-86抗體與小鼠trop-2不顯示交叉反應(圖7)。

同樣地，在瞬時表達人epcam/trop-1基因的cho-k1細胞中，用作陽性對照的抗人epcam單克隆抗體(bdpharmingen)顯示出強烈結合，另一方面，k5-70、t6-16、k5-107、k5-116-2-1、t5-86抗體與人epcam/trop-1不顯示交叉反應(圖8)。

以上結果表明，所製作的htrop-2單克隆抗體、特別是在體內顯示抗腫瘤活性的k5-70、t6-16、k5-107、k5-116-2-1、t5-86抗體特異性地與htrop-2結合。

〔實施例13〕

[細胞增殖抑制活性的測定]

作為調查抗htrop-2單克隆抗體的htrop-2的功能抑制的方法之一，基於使用tetracolorone(生化學工業)的活細胞數的測定，評價了對在細胞表面內源性表達htrop-2的人癌細胞的細胞增殖的影響。具體而言，按照使pk-59細胞在含有0.5％的胎牛血清(biowest公司制)的rpmi1640培養基中達到2×105細胞/ml的細胞濃度的方式製備細胞懸浮液，在96孔培養板中各接種100μl。接下來，添加小鼠igg(陰性對照)、抗htrop-2單克隆抗體(最終濃度0.1μg/ml、1μg/ml)，在37℃、5％co2培養箱中培養72小時。作為比較對照，使用市售的抗htrop-2單克隆抗體(克隆yy01，santacruz)。在細胞中添加tetracolorone(生化學工業)，在5％co2培養箱中反應1～2小時。使用酶標儀對反應後的96孔培養板直接測定波長490nm(對照波長：655nm)的吸光度。各組在3孔中實施，通過學生t檢驗(student’st檢驗)進行差異顯著性檢驗，將p<0.05判定為統計學上顯著。

目前，通過上述方法對本公司製作的抗htrop-2單克隆抗體中的約160克隆調查了對pk-59細胞的細胞增殖的效果，結果可以確認，與小鼠igg(陰性對照)相比，在體內顯示腫瘤生長抑制活性的t6-16、t5-86、k5-70、k5-107具有20％～40％的細胞增殖抑制活性，明確了這些抗htrop-2抗體與在人癌細胞表面表達的htrop-2蛋白結合併中和htrop-2蛋白的功能，具有抑制癌細胞增殖的活性(圖9)。

〔實施例14〕

[劃痕試驗(scratchassay)]

通過劃痕試驗對抗htrop-2單克隆抗體的人癌細胞的遷移能力進行評價。按照使pk-59細胞在含有10％胎牛血清的rpmi1640培養基中達到3×105細胞/ml的細胞濃度的方式製備細胞懸浮液，在96孔培養板中各接種100μl。在細胞達到鋪滿的階段，採用用槍頭(tip)的尖端沿著縱向劃線的方式剝離單層培養的細胞的一部分。按照使抗htrop-2單克隆抗體、以及作為陰性對照的小鼠igg的最終濃度達到0.1以及1μg/ml的方式在培養基中進行添加，培養24小時，拍攝抗體添加前(0天)和培養24小時後(1天)的剝離的區域的照片，測定細胞間距離。此外，通過scionimage軟體將剝離區域的面積定量。各組在8孔中實施，通過學生t檢驗進行差異顯著性檢驗，將p<0.05判定為統計學上顯著。

調查了htrop-2抗體對浸潤至劃痕區域的細胞的運動能力的效果。與細胞增殖抑制檢測同樣地對具有藥效的抗體進行評價。評價方法：拍攝0天(抗體添加時)以及1天(經過24小時後)的細胞，對遷移距離(μm)以及劃痕區域的面積進行圖像解析。結果如圖10所示，細胞的運動能力可見到明顯差異。與對照相比，本試驗中使用的t6-16以及k5-70均可觀察到顯著的增殖抑制，再現性試驗中也能夠確認同樣的傾向。特別是，t6-16的情況下p<0.01(利用學生t檢驗)，可確認與體內試驗的相關性。

〔實施例15〕

[利用荷瘤小鼠進行的、抗htrop-2單克隆抗體的藥效評價]

預防模型

通過胰蛋白酶處理來剝離表達htrop-2的胰癌細胞株(pk-59、bxpc-3)，用pbs製備出1×108個細胞/ml的細胞懸浮液，在冰上與等量的matrigel(bdpharmingen)混合。在6周齡的雌性裸小鼠(balb/c、nu/nu)的右脅腹的皮下用26g的注射器注射100μl(5×106個細胞)。在癌細胞移植當天(1天)，將小鼠分組，開始投與抗體(1、5、或10mg/kg體重，腹腔內投與)。之後，按3天1次的間隔進行同樣的投與。根據腫瘤形成頻率和腫瘤體積評價抗腫瘤活性。腫瘤體積的測量採用以下計算式。

腫瘤體積(mm3)＝(短徑)2×(長徑)×π/6

治療模型

通過胰蛋白酶處理來剝離表達htrop-2的胰癌細胞株(pk-59、bxpc-3)，用pbs製備出1×108個細胞/ml的細胞懸浮液，在冰上與等量的matrigel(bdpharmingen)混合。在6周齡的雌性裸小鼠(balb/c、nu/nu)的右脅腹的皮下用26g的注射器注射100μl(5×106個細胞)。癌細胞移植5～6天後，將腫瘤體積生長到50～150mm3(平均值約為100mm3)的小鼠分組，將分組的當天作為第1天(1天)，開始投與抗體。抗體按3天1次的間隔進行腹腔內投與(10mg/kg體重)。通過測量腫瘤體積評價抗腫瘤活性。差異顯著性檢驗用學生t檢驗(student’st檢驗)進行，將p<0.05判定為統計學上顯著。

〔實施例16〕

[人胰癌細胞異種移植模型中的、抗htrop-2單克隆抗體的體內抗腫瘤活性的研究]

以htrop-2為靶標的癌治療用抗體在異種移植治療模型中必須顯示出使表達htrop-2的腫瘤組織特異性死亡或抑制腫瘤生長的活性。

通過胰癌細胞株pk-59細胞的異種移植治療模型對本發明中新製作的抗htrop-2單克隆抗體(約160克隆)進行評價。pk-59細胞表達作為胰臟癌幹細胞標誌的epcam(圖11a)(chenweili，etal.cancerres2007；67：(3).1030-1037)，在細胞表面表達與耐藥性相關的作為abc轉運蛋白的p-糖蛋白/mdr1(圖11b)，abcg2/cdw338(圖11c)(chen,c.j.etal.cell47(3)，381-389(1986)，allikmets,r.，etal.hum.mol.genet.5(10)，1649-1655(1996)。此外，包含胰臟癌幹細胞特徵性的cd24和cd44共陽性的細胞組分(8.93％)(圖11d)，推測其為惡性程度高的人胰臟癌細胞株(chenweili，etal.cancerres2007；67：(3).1030-1037、janee.visvaderandgeoffreyj.lindeman.natrevcancer.vol.8(10)：755-68，2008)。

新製作的約160克隆中，大部分克隆在pk-59細胞異種移植治療模型中不顯示藥效，其中也獲得了顯示顯著的腫瘤生長抑制活性的以下克隆，即克隆k5-70、t6-16、k5-107、t5-86及k5-116-2-1。

克隆k5-70(小鼠igg2a)投與組中，腫瘤生長速度在統計學上顯著受到抑制，投與開始後第21天(21天)，對照組(n＝14)的腫瘤體積為1200.8±377.3mm3，與此相對，克隆k5-70投與組則為748.7±175.0mm3(p<0.01，利用學生t檢驗)(圖12a)。設抗體投與開始時刻的腫瘤體積為1.0，第21天(21天)的腫瘤體積方面，對照組為12.5，與此相對，克隆k5-70投與組為7.8(圖12a)。摘出的腫瘤重量方面，對照組為0.73±0.26g，與此相對，克隆k5-70投與組則為0.43±0.14g(p<0.01，利用學生t檢驗)，顯示約60％的抑制(圖12b)。

同樣地，克隆k5-107(小鼠igg1)投與組(n＝8)、克隆t6-16(小鼠igg2a)投與組(n＝8)、克隆t5-86(小鼠igg1)及克隆k5-116-2-1(小鼠igg2a)投與組(n＝8)中，腫瘤生長速度在統計學上也顯著受到抑制。投與開始後第17天(17天)，對照組(n＝8)的腫瘤體積為1039.3±271.6mm3，與此相對，克隆k5-107投與組(n＝8)以及克隆t6-16投與組(n＝8)分別為698.2±175.9mm3(p<0.05，利用學生t檢驗)、707.2±254.5mm3(p<0.05，利用學生t檢驗)。同樣地，投與開始後第16天(16天)，對照組(n＝8)的腫瘤體積為797.0±172.9mm3，與此相對，克隆k5-116-2-1投與組(n＝8)為508.5±225.2mm3(p<0.05，利用學生t檢驗)(圖13)。

另一方面，關於克隆t5-86，投與開始後第15天(15天)，對照組(n＝8)的腫瘤體積為1033.2±319.4mm3，與此相對，克隆t5-86投與組(n＝8)則為744.1±289.1mm3，雖然腫瘤體積的比較並無顯著差異，但同天的腫瘤重量比較中，對照組為0.62±0.14g，與此相對，克隆t5-86投與組則為0.44±0.13g(p<0.05，利用學生t檢驗)，顯示出顯著的抑制。

此外，下述表2中分別示出各克隆抗體投與組的實驗最後一天的腫瘤體積以及腫瘤重量與對照組的比例(t/c)。如表2所示，各克隆抗體投與組分別獲得t/c＝62～72％的顯著的抑制。

表2

＊p＜0.05，＊＊p＜0.01(利用學生t檢驗)

此外，分別研究了克隆k5-70、克隆t6-16、克隆k5-116-2-1在胰癌細胞株pk-59細胞的異種移植預防模型中的抗腫瘤活性。就各個克隆而言，抗體投與後所有個體中(n＝8)腫瘤生長均受到抑制，投與開始後第18天(18天)，對照組(n＝8)的腫瘤體積為880.8±206.4mm3，與此相對，克隆k5-70投與組(10mg/kg體重)為62.4±80.4mm3(p<0.01，利用學生t檢驗)，顯示92.9％的腫瘤生長抑制活性；投與開始後第28天(28天)，對照組(n＝8)的腫瘤體積為992.3±250.8mm3，與此相對，克隆t6-16投與組(10mg/kg體重)為152.14±122.3mm3(p<0.01，利用學生t檢驗)，顯示84.6％的腫瘤生長抑制活性；投與開始後第20天(20天)，對照組(n＝8)的腫瘤體積為1159.4±413.3mm3，與此相對，克隆k5-116-2-1投與組(10mg/kg體重)為207.7±319.2mm3(p<0.01，利用學生t檢驗)，顯示82.1％的腫瘤生長抑制活性(圖14，表3)。此外，所有的實驗中，在對照組和抗htrop-2抗體投與組之間，整個試驗期間平均體重的變化方面無顯著差異。

下述表3分別示出各克隆抗體投與組的、實驗最後一天的腫瘤體積以及腫瘤重量與對照組的比例(t/c)。如表3所示，各克隆抗體投與組可觀察到顯著的腫瘤生長抑制，特別是克隆k5-70投與組確認到t/c＝10％以下的顯著效果。

表3

＊＊p＜0.01(利用學生t檢驗)

公知的抗trop-2抗體ar47a6.4.2(美國專利第7420041號)雖然在使用各種人癌細胞株時以20mg/kg的投與量在異種移植預防模型中顯示出腫瘤生長抑制效果，且在人胰臟癌細胞株pl45細胞時幾乎100％抑制腫瘤生長，但在胰臟癌細胞株bxpc-3中為約50％、在前列腺癌細胞株pc-3中為約40％、在乳腺癌細胞株mcf-7中為約60％、在大腸癌細胞株colo205中為約40％的腫瘤生長抑制效果，與此相對，本申請發明的抗htrop-2抗體以一半投與量(10mg/kg體重)發揮了更強的腫瘤生長抑制效果。

〔實施例17〕

[人胰癌細胞株bxpc-3細胞的異種移植模型(預防模型以及治療模型)中的抗腫瘤活性的研究]

與上述使用人胰癌細胞株pk-59細胞的異種移植治療模型時同樣地，研究克隆k5-70在人胰癌細胞株bxpc-3細胞的異種移植預防模型及異種移植治療模型中的抗腫瘤活性。

克隆k5-70投與組(n＝8)中，與對照組(n＝8)相比，腫瘤生長顯著受到抑制，第52天(52天)，對照組(n＝8)的腫瘤體積為616.3±266.8mm3，與此相對，克隆k5-70投與組(n＝8)則為236.0±136.4mm3，顯示61.7％的腫瘤生長抑制效果(p<0.01，利用學生t檢驗)(圖15)。

由以上結果可以明確，抗htrop-2單克隆抗體對至少2種以上的多種癌細胞種類在體內顯示顯著的腫瘤生長抑制活性。

〔實施例18〕

[抗htrop2抗體(克隆k5-70)在表達htrop2的胰癌細胞株(pk-59細胞)異種移植預防模型中的用量依賴性的抗腫瘤活性]

為了更詳細地研究抗htrop-2抗體在體內的腫瘤生長抑制活性，進行了用量依賴性試驗。如圖16所示，可以明確的是，pk-59細胞的腫瘤生長通過投與k5-70抗體而用量依賴性地受到抑制，抗體投與後第21天(21天)，對照組(n＝8)的腫瘤體積為937.8±295.3mm3，與此相對，k5-70抗體(1mg/kg體重)投與組(n＝8)為493.5±305.1mm3，顯示50％的抑制率，k5-70抗體(5mg/kg體重)投與組(n＝8)為124.7±89.0mm3，顯示出90％的抑制效果，與公知的抗trop-2抗體ar47a6.4.2(美國專利第7420041號)相比，以20分之1的投與量顯示出幾乎同等的在體內的腫瘤生長抑制效果，以4分之1的投與量顯示出更高的90％的抑制效果。

〔實施例19〕

[表位分析]

人/小鼠嵌合trop-2蛋白的製作

使用pcr法製作了人/小鼠嵌合trop-2基因。基於人trop-2基因序列以及小鼠trop-2基因序列(genbank登錄號no.nm020047)，設計了以下所示的pcr引物。

人/小鼠trop-2-c引物

y606(正向側)：5』-cctgagcctacgctgcgacgaagtggtgcg-3』(序列號10)

y607(反向側)：5』-cgcaccacttcgtcgcagcgtaggctcagg-3』(序列號11)

人/小鼠trop-2-a引物

y612(正向側)：5』-gactgctccacgctgacttccaagtgcctg-3』(序列號12)

y613(反向側)：5』-caggcacttggaagtcagcgtggagcagtc-3』(序列號13)

人/小鼠trop-2-b引物

y614(正向側)：5』-ctcgtggacaacgatggcctctacgacccg-3』(序列號14)

y615(反向側)：5』-cgggtcgtagaggccatcgttgtccacgag-3』(序列號15)

小鼠/人trop-2-d引物

y608(正向側)：5』-ccaaagcctgcgctgcgatgagctggtgcgc-3』(序列號16)

y609(反向側)：5』-gcgcaccagctcatcgcagcgcaggctttgg-3』(序列號17)

小鼠/人trop-2-e引物

y616(正向側)：5』-agcttcctatccgcggtgcactacgagcag-3』(序列號18)

y617(反向側)：5』-ctgctcgtagtgcaccgcggataggaagct-3』(序列號19)

小鼠/人trop-2-f引物

y618(正向側)：5』-gacattaaaggcgagtctctattccagggc-3』(序列號20)

y619(反向側)：5』-gccctggaatagagactcgcctttaatgtc-3』(序列號21)

小鼠trop-2引物

正向側：5-ctactccaccccaccctggcg-3』(序列號22)

反向側：5』-ctcgagcaagctaggttcgcttctc-3』(序列號23)

在小鼠trop-2反向側引物中去掉終止密碼子，添加xhoi的限制酶消化序列。所製作的人/小鼠嵌合trop-2蛋白的示意圖如圖17所示。

hmtrop-2-a嵌合蛋白是從htrop-2蛋白的n末端起至第69位的多肽和從小鼠trop-2蛋白的第64位起至c末端的多肽所構成的嵌合蛋白。hmtrop2-b嵌合蛋白是從htrop-2蛋白的n末端起至第101位的多肽和從小鼠trop-2蛋白的第96位起至c末端的多肽所構成的嵌合蛋白。hmtrop2-c嵌合蛋白為從htrop-2蛋白的n末端起至第145位的多肽和從小鼠trop-2蛋白的第140位起至c末端的多肽所構成的嵌合蛋白。mhtrop-2-d嵌合蛋白是從小鼠trop-2蛋白的n末端起至第139位的多肽和從htrop-2蛋白的第146位起至c末端的多肽所構成的嵌合蛋白。mhtrop-2-e嵌合蛋白是從小鼠trop-2蛋白的n末端起至第187位的多肽和從htrop-2蛋白的第194位起至c末端的多肽所構成的嵌合蛋白。mhtrop-2-f嵌合蛋白是從小鼠trop-2蛋白的n末端起至第227位的多肽和從htrop-2蛋白的234位起至c末端的多肽所構成的嵌合蛋白。

用於製作上述嵌合蛋白的表達載體具體通過以下方法構建。為了製作hmtrop-2-a嵌合基因，以htrop-2基因為模板，使用htrop-2正向側引物及人/小鼠trop-2-a引物y613進行pcr。同樣地，以小鼠trop-2基因為模板，使用人/小鼠trop-2-a引物y612及小鼠trop-2反向側引物進行pcr。將pcr所擴增的dna片段用丙烯醯胺凝膠展開，通過目標條帶的提取而回收。接下來，將所提取的2種dna片段混合作為模板，使用htrop-2正向側引物及小鼠trop-2反向側引物進行pcr。將pcr產物用瓊脂糖凝膠電泳展開，提取目標dna片段。將所提取的dna片段克隆至pcr(註冊商標)-blunt載體(invitrogen)(pcrb-hmtrop-2-a)來確認基因序列。動物細胞用表達載體如下製作：通過ecori/xhoi消化，由pcdna3.1-htrop-2-myc/his除去htrop-2基因，插入由pcrb-hmtrop-2-a製備的含有hmtrop-2-a嵌合基因的ecori/xhoi片段(pcdna3.1-hmtrop-2-a-myc/his)。此外，hmtrop-2-b(使用人trop-2正向側引物、人/小鼠trop-2-b引物y615、人/小鼠trop-2-b引物y614及小鼠trop-2反向側引物)、hmtrop-2-c(使用人trop-2正向側引物、人/小鼠trop-2-c引物y607及人/小鼠trop-2-c引物y606、小鼠trop-2反向側引物)、mhtrop-2-d(使用小鼠trop-2正向側引物、小鼠/人trop-2-d引物y609及小鼠/人trop-2-d引物y608、人trop-2反向側引物)、mhtrop-2-e(使用小鼠trop-2正向側引物、小鼠/人trop-2-e引物y617及小鼠/人trop-2-e引物y616、人trop-2反向側引物)、mhtrop-2-f(使用小鼠trop-2正向側引物、小鼠/人trop-2-f引物y619及小鼠/人trop-2-f引物y618、人trop-2反向側引物)也通過同樣的方法製作嵌合基因、構建表達載體(pcdna3.1-hmtrop-2-b-myc/his、pcdna3.1-hmtrop-2-c-myc/his、pcdna3.1-mhtrop-2-d-myc/his、pcdna3.1-mhtrop-2-e-myc/his、pcdna3.1-mhtrop-2-f-myc/his)。

恆定表達htrop-2、人/小鼠嵌合trop-2-c、及小鼠/人嵌合trop-2-d蛋白的hek293細胞株的建立

在hek293細胞株中分別導入上述表達載體pcdna3.1-htrop-2-myc/his、pcdna3.1-hmtrop-2-c-myc/his及pcdna3.1-mhtrop-2-d-myc/his。利用抗生素g418(calbiochem)進行選擇，建立恆定表達htrop-2蛋白、hmtrop-2-c嵌合蛋白以及mhtrop-2-d嵌合蛋白的hek293細胞株。

對在使用胰臟癌細胞株pk-59的異種移植治療模型中顯示藥效的抗htrop-2單克隆抗體k5-70、t5-86、k5-107、t6-4、t6-16、k5-116-2-1進行了結合區域的鑑定。首先，使用恆定表達hmtrop-2-c、mhtrop-2-d的各嵌合蛋白的hek293細胞，通過facs解析研究顯示藥效的抗htrop-2單克隆抗體的反應性(圖18)。其結果是，k5-70、k5-107、t5-86和k5-116-2-1與hmtrop-2-c反應，但與mhtrop-2-d不反應。另一方面，t6-4、t6-16抗體與mhtrop-2-d反應，但與hmtrop-2-c不反應。由此，k5-70、k5-107、t5-84及k5-116-2-1抗體的結合區域被限定在htrop-2的從n末端起至第145位的胺基酸區域，t6-4和t6-16抗體的結合區域被限定在htrop-2的從第146位的胺基酸起至c末端的區域(圖18)。

進而，為了詳細進行結合區域的解析，製作hmtrop-2-a、hmtrop-2-b、mhtrop-2-e及mhtrop-2-f嵌合蛋白表達用載體，研究了與顯示藥效的抗htrop-2單克隆抗體的反應性(圖19)。使用將新製作的嵌合蛋白表達用載體導入到hek293細胞中並使其瞬時表達的細胞進行facs解析。k5-70、k5-107、t5-86及k5-116-2-1抗體與hmtrop-2-a反應，但與mhtrop-2-b不反應。顯示調查的6種單克隆抗體與所有的htrop-2均反應。由此可以明確，k5-70、k5-107、t5-86及k5-116-2-1抗體的結合區域存在於htrop-2的從n末端起至第69位的胺基酸區域。此外，t6-4及t6-16抗體與mhtrop-2-e、mhtrop-2-f均不反應，因此暗示識別的是htrop-2的從第146位起至第193位的胺基酸區域。

〔實施例20〕

[免疫組化]

＜材料·方法＞

免疫組化染色中使用的正常組織陣列以及癌組織陣列如下所示。

人正常組織陣列：

human，normalorgansinduplicates(catalogno.：ab1，superbiochips)

normaltissuesmorethansinglespots(catalogno.：a103(vi)，isuabxis)

肺癌組織陣列：

humanlungcancer-metastasis-normal(catalogno.：cca3，superbiochips)

humanlungcarcinomatissuewithmargintissue，2locationcores(catalogno.：od-ct-rslug03-002，shanghaioutdobiotech)

胰臟癌組織陣列：

humanpancreascarcinomatissuewithmono-pathologicaltypefrom60cases，2locationcores(catalogno.：od-ct-dgpan03-001，shanghaioutdobiotech)

肝癌組織陣列：

hepatocellularcarcinoma，gradei～iiiwithnormaltissuecontrols，63casestissuearrays(catalogno.：cs03-01-002u，cybrdi)

humanlivercarcinomatissuewithmono-pathologicaltypefrom30cases，2locationcores(catalogno.：od-ct-dgliv02-002，shanghaioutdobiotech)

大腸癌組織陣列：

human，colorectalcancer(catalogno.：cd3，superbiochips)

humancoloncarcinomawithmargintissue，2locationcores(catalogno.：od-ct-dgcol03-002，shanghaioutdobiotech)

大腸癌淋巴結轉移、肝轉移組織陣列：

colorectal(colonandrectum)cancerwithmatchedlymphnodemetastasistissuearray，44cases/99cores，trialslide(catalogno.：co991t，biomaxus)

colorectal(colonandrectum)cancerwithmatchedlymphnodemetastasisandnormaladjacenttissuearray，43cases/99cores(catalogno.：co992，biomaxus)

coloncancertissueslivermetastasis(catalogno.：a203(iv)，isuabxis)

乳腺癌組織陣列：

human，breastcancer-metastasis-normal(catalogno.：cba3，superbiochips)

humanbreastcarcinomawithmargintissue，2locationcores(catalogno.：od-ct-rpbre03-002，shanghaioutdobiotech)

胃癌組織陣列：

human，stomachcancer(catalogno.：cq1，superbiochips)

humangastriccarcinomawithmargintissue，2locationcores(catalogno.：od-ct-dgstm03-002，shanghaioutdobiotech)

食道癌組織陣列：

human，esophaguscancer(catalogno.：cr1，superbiochips)

humanesophaguscarcinomawithmargintissue，2locationcores(catalogno.：od-ct-dgeso03-002，shanghaioutdobiotech)

卵巢癌組織陣列：

human，ovarycancer(catalogno.：cj1，superbiochips)

前列腺癌組織陣列：

human，prostatecancer-normal(catalogno.：ca3，superbiochips)

膀胱癌組織陣列：

bladdercarcinoma/transitionalcellcarcinoma，gradei～iiiwithnormaltissuearrays(catalogno.：cc12-01-001u，cybrdi)

上述組織陣列的患者信息以及臨床信息由其所附的數據表以及各公司的主頁獲得。

免疫組化染色法

人正常組織以及癌組織的組織陣列石蠟切片經脫石蠟處理後，在37℃下利用胃蛋白酶進行5分鐘蛋白酶處理，用於使用抗htrop-2單克隆抗體的免疫染色中。以dab(3,3'-二氨基聯苯胺)為底物進行顯色反應後，通過蘇木精進行核染色作為對比染色。

這些操作具體如下進行。石蠟包埋的切片經脫石蠟處理後，在37℃下利用胃蛋白酶(dako)進行5分鐘蛋白酶處理。活化抗原後，用在甲醇中按終濃度為0.3％加入了雙氧水的溶液，在室溫下處理20分鐘，除去內源性的過氧化物酶活性。用pbs在室溫下進行2次各5分鐘的洗滌，然後用含有1.5％的正常馬血清(dako)的pbs溶液在室溫下進行30分鐘封閉，對組織中的非特異性結合部位進行封閉操作。然後，與用含有1.5％的正常馬血清的pbs溶液稀釋的抗htrop-2單克隆抗體克隆k5-63-17(終濃度10μg/ml)在室溫下反應1小時，然後用pbs在室溫下進行3次各5分鐘的洗滌，然後，與用含有1.5％的正常馬血清的pbs溶液稀釋200倍的生物素化抗小鼠igg抗體(vector)在室溫下反應30分鐘。室溫下用pbs進行3次各5分鐘的洗滌後，按說明書所述混合vectastainabc試劑盒(vector)的試劑，製作abc複合物，使其在室溫下反應30分鐘。用pbs在室溫下進行3次各5分鐘的洗滌後，利用histofineperoxidasesubstratesimplestaindabsolution(nichireibiosciences)進行顯色。確認顯色後，用去離子水洗滌5分鐘，用邁耶斯蘇木精(meyer’shematoxylin)溶液(和光純藥)對核進行染色，然後用醇脫水，用二甲苯透明，用entellannew(merckjapan)封片。

＜結果＞

人正常組織中的htrop-2的表達

使用抗htrop-2單克隆抗體克隆k5-63-17，對人正常組織中的htrop-2的表達譜進行解析。對人正常組織組織陣列(catalogno.：ab1，superbiochips)進行脫石蠟、親水化處理後，利用作為蛋白水解酶的胃蛋白酶進行抗原活化，通過抗htrop-2單克隆抗體克隆k5-63-17進行免疫染色(圖20)。其結果是，在皮膚、食道、腎臟(皮質及髓質)、胰臟、前列腺、膀胱、扁桃腺中可觀察到染色。幾乎所有的染色像均顯示為定位於細胞膜(圖20的a、b、c、d、f、g、h)，部分細胞質中也觀察到表達(圖20的e、h)。另一方面，心臟、肝臟、胃、小腸、大腸、骨骼肌、肺、脾臟、胸腺等沒有被染色(圖20的i、j)。

htrop-2在人癌組織中的表達

為了調查人癌組織中的htrop-2的表達(htrop-2的陽性率)，使用抗htrop-2單克隆抗體克隆k5-63-17進行了人各癌種的癌組織陣列的免疫染色。將癌細胞的10％以上被染色的組織切片作為htrop-2陽性。該染色結果示於表4。

表4

此外，代表染色像示於圖21。在研究htrop-2的表達的癌種中，前列腺癌中陽性率最高(92.1％)，肺癌(65.4％)、食道癌(76.7％)、膀胱癌(71.2％)等中為高陽性率。陽性率最低的是肝癌，為7.61％。與正常細胞同樣地，癌細胞中也觀察到htrop-2強烈定位於細胞膜的染色像(圖21的a～f、h、i)。此外，一部分也在細胞質中表達(圖21的a、b、e、g)。

胰臟癌中的htrop-2的陽性率為41.9％。對此時的htrop-2陽性率和胰臟癌的等級(分化度)的關係進行了研究。其結果是，在等級高即低分化的胰臟癌中高頻表達(表5)。

表5

〔實施例21〕

[k5-70抗體的單次投與在人胰癌細胞株pk-59異種移植預防模型中的抗腫瘤效果]

在使用人胰癌細胞株pk-59的異種移植預防模型中，以10mg/kg體重的投與量投與1次時，克隆k5-70(小鼠igg2a)的體內強抗腫瘤活性也表現出來。對照組(小鼠igg10mg/kg體重，n＝3)中，所有個體中均觀察到腫瘤形成，細胞移植後第28天(28天)的腫瘤體積為781.7±74.5mm3，與此相對，癌細胞移植當天(1天)投與1次k5-70抗體的組(10mg/kg體重，n＝3)中第28天的腫瘤體積為144.4±176.9mm3(p<0.05，利用學生t檢驗)，顯示出81.5％的腫瘤生長抑制活性(圖22a)。腫瘤重量方面，第28天時，對照組為0.59±0.06g，與此相對，克隆k5-70抗體投與組則為0.07±0.10g(p<0.01，利用學生t檢驗))，顯示出88％的抑制活性(圖22b)。腫瘤體積、腫瘤重量方面，在k5-70投與組中，3個體中的2個體在1次投與10mg/kg體重時腫瘤形成完全受到抑制(圖22c)。

〔實施例22〕

[抗trop-2單克隆抗體在人大腸癌細胞株sw480細胞異種移植治療模型中的抗腫瘤活性]

通過使用人大腸癌細胞株sw480的異種移植治療模型，研究了抗htrop-2單克隆抗體(克隆k5-70，k5-116-2-1及t6-16)的抗腫瘤活性。將5×106細胞的sw480細胞移植(1天)到6周齡雌性nod-scid小鼠的右脅腹皮下，在腫瘤平均體積達到100mm3的階段進行分組(7天或10天)，從第7天或10天起以每3天1次的投與間隔開始抗體的腹腔內投與。克隆k5-70抗體的抗腫瘤活性評價、克隆k5-116-2-1抗體以及克隆t6-16抗體的抗腫瘤活性評價通過各自獨立的試驗來進行。k5-70抗體的抗腫瘤活性評價試驗中，癌細胞移植起第44天(44天)，對照組(小鼠igg(10mg/kg體重)，n＝8)的腫瘤體積為365.4±214.6mm3，與此相對，k5-70抗體(10mg/kg體重)投與組則為27.4±29.4mm3(p<0.01，利用學生t檢驗)，腫瘤形成顯著受到抑制(抑制率92.5％)(圖23a)。腫瘤重量方面，對照組為0.11±0.07g，與此相對，k5-70抗體投與組則為0.005±0.007(g)(p<0.01，利用學生t檢驗)，為95.5％的抑制率(圖23b)。特別是，k5-70抗體投與組中，8個體中的2個體中腫瘤形成完全受到抑制，未確認到腫瘤。

另外進行的k5-116-2-1抗體和t6-16抗體的抗腫瘤活性評價試驗中，第42天時，對照組的腫瘤體積為713.8±354.5mm3(n＝8)，與此相對，k5-116-2-1抗體投與組(10mg/kg體重)為188.9±97.4mm3(n＝8，p<0.01，利用學生t檢驗)(圖24a)，t6-16抗體投與組(10mg/kg體重)為292.8±199.7mm3(n＝8，p<0.05，利用學生t檢驗)(圖25a)，分別為73.5％、59.0％的抑制率。腫瘤重量方面也同樣，對照組為0.39±0.19g，與此相對，k5-116-2-1抗體投與組、t6-16抗體投與組則為0.10±0.07g(p<0.01，利用學生t檢驗)、0.17±0.14g(p<0.05，利用學生t檢驗)，分別顯示出72.2％、56.4％的抑制率(圖24b、圖25b)。

〔實施例23〕

[克隆k5-70在人大腸癌細胞株sw480細胞異種移植治療模型中的用量依賴性的抗腫瘤活性]

接下來，在使用人大腸癌細胞株sw480的異種移植治療模型中對k5-70抗體的用量依賴性的抗腫瘤活性進行了研究。將5×106細胞的sw480細胞移植到6周齡雌性nod-scid小鼠的右脅腹皮下，在移植起10天後(10天)腫瘤平均體積達到100mm3的階段，進行分組，分為對照組(小鼠igg10mg/kg體重投與組、n＝8，104.4±17.6mm3)、1mg/kg體重的k5-70抗體投與組(n＝8，104.3±16.1mm3)、5mg/kg體重的k5-70抗體投與組(n＝8，104.6±15.9mm3)、10mg/kg體重的k5-70抗體投與組(n＝8，104.8±14.9mm3)，每3天進行1次腹腔內投與。第42天時，對照組的腫瘤體積為713.8±354.5mm3，與此相對，k5-70抗體投與組中觀察到用量依賴性的腫瘤形成抑制活性，1mg/kg體重投與組為485.0±207.3mm3(抑制率32.1％)，5mg/kg體重投與組為339.5±253.2mm3(抑制率52.4％)，10mg/kg體重投與組為355.4±202.8mm3(抑制率50.2％，p<0.05，利用學生t檢驗)(圖26a)。同樣地，第42天時腫瘤重量方面，對照組為0.39±0.19g，與此相對，k5-70抗體的1mg/kg體重投與組則為0.24±0.11g(抑制率37.8％)，5mg/kg體重投與組為0.17±0.14g(抑制率55.8％，p<0.05，利用學生t檢驗)，10mg/kg體重投與組為0.20±0.13g(抑制率47.1％)，觀察到用量依賴性的抗腫瘤活性(圖26b)。

〔實施例24〕

[k5-70抗體在人大腸癌細胞株sw480細胞異種移植治療模型中的投與間隔的研究]

進而，為了研究k5-70抗體的最佳投與間隔，在使用了人大腸癌細胞株sw480的異種移植治療模型中，對每周1次(每7天1次)投與時的抗腫瘤活性進行了研究。將5×106細胞的sw480細胞移植到6周齡雌性nod-scid小鼠的右脅腹皮下，在移植起10天後(10天)腫瘤平均體積達到100mm3的階段進行分組，分為對照組(小鼠igg10mg/kg體重、n＝8，104.42±15.1mm3)、k5-70抗體投與組(10mg/kg體重、n＝8，104.3±16.1mm3)，7天進行1次腹腔內投與。第42天時，對照組的腫瘤體積為713.8±354.5mm3，與此相對，k5-70抗體投與組(每周投與1次)為332.3±239.9mm3(抑制率55％，p<0.05，利用學生t檢驗)(圖27a)，進而投與間隔延長為每10天1次、每2周1次時，第39天時，對照組的腫瘤體積為956.9±367.8mm3，與此相對，每10天1次的k5-70抗體投與組則為525.4±180.6mm3(抑制率45.1％，p<0.01，利用學生t檢驗)，每2周1次的k5-70抗體投與組則為459.4±217.6mm3(抑制率52.0％，p<0.01，利用學生t檢驗)(圖27b)。現有技術(us7420040、us7420041)中在使用胰臟癌細胞株(bxpc-3)的異種移植治療模型中，以20mg/kg體重每周投與抗體3次(投與間隔為2天)時，顯示出抑制率為50-60％的抗腫瘤活性，與此相對，k5-70抗體以1次投與量為一半的投與量(10mg/kg體重)、且每2周1次的投與(投與間隔為13天)時顯示出可以與現有技術媲美的抗腫瘤活性。因此，可以明確k50-70抗體以至少現有技術的12分之1的總投與量顯示出顯著的抗腫瘤活性。

〔實施例25〕

[t6-16抗體在人大腸癌細胞株sw480細胞異種移植治療模型中的用量依賴性的抗腫瘤活性]

接下來，在使用人大腸癌細胞株sw480的異種移植治療模型中，對t6-16抗體的用量依賴性的抗腫瘤活性進行了研究。將5×106細胞的sw480細胞移植到6周齡雌性nod-scid小鼠的右脅腹皮下，在移植起10天後(10天)腫瘤平均體積達到100mm3的階段進行分組，分為對照組(小鼠igg10mg/kg體重、n＝8，105.8±9.9mm3)、1mg/kg體重的t6-16抗體投與組(n＝8，104.4±13.3mm3)、5mg/kg體重的t6-16抗體投與組(n＝8，104.7±13.0mm3)、10mg/kg體重的t6-16抗體投與組(n＝8，104.8±12.4mm3)，3天進行1次腹腔內投與。第43天時，對照組的腫瘤體積為473.5±137.0mm3，與此相對，t6-16抗體投與組中觀察到用量依賴性的腫瘤形成抑制活性，1mg/kg體重投與組為397.9±97.5mm3(抑制率16.0％)，5mg/kg體重投與組為195.9±89.7mm3(抑制率58.7％，p<0.01，利用學生t檢驗)，10mg/kg體重投與組為190.2±56.5mm3(抑制率59.8％，p<0.01，利用學生t檢驗)(圖28a)。同樣地，第43天時，腫瘤重量方面，對照組為0.19±0.07g，與此相對，1mg/kg體重的t6-16抗體投與組則為0.20±0.08g，5mg/kg體重投與組為0.08±0.04g(抑制率57.9％，p<0.01，利用學生t檢驗)，10mg/kg體重投與組為0.09±0.04g(抑制率52.6％，p<0.01，利用學生t檢驗)，確認到用量依賴性的抗腫瘤活性(圖28b)。

〔實施例26〕

[t6-16抗體在人大腸癌細胞株sw480細胞異種移植治療模型中的投與間隔的研究]

進而，為了研究t6-16抗體的最佳投與間隔，在使用了人大腸癌細胞株sw480的異種移植治療模型中，對每周1次(每7天1次)以及每10天1次的投與間隔時的抗腫瘤活性進行了研究。將5×106細胞的sw480細胞移植到6周齡雌性nod-scid小鼠的右脅腹皮下，在移植起10天後(10天)腫瘤平均體積達到100mm3的階段進行分組，分為對照組(小鼠igg，10mg/kg體重、n＝8，105.8±9.9mm3)、每周1次的t6-16抗體投與組(10mg/kg體重、n＝8,105.0±11.6mm3)、每10天1次的t6-16抗體投與組(10mg/kg體重、n＝5，130.8±2.4mm3)，開始投與。第43天時，對照組的腫瘤體積為473.5±137.0mm3，與此相對，每周1次的t6-16抗體投與組為243.7±65.3mm3(抑制率48.5％，p<0.01，利用學生t檢驗)，每10天1次的t6-16抗體投與組為297.8±54.4mm3(抑制率37.1％，p<0.05，利用學生t檢驗)(圖29)。現有技術(us7420040，us7420041)在使用胰臟癌細胞株(bxpc-3)的異種移植治療模型中以20mg/kg體重的投與量每周投與3次(投與間隔為2天)時顯示抑制率為50-60％的抗腫瘤活性，與此相對，t6-16抗體以1次投與量為現有技術的一半用量且每10天投與1次(投與間隔為9天)時顯示出顯著的抗腫瘤活性。因此，可以明確t6-16抗體以至少現有技術的8分之1的總投與量顯示出顯著的抗腫瘤活性。

〔實施例27〕

[在人前列腺癌細胞株du-145異種移植預防模型中的抗腫瘤活性的研究]

通過使用du-145細胞(rikencellbank，rcb2143)的異種移植預防模型，對克隆k5-70的對人前列腺癌的抗腫瘤活性進行評價。將5×106細胞的du-145細胞移植到6周齡的雌性裸小鼠(balb/c，nu/nu)的皮下，以移植當天作為第1天，進行分組，分為對照組(小鼠igg)(n＝8)和k5-70抗體投與組(n＝8)，從第1天起以3天1次的頻率以10mg/kg體重的投與量進行腹腔內投與。第40天時，對照組的腫瘤體積為368.2±307.8mm3，與此相對，k5-70抗體投與組則為30.6±29.6mm3(p<0.05，利用學生t檢驗)，顯示出約90％的腫瘤形成抑制活性(圖30a)。腫瘤重量方面，確認到更顯著的抗腫瘤活性。第40天時，對照組的腫瘤重量為0.18±0.18g，與此相對，k5-70抗體投與組中，8個個體的腫瘤全部消失，腫瘤形成完全受到抑制(圖30b)。由以上結果可以明確，抗人trop-2單克隆抗體克隆k5-70對人前列腺癌顯示出強抗腫瘤活性。

〔實施例28〕

[k5-70抗體在使用了人胰癌細胞株pk-59細胞的肝轉移模型中的轉移抑制活性]

消化器官癌的治療中，癌轉移是左右著臨床上的予後的重要因子，控制轉移在治療上具有重要意義。若通過投與以trop-2為靶標的癌治療用抗體，不僅可以抑制腫瘤形成，還可以抑制癌細胞向其它臟器的轉移，則可以期待臨床上的較高有用性，因此是作為癌治療抗體所期待的特性。

trop-2已經確認在多種癌腫中表達，特別是顯示出在轉移灶中高表達(br.j.cancer(2008)；99：1290-1295，clin.cancerres.(2006)；12：3057-3063，mod.pathol.(2008)；21：186-191)。進而，已經報導了在對裸小鼠經脾或經胰移植導入了trop-2基因的癌細胞時，肝轉移的發病率增加(wo2010/089782，molecularcancer(2010)；9：253)，顯示出trop-2在癌轉移過程中的重要性。但是，迄今為止，尚不存在具體表明使用以trop-2為靶標的抗體在體內具有轉移抑制作用的報告。

本發明發現的抗htrop-2小鼠單克隆抗體k5-70在皮下移植了人胰臟癌細胞的異種移植模型中顯示出較好治療效果，不僅具有癌細胞的增殖抑制效果，而且體外劃痕試驗顯示，還抑制人胰癌細胞pk-59的遷移活性(migrationability)，可以認為可能還抑制體內癌的轉移。因此，使用由裸小鼠的脾臟注入pk-59細胞而引發肝轉移的模型，檢驗抗htrop-2小鼠單克隆抗體的轉移抑制效果。

在癌細胞移植前一天，將小鼠分組，按照10mg/kg體重腹腔內投與抗htrop-2單克隆抗體k5-70或對照抗體(純化小鼠igg)。第二天，通過胰蛋白酶處理剝離內源性表達htrop-2的人胰癌細胞株(pk-59)，用pbs製備2×107細胞/ml的細胞懸浮液。細胞懸浮液在至移植時為止均在冰上保管。將6～7周齡的雌性裸小鼠(balb/c，nu/nu)通過腹腔內投與戊巴比妥而麻醉，在麻醉下將左側腹部切開10～15mm，將脾臟牽出到腹腔外，使用27g的注射器，將50μl的細胞懸浮液(1x106細胞)注入脾臟內。在注入細胞4分鐘後，以5-0絲線將脾門部結紮，摘出脾臟。用4-0絲線縫合所切開的腹膜，使用閉合夾(woundclips)(autoclip9mm，bectondickinson)閉合腹部。癌細胞移植7天後，進一步按照10mg/kg體重投與k5-70抗體及對照抗體。癌細胞移植起4～6周後，通過頸椎脫臼使小鼠安樂死，摘出肝臟，確認有無轉移灶。

用作對照的投與小鼠igg的組中，移植pk-59細胞的6隻小鼠中，4隻在移植後4～6周後在肝葉邊緣部確認到明顯的轉移灶(2～7個)(圖31a，轉移發生率67％，表6)。與此相對，k5-70抗體投與組中，移植了pk-59細胞的4隻小鼠的全部個體均未確認到肝臟轉移灶，轉移發生率為0％(圖31b，表6)。

表6

克隆k5-70在對裸小鼠經脾移植pk-59細胞的肝轉移模型中的轉移抑制效果

這些結果表明，抗htrop-2抗體k5-70對人胰癌細胞株pk-59的肝轉移具有極強的抑制作用。

〔實施例29〕

[k5-70抗體在大腸癌細胞株sw480異種移植模型中的、鹽酸伊立替康投與後的癌復發模型中的抗腫瘤活性]

作為癌治療劑，近年開發出多種抑制癌細胞增殖的化療劑，一定程度上改善了治療效果，但存在伴有對癌細胞以外的正常細胞也有增殖抑制作用的副作用以及治療結束後癌復發的較大問題。因此，若能夠通過投與以trop-2為靶標的癌治療用抗體來抑制化療劑治療後的腫瘤復發，則可以期待較高的臨床上的有用性，因而這是作為癌治療抗體所期望的特性。

作為大腸癌的治療劑，近年臨床上應用5-fu、鉑製劑以及具有拓撲異構酶抑制效果的鹽酸伊立替康(topotecin，第一三共株式會社)，據報導，在動物模型中，在移植了以大腸癌為首的各種人腫瘤細胞的小鼠模型中具有抗腫瘤效果(cancerchemotherpharmacol.(1991)；28(3)：192-8)。因此，在使用了人大腸癌細胞株sw480的異種移植模型中，研究了抗htrop-2抗體克隆k5-70(小鼠igg2a)對於投與鹽酸伊立替康後的腫瘤復發的復發予防效果。將5×106細胞的sw480細胞移植到8周齡雌性nod-scid小鼠的右脅腹皮下，在移植起11天後(11天)腫瘤平均體積達到100mm3以上的階段進行分組，分為無處置組(生理鹽水投與組、n＝8，130.7±16.2mm3)、鹽酸伊立替康(cpt-11，topotecin、第一三共株式會社)投與組(n＝16，123.0±21.4mm3)，以40mg/kg體重每3天腹腔內投與1次鹽酸伊立替康，合計3次(11，14，17天)。在鹽酸伊立替康的最後一次投與起第3天(20天)，無處置組的腫瘤體積達到232.1±21.1mm3，與此相對，鹽酸伊立替康投與組為126.6±26.6mm3(p<0.01，利用學生t檢驗)，確認到明顯的腫瘤抑制效果。在該階段，基於腫瘤大小而將鹽酸伊立替康投與組分為2組，一組為k5-70抗體投與組(10mg/kg體重，n＝8，第20天的腫瘤體積126.0±28.0mm3)，另一組為小鼠igg投與組(10mg/kg體重、n＝8，第20天的腫瘤體積127.2±27.0mm3)。分別進行每3天1次的腹腔內抗體投與和腫瘤體積的測定，對腫瘤的復發進行評價(圖32)。小鼠igg投與組中，從鹽酸伊立替康的最後一次投與起第18天(35天)開始，確認存在多個具有腫瘤體積超過300mm3的明顯復發腫瘤的個體，在鹽酸伊立替康的最後一次投與起第30天(47天)時，8例中的5例中確認到超過300mm3的腫瘤(腫瘤平均體積401.7±172.7mm3)。與此相對，k5-70抗體投與組中，腫瘤復發顯著受到抑制，腫瘤平均體積為180.5±142.1mm3(p<0.05，利用學生t檢驗)(圖32)。特別是，k5-70抗體投與組中，確認到8例中有4例個體在第47天的腫瘤體積與分組時(126.0±28.0mm3)相比萎縮，小於100mm3。這些結果表明，抗htrop-2抗體k5-70對鹽酸伊立替康投與後的腫瘤復發具有極強抑制作用。

〔實施例30〕

[使用了clips技術的表位作圖]

＜材料和方法＞

肽合成

通過利用fmoc(9-芴甲氧羰基)法的固相合成獲得了本實驗中使用的直鏈型15-mer及30-mer的來自trop-2細胞外區域的肽。此外，為了進行不連續表位解析，合成了在兩端添加了半胱氨酸殘基的來自trop-2細胞外區域的17-mer的肽，通過clips技術(chemicallylinkedpeptidesonscaffoldstechnology)，再構建了具有1個或2個環結構的立體結構。添加的半胱氨酸殘基附近存在其它半胱氨酸殘基時，將其置換為丙氨酸。

表位篩選elisa

使5034種合成肽共價結合到pepscan片(445肽/片)，通過elisa法檢驗合成肽和抗體的結合。對於pepscan片而言，與用封閉緩衝液(含有4％馬血清、5％卵白白蛋白、1％tween的磷酸緩衝液)稀釋至1μg/ml的抗人trop-2單克隆抗體(k5-70、k5-107、k5-116-2-1、t5-86、t6-16)反應。洗滌後，與1000倍稀釋的過氧化物酶-二抗複合物在25℃下反應1小時。洗滌後，加入底物溶液(含有2,2'-聯氮雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)(abts)和2μl的3％雙氧水的溶液)，進行1小時顯色反應。通過ccd相機拍攝並進行圖像解析而對抗體結合活性進行定量。

對於顯示藥效的抗htrop-2單克隆抗體k5-70、k5-107、k5-116-2-1、t5-86、t6-16，利用clips(chemicallylinkedpeptidesonscaffolds)技術進行表位解析。予以說明，下面，本實施例中「胺基酸號」是指序列號2所示的胺基酸序列(htrop-2蛋白(323胺基酸殘基))中的胺基酸號。

k5-70抗體的解析結果如下述表7所示。該結果表明33個肽與k5-70抗體強烈結合。上述33個肽中，含有vcspdgpggrcqcralgsgmavd(胺基酸號43-65)的序列(表7中記載的肽no.1-7、9)、含有hhilidlrhrptag(胺基酸號152-165)的序列(表7中記載的肽no.14、22-24、28)、含有vhyeqptiqielrq(胺基酸號193-206)的序列(表7中記載的肽no.8、10、12、13、18、20、21、23、26、28、30、32)、含有dldaelrrlfrer(胺基酸號171-183)的序列(表7中記載的肽no.11、16、18、19、21、22、29、31)反覆出現。k5-70抗體尤其與含有vcspdgpggrcqcralgsgmavd的序列強烈結合。這些結果暗示，htrop-2蛋白中的上述4種肽序列區域可能為k5-70抗體的表位。

表7

k5-70抗體對來自於人trop-2細胞外區域的clips肽的結合

k5-107的解析結果如下述表8所示。其結果是，含有vcspdgpggrcqcralgsgmavd(胺基酸號43-65)的序列包含在20個肽中的10個肽(表8中記載的肽no.1-6、8、9、14、17)中(表8)。

因此表明，htrop-2蛋白中的上述vcspdgpggrcqcralgsgmavd的肽序列區域為k5-107抗體的表位。

表8

k5-107抗體對來自於人trop-2細胞外區域的clips肽的結合

k5-116-2-1抗體的解析結果如下述表9所示。該解析中，含有vcspdgpggrcqcralgsgmavd(胺基酸號43-65)的序列(表9中記載的肽no.1-7、15、25)、含有hhilidlrhrptag(胺基酸號152-165)的序列(表9中的肽no.8-11、16、17、19、20、22-24、27-29)、含有dldaelrrlfrer(胺基酸號171-183)的序列(表9中記載的肽no.11-14、17、19、21、23、29)這3種肽序列多次出現(表9)。因此表明，htrop-2蛋白中的這3種肽序列區域為k5-116-2-1抗體的表位。

表9

k5-116-2-1抗體對來自於人trop-2細胞外區域的clips膚的結合

t5-86及t6-16抗體的解析結果如下述表10及表11所示。該解析中，與含有dpegrfkarqcn(胺基酸號109-120)的序列的肽強烈結合。與t5-86抗體結合的26個肽中的22個肽(表10中記載的肽no.1-4、6-8、10-13、15-19、21-26)中包含上述肽序列，與t6-16抗體結合的26個肽中的4個肽(表11中的肽no.1，2，9，13)包含上述肽序列(表10及表11)。此外，t5-86抗體的解析中，除了包含dpegrfkarqcn(胺基酸號109-120)的序列以外，含有vcspdgpggrcqcra(胺基酸號43-57)的序列(表10中記載的肽no.5、14、20)多次出現。進而，t6-16抗體的解析中，多次確認到另一序列、即含有hhilidlrhrptag(胺基酸號152-165)的序列(表11中記載的肽no.4-8、10-12、19、21、23、25、26)。因此表明，t5-86抗體的表位為htrop-2蛋白中的dpegrfkarqcn(胺基酸號109-120)、vcspdgpggrcqcra(胺基酸號43-57)這2種肽序列區域，t6-16抗體的表位為htrop-2蛋白中的dpegrfkarqcn(胺基酸號109-120)、hhilidlrhrptag(胺基酸號152-165)這2種肽序列區域。

表10

t5-86抗體對來自於人trop-2細胞外區域的clips肽的結合

表11

t6-16抗體對來自於人trop-2細胞外區域的clips膚的結合

〔實施例31〕

[小鼠抗htrop-2抗體(克隆k5-70、k5-107、k5-116-2-1及t6-16)的抗體基因的可變區的序列確定]

使用trizol試劑(invitrogen)，由3×106個小鼠抗trop-2單克隆抗體產生雜交瘤提取總rna。對克隆k5-70、克隆k5-107和克隆k5-116-2-1使用smartertmracecdnaamplificationkit(clontech)，按照試劑盒所附方法，使用小鼠igg的h鏈特異性引物(5』-tccakagttcca-3』(序列號24))和l鏈特異性引物(5』-gctgtcctgatc-3』(序列號25))合成cdna。對於克隆t6-16，使用generacerkit(invitrogen)，按照試劑盒所附方法，使用寡dt引物合成cdna。編碼克隆k5-70(小鼠igg2a)、克隆k5-107(小鼠igg1)、以及克隆k5-116-2-1(小鼠igg2a)的h鏈及l鏈的可變區(vh、vl)的基因則以上述合成後的cdna為模板使用pcr法進行克隆。此時，5』-引物使用的是smartertmracecdnaamplificationkit附帶的10×universalprimeramix(upm)。另一方面，就3』-引物而言，作為vh擴增用3』-引物，使用具有小鼠iggh鏈特異性序列的引物，作為vl擴增用3』-引物，使用具有小鼠iggl鏈特異性的序列的引物。

5』-引物(10×universalprimeramix(upm))：

long(0.4μm)

5′-ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt-3′(序列號26)

short(2μm)

5』-ctaatacgactcactatagggc-3』(序列號27)

3』-引物(r引物)：

vh：5』-gggaartartarcccttgaccaggca-3』(序列號28)

5』-gggaartagcctttgacaaggca-3』(序列號29)

vl：5』-cactgccatcaatvctccacttgaca-3』(序列號30)

使用了上述各引物的pcr按照以下反應液組成及反應條件進行。此外，vh的cdna擴增的r引物使用的是等摩爾混合上述2序列的混合物。

94℃(10秒)反應後，以「熱變性·解離：98℃(10秒)→退火：60℃(5秒)→合成·伸長：72℃(60秒)」作為一個循環，進行共30個循環的反應後，最後在72℃(3分鐘)反應。

將合成的vh及vl的cdna亞克隆到pmd20-t載體(寶生物)，確定鹼基序列。解讀多個vh克隆及vl克隆的鹼基序列，鑑定了小鼠h鏈及l鏈的可變區中典型的鹼基序列。圖33及圖34中示意出k5-70的vh及vl的共通(consensus)cdna鹼基序列以及推定胺基酸序列。圖35及圖36中示意出k5-107的vh及vl的共通cdna鹼基序列以及推定胺基酸序列。圖37及圖38中示意出k5-116-2-1的vh及vl的共通cdna鹼基序列以及推定胺基酸序列。

編碼克隆t6-16的h鏈及l鏈的可變區(vh、vl)的基因則以上述合成後的cdna為模板使用pcr法進行克隆。此時，5』-引物使用了generacerkit附帶的引物。另一方面，就3』-引物而言，作為vh擴增用3』-引物，使用具有小鼠iggh鏈特異性序列的引物，作為vl擴增用3』-引物，使用具有小鼠iggl鏈特異性序列的引物。

5』-引物(f引物)：

5』-cgactggagcacgaggacactga-3』(序列號31)

3』-引物(r引物)：

vh：5』-gccagtggatagacagatgg-3』(序列號32)

vl：5』-gatggatacagttggtgcagc-3』(序列號33)

使用了上述各引物的pcr按照以下的反應液組成及反應條件進行。

＜反應液組成＞

以「熱變性·解離：98℃(10秒)→退火：57℃(10秒)→合成·伸長：72℃(60秒)」為1個循環，進行共35個循環。

將合成的vh及vl的cdna亞克隆到pcr4blunt-topovector(invitrogen)，確定鹼基序列。解讀多個vh克隆及vl克隆的鹼基序列，鑑定了小鼠h鏈及l鏈的可變區中典型的鹼基序列。圖39及圖40中示意出t6-16的vh及vl的共通cdna鹼基序列以及推定胺基酸序列。

〔實施例32〕

[人源化k5-70抗體的設計]

對於之前的實施例中製作的k5-70抗體，按照queen等的方法(proc.natl.acad.sci.usa86：10029-10033，1989)如下進行其可變區(vh、vl)的人源化。首先，利用計算機進行k5-70抗體可變區的立體結構的分子建模，然後，通過與人抗體基因的可變區序列的同源性檢索，選擇genbank登錄號為da980102的cdna序列(da980102vh)作為提供k5-70vh的人源化所需的框架(fr)區的接納體(genomeres.16:55-65,2006)。同樣地，選擇genbank登錄號為l41174的cdna序列(l41174vl)作為提供k5-70vl的人源化所需的框架(fr)區的接納體(j.biol.chem.270:12457-12465,1995)。

在k5-70vh的人源化中，將k5-70vh的cdr序列置換插入作為接納體的da980102vh的對應位置。通過利用計算機建模進行的立體結構解析，對於與k5-70vh的cdr相鄰、被認為對其結構維持起到重要作用的胺基酸殘基(第48位的異亮氨酸(i)、第66位的賴氨酸(k)、第67位的丙氨酸(a)、第71位的纈氨酸(v)、第93位的蘇氨酸(t))，保持k5-70vh的胺基酸殘基，將除此以外的fr區置換為接納體序列。vh及vl內的胺基酸殘基位置號根據kabat等的定義(sequencesofproteinsofimmunologicalinterests,fifthedition,nihpublicationno.91-3242,u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991)。

此外，認為作為接納體序列da980102vh的第82位的胺基酸殘基的蛋氨酸(m)很可能為高突變所致的特殊的胺基酸殘基。因此，為了減小潛在的抗原性，作為第82位的胺基酸殘基，置換為最一般的亮氨酸(l)。如上所述設計的人源化k5-70vh(huk5-70vh)、k5-70vh及da980102vh的胺基酸序列比對示於圖41。

關於人源化k5-70vl的設計，也同樣地進行cdr序列的移植，對於cdr的結構維持重要的胺基酸殘基(第49位的賴氨酸(k))保持k5-70vl的胺基酸殘基，將除此以外的fr區置換為接納體序列(huk5-70vl)。huk5-70vl、k5-70vl及l41174vl的胺基酸序列比對示於圖42。

〔實施例33〕

[人源化t6-16抗體的設計]

對於之前的實施例中製作的t6-16抗體，按照queen等的方法(proc.natl.acad.sci.usa86：10029-10033，1989)如下進行其可變區(vh、vl)的人源化。首先，利用計算機進行t6-16抗體可變區的立體結構的分子建模，然後，通過與人抗體基因的可變區序列的同源性檢索，選擇genbank登錄號為da935238的cdna序列(da935238vh)作為提供t6-16vh的人源化所需的框架(fr)區的接納體(genomeres.16:55-65,2006)。同樣地，選擇genbank登錄號為m99608的cdna序列(m99608vl)作為提供t6-16vl的人源化所需的框架(fr)區的接納體(j.immunol.149:2518-2529,1992)。

在t6-16vh的人源化中，將t6-16vh的cdr序列置換插入作為接納體的da935238vh的對應位置。通過利用計算機建模進行的立體結構解析，對於與t6-16vh的cdr相鄰、被認為對其結構維持起到重要作用的胺基酸殘基(第48位的異亮氨酸(i)、第67位的丙氨酸(a)、第73位的賴氨酸(k))，保持t6-16vh的胺基酸殘基，將除此以外的fr區置換為接納體序列(hut6-16vh1)。此外，關於第73位的賴氨酸殘基(k)，有可能對抗原結合位點的適當形成影響小，另外設計了將hut6-16vh1的賴氨酸殘基置換為更寬容的胺基酸殘基蘇氨酸(t)的胺基酸序列(hut6-16vh2)。設計的人源化t6-16vh(hut6-16vh1及hut6-16vh2)、t6-16vh及da935238vh的胺基酸序列比對示於圖43。

關於人源化t6-16vl的設計，也同樣地進行cdr序列的移植。對於cdr的結構維持重要的胺基酸殘基在接納體序列中被保持，fr序列使用了與接納體序列相同的序列(hut6-16vl)。hut6-16vl、t6-16vl及l41174vl的胺基酸序列比對示於圖44。

〔實施例34〕

[人源化k5-70vh及vl基因合成]

編碼huk5-70vh及huk5-70vl的基因如下製作。在如上設計的huk5-70vh及vl的n末端側分別添加來自k5-70vh、vl的信號肽序列，基於所得到的胺基酸序列進行基因合成(operon公司)。此時，在分別合成的huk5-70vh及huk5-70vl的基因序列的5』末端側添加kozak序列(accacc)，此外在huk5-70vh的5』末端添加作為限制酶位點的ecori的位點(gaattc)，在3』末端添加nhei(gctagc)的位點。同樣地，在huk5-70vl的5』末端添加作為限制酶位點的agei的位點(accggt)，在3』末端添加bsiwi的位點(cgtacg)。所合成的huk5-70vh基因及huk5-70vl基因通過ta克隆引入pcr2.1載體(invitrogen)中。通過基因合成製作的huk5-70vh及vl的基因序列分別示於圖45及46。

〔實施例35〕

[人源化t6-16vh1、t6-16vh2及t6-16vl基因合成]

編碼hut6-16vh1、hut6-16vh2及hut6-16vl的基因如下製作。在所設計的hut6-16vh1、hut6-16vh2的n末端側添加來自t6-16vh的信號肽序列，在hut6-16vl的n末端側添加來自t6-16vl的信號肽序列，基於所得到的胺基酸序列進行基因合成(operon公司)。此時，在分別合成的hut6-16vh1、hut6-16vh2及hut6-16vl的基因序列的5』末端側添加kozak序列(accacc)，此外在hut6-16vh1及hut6-16vh2的5』末端添加作為限制酶位點的ecori的位點(gaattc)，在3』末端添加nhei的位點(gctagc)。同樣地，在人源化t6-16vl的5』末端添加作為限制酶位點的agei的位點(accggt)，在3』末端添加bsiwi的位點(cgtacg)。所合成的hut6-16vh1基因和hut6-16vh2基因以及hut6-16vl基因通過ta克隆引入pcr2.1載體(invitrogen)中。

通過基因合成所製作的hut6-16vh1、hut6-16vh2及hut6-16vl的基因序列分別示於圖47～49。

〔實施例36〕

[人源化k5-70vh及vl基因表達載體構建]

對於引入pcr2.1載體(invitrogen)中的huk5-70vh及vl基因，分別用限制酶ecori及nhei、agei及bsiwi消化，進行基因片段的回收。然後，所切出的huk5-70vh基因插入人igg1型的表達用的動物細胞表達載體的pfuse-chig-hg1載體(invivogen)的ecori/nhei位點(pfuse-chig-huk5-70)，huk5-70vl基因插入人igκ型表達用載體pfuse2-clig-hk載體(invivogen)的agei/bsiwi位點(pfuse2-clig-huk5-70)，分別完成構建。

〔實施例37〕

[人源化t6-16vh1、t6-16vh2及t6-16vl基因表達載體構建]

對於引入pcr2.1載體(invitrogen)中的t6-16vh1、t6-16vh2基因，利用限制酶ecori及nhei消化，t6-16vl基因用agei及bsiwi消化，進行基因片段的回收。然後，所切出的t6-16vh1基因插入pfuse-chig-hg1載體(invivogen)的ecori/nhei位點(pfuse-chig-hut6-16-1)，t6-16vh2基因也同樣地插入pfuse-chig-hg1載體(invivogen)的ecori/nhei位點(pfuse-chig-hut6-16-2)，t6-16vl基因插入pfuse2-clig-hk載體(invivogen)的agei/bsiwi位點(pfuse2-clig-hut6-16)，分別完成構建。

〔實施例38〕

[穩定表達huk5-70抗體、hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體的293f細胞株的建立]

在freestyle293expressionmedium(invitrogen)中維持、培養293f細胞(invitrogen)。向293f細胞的基因導入使用293fectin試劑(invitrogen)、根據所附的方案進行。將pfuse-chig-huk5-70和pfuse2-clig-huk5-70均導入293f細胞中，利用博萊黴素(zeocin)(invivogen)和殺稻瘟菌素(blasticidin)(invivogen)進行藥劑篩選，由此建立穩定表達huk5-70抗體的細胞株。同樣地，將pfuse-chig-hut6-16-1和pfuse2-clig-hut6-16均導入293f細胞，進行上述藥劑篩選，由此建立穩定表達hut6-16-1抗體的細胞株。此外，同樣地將pfuse-chig-hut6-16-2和pfuse2-clig-hut6-16導入293f細胞，進行上述藥劑篩選，由此建立穩定表達hut6-16-2抗體的細胞株。

〔實施例39〕

[huk5-70抗體、hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體蛋白的純化]

所建立的各抗體表達細胞株按照1～2.5x105細胞/ml接種到freestyle293表達培養基(invitrogen)中，進行滾瓶培養6～8天。回收培養上清後，使用rproteinasepharosefastflow(gehealthcare)根據常規方法進行各人源化抗體的純化。

圖50示出利用蛋白印跡法確認了表達huk5-70抗體、hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體的293f細胞的培養上清中的各人源化抗體蛋白的表達的圖。具體而言，進行sds-page後，轉印到pvdf膜(immobilon-p,millipore,ipvh00010)上。對於膜，使用含有5％脫脂乳的tbs(tris-bufferedsaline)在室溫下進行30分鐘封閉。用0.1％tbst(含有0.1％tween20的tbs)以5分鐘各洗滌3次後，與一抗進行反應。

條帶1表示未進行基因導入的293f細胞的培養上清(陰性對照)，條帶2表示導入了pfuse-chig-huk5-70和pfuse2-clig-huk5-70的293f細胞的培養上清。huk5-70抗體的重鏈及輕鏈蛋白的檢測使用生物素標記的抗人iggf(ab』)2抗體(rockland)。條帶3表示在293f細胞中導入了pfuse-chig-hut6-16-1及pfuse2-clig-hut6-16的293f細胞的上清，條帶4表示導入了pfuse-chig-hut6-16-2及pfuse2-clig-hut6-16的293f細胞的上清，hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體的重鏈蛋白用生物素標記的抗人iggfc抗體(rockland)檢測，hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體的輕鏈蛋白用生物素標記的抗人iggf(ab』)2抗體(rockland)檢測。

其結果為，huk5-70抗體、hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體均在重鏈及輕鏈蛋白的培養上清中確認了表達。

此外，圖51表示將純化的huk5-70抗體、hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體用sds-page展開後進行了cbb染色的圖。在還原條件下，均檢測到約50kd的重鏈和約25kd的輕鏈，在與利用上述蛋白印跡法檢測出的各重鏈及輕鏈相同的位置確認了條帶。由以上結果確認了huk5-70抗體蛋白、hut6-16-1抗體蛋白及hut6-16-2抗體蛋白的產生。

〔實施例40〕

[人源化k5-70抗體(huk5-70)及人源化t6-16抗體(hut6-16-1,hut6-16-2)的抗原親和性]

通過facs和使用了elisa的方法對純化的huk5-70抗體、hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體的抗原親和性進行了研究。

facs使用實施例5中記載的使hek293細胞穩定表達人全長trop-2基因的hek293-htrop-2細胞和在細胞表面內源性表達人trop-2蛋白的胰臟癌細胞株pk-59進行。對於通過胰蛋白酶處理由培養皿剝離的細胞(hek293-htrop-2細胞或pk-59細胞)的懸浮液(5x105細胞)，加入用含有10％fcs的培養基稀釋成1μg/ml的抗體溶液100μl作為一抗，在4℃溫育20分鐘。然後，用1ml的含有10％fcs的培養基洗滌，加入將藻紅蛋白(pe)標記抗小鼠igg抗體(bdpharmingen)及生物素標記抗人iggfc抗體(rockland)分別稀釋200倍、2000倍的二抗溶液100μl。在4℃溫育20分鐘後，再次用1ml的含有10％fcs的培養基進行洗滌。在使用生物素標記抗人iggfc抗體作為二抗時，作為螢光標記試劑加入將鏈黴親和素標記pe(bdpharmingen)稀釋400倍的標記溶液100μl，在4℃溫育20分鐘後，用1ml的含有10％fcs的培養基進行洗滌。然後，含有標記細胞的樣品懸浮於1ml的含有1％fcs、2mmedta的pbs中，使用facscalibur(bectondickinson)進行解析。其結果是，在hek293-htrop-2細胞中、在pk-59細胞中，huk5-70抗體均顯示出與小鼠k5-70抗體同等的反應性。同樣地，hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體也顯示出與t6-16抗體同等的反應性(圖52)。

進一步利用elisa法對抗原親和性進行了驗證。elisa使用將實施例3所示的htrop-2細胞外區域的重組蛋白固相化的elisa板進行。具體而言，對於96孔板(bdfalcon)，以50μl/孔用以pbs稀釋為0.5μg/ml的htrop-2細胞外區域的重組蛋白進行包覆(4℃、一晩)。用洗滌緩衝液(含有0.05％tween20的pbs)洗滌後，以200μl/孔添加封閉緩衝液(含有2％脫脂乳、0.05％tween20的pbs)進行封閉(室溫、1小時)。用洗滌緩衝液洗滌後，對於huk5-70抗體、hut6-16-1抗體、hut6-16-2抗體、k5-70抗體及t6-16抗體，用elisa緩衝液(含有1％脫脂乳、0.025％tween20的pbs)在3.05x10-4～5μg/ml的範圍製備2倍稀釋系列樣品，按照各50μl/孔進行添加(室溫、2小時)。用洗滌緩衝液洗滌後，作為檢測用抗體，以50μl/孔添加用elisa緩衝液稀釋2000倍的hrp標記山羊抗人κ鏈抗體(southernbiotech)或者稀釋2000倍的hrp標記綿羊抗小鼠igg抗體(gehealthcare)(室溫、1小時)。用洗滌緩衝液洗滌後，以50μl/孔添加tmb(3,3』,5,5』-四甲基聯苯胺、sigma)作為底物溶液，進行顯色反應。以25μl/孔加入1m硫酸使反應停止後，使用酶標儀model550(biorad)，將655nm的吸光度作為參照來測定450nm的吸光度。其結果是，k5-70和huk5-70的反應曲線幾乎重疊，ec50分別為27ng/ml、22ng/ml(圖53)。同樣地，t6-16、hut6-16-1及hut6-16-2的反應曲線也幾乎重疊，ec50分別為30ng/ml、27ng/ml、27ng/ml(圖54)。由這些結果可以明確，huk5-70抗體、hut6-16-1抗體及hut6-16-2抗體分別顯示出與人源化前的母源抗體k5-70或t6-16抗體同等的抗原親和性。

〔實施例41〕

[人源化抗htrop-2抗體(huk5-70)的體內的抗腫瘤活性]

然後，在使用在細胞表面內源性表達人trop-2的人大腸癌細胞株sw480的異種移植治療模型中研究了huk5-70抗體的體內的抗腫瘤活性。將5×106細胞的sw480細胞移植到7周齡雌性nod-scid小鼠的右脅腹皮下(1天)，在腫瘤平均體積達到100mm3的階段進行分組(9天)，從第9天起按每3天1次的投與間隔開始抗體的腹腔內投與。癌細胞移植後第39天(day39)的對照組(投與pbs，n＝8)的腫瘤體積為824.3±188.8mm3，與此相對，huk5-70抗體投與組(10mg/kg體重,n＝8)則為455.5±208.6mm3(p<0.01，利用學生t檢驗)，腫瘤形成受到顯著抑制(抑制率44.7％)(圖55a)。腫瘤重量方面，對照組為0.509±0.161g，與此相對，huk5-70抗體投與組則為0.272±0.162g(p<0.05，利用學生t檢驗)，為46.6％的抑制率(圖55b)。

〔實施例42〕

[人源化抗htrop-2抗體(huk5-70和hut6-16-2)在人大腸癌細胞株sw480細胞異種移植治療模型中的用量依賴性的抗腫瘤活性]

在使用人大腸癌細胞株sw480的異種移植治療模型中對huk5-70及hut6-16-2抗體的用量依賴性的抗腫瘤活性進行了研究。將5×106細胞的sw480細胞移植到7周齡雌性nod-scid小鼠的右脅腹皮下(1天)，癌細胞移植後第9天(9天)在腫瘤平均體積達到100mm3的階段進行分組，分成對照組(pbs投與組、n＝8，101.65±8.35mm3)、1mg/kg體重的huk5-70抗體投與組(n＝8，103.18±9.86mm3)、5mg/kg體重的huk5-70抗體投與組(n＝8，101.34±8.94mm3)、10mg/kg體重的huk5-70抗體投與組(n＝8，101.53±8.98mm3)、1mg/kg體重的hut6-16-2抗體投與組(n＝8，103.18±9.86mm3)、5mg/kg體重的hut6-16-2抗體投與組(n＝8，101.34±8.94mm3)、10mg/kg體重的hut6-16-2抗體投與組(n＝8，101.53±8.98mm3)，從第9天起按每3天1次的間隔進行抗體的腹腔內投與。癌細胞移植後第48天(48天)的對照組的腫瘤體積為754.67±276.05mm3，與此相對，在huk5-70抗體投與組中，1mg/kg體重投與組為521.81±183.45mm3(抑制率30.9％)，5mg/kg體重投與組為258.78±137.02mm3(抑制率65.7％,p<0.01，利用學生t檢驗)，10mg/kg體重投與組為314.60±152.89mm3(抑制率58.3％,p<0.01，利用學生t檢驗)(圖56a)。在hut6-16-2抗體投與組中，1mg/kg體重投與組為600.41±319.84mm3(抑制率20.4％)，5mg/kg體重投與組為315.32±189.02mm3(抑制率58.2％,p<0.01，利用學生t檢驗)，10mg/kg體重投與組為270.79±266.71mm3(抑制率64.1％,p<0.01，利用學生t檢驗)(圖57a)。第48天的腫瘤重量方面，對照組為0.422±0.201g，與此相對，在huk5-70抗體投與組中，1mg/kg體重投與組為0.301±0.160g(抑制率28.7％)，5mg/kg體重投與組為0.115±0.083g(抑制率72.7％,p<0.01，利用學生t檢驗)，10mg/kg體重投與組為0.244±0.181g(抑制率42.2％)(圖56b)。在hut6-16-2抗體投與組中，1mg/kg體重投與組為0.422±0.255g(抑制率0％)，5mg/kg體重投與組為0.247±0.151g(抑制率41.5％)，10mg/kg體重投與組為0.190±0.190g(抑制率53.1％,p<0.01，利用學生t檢驗)(圖57b)。由這些結果確認了huk5-70和hut6-16-2抗體的用量依賴性的抗腫瘤活性。

〔實施例43〕

[抗htrop-2小鼠單克隆抗體k5-70及t6-16在人卵巢癌細胞株sk-ov-3細胞異種移植治療模型中的抗腫瘤活性]

在使用在細胞表面內源性表達htrop-2的人卵巢癌細胞株sk-ov-3的異種移植治療模型中對母源抗體k5-70及t6-16抗體的體內的抗腫瘤活性進行了研究。將5×106細胞的sk-ov-3細胞移植到7周齡雌性裸小鼠的右脅腹皮下(1天)，癌細胞移植後第11天(11天)對確認了明確的腫瘤形成的個體(腫瘤平均體積約50mm3)進行分組，從第11天起按照每周2次的投與間隔進行抗體的腹腔內投與。癌細胞移植後第56天(56天)的對照組(投與pbs，n＝8)的腫瘤體積為652.6±349.1mm3，與此相對，k5-70抗體投與組(10mg/kg體重，n＝8)則為253.7±137.3mm3(p<0.01，利用學生t檢驗)，腫瘤形成受到顯著抑制(抑制率61.1％)，t6-16抗體投與組(10mg/kg體重，n＝8)則為214.6±98.6mm3(p<0.01，利用學生t檢驗)，腫瘤形成受到顯著抑制(抑制率67.1％)(圖58a)。腫瘤重量方面，對照組為0.413±0.218g，與此相對，k5-70抗體投與組則為0.194±0.112(g)(p<0.05，利用學生t檢驗)、為53.0％的抑制率，t6-16抗體投與組則為0.183±0.093(g)(p<0.05，利用學生t檢驗)、為55.7％的抑制率(圖58b)。

〔實施例44〕

[抗htrop-2小鼠單克隆抗體k5-70及t6-16在人乳腺癌細胞株mda-mb-468細胞異種移植治療模型中的抗腫瘤活性]

同樣地，在使用在細胞表面內源性表達htrop-2的人乳腺癌細胞株mda-mb-468的異種移植治療模型中對k5-70以及t6-16抗體的體內的抗腫瘤活性進行了研究。將5×106細胞的mda-mb-468細胞移植到7周齡雌性裸小鼠的右脅腹皮下(1天)，癌細胞移植後第12天(12天)對確認了明確的腫瘤形成的個體(腫瘤平均體積約50mm3)進行分組，從第12天起按照每周2次的投與間隔進行抗體的腹腔內投與。癌細胞移植後第54天(54天)的對照組(投與pbs，n＝8)的腫瘤體積為218.6±75.5mm3，與此相對，k5-70抗體投與組(10mg/kg體重，n＝8)則為70.2±37.4mm3(p<0.01，利用學生t檢驗)，腫瘤形成受到顯著抑制(抑制率67.9％)，t6-16抗體投與組(10mg/kg體重，n＝8)則為88.3±42.9mm3(p<0.01，利用學生t檢驗)，腫瘤形成受到顯著抑制(抑制率59.6％)(圖59a)。第54天的腫瘤重量方面，對照組為0.142±0.049g，與此相對，k5-70抗體投與組則為0.050±0.033(g)(p<0.01，利用學生t檢驗)、為64.8％的抑制率，t6-16抗體投與組則為0.077±0.046(g)(p<0.05，利用學生t檢驗)、為45.8％的抑制率(圖59b)。

〔實施例45〕

[抗htrop-2小鼠單克隆抗體k5-70及t6-16在人肺癌細胞株calu-3細胞異種移植治療模型中的抗腫瘤活性]

同樣地，在使用在細胞表面內源性表達htrop-2的人肺癌細胞株calu-3的異種移植治療模型中對k5-70抗體的體內的抗腫瘤活性進行了研究。將5×106細胞的calu-3細胞移植到7周齡雌性裸小鼠的右脅腹皮下(1天)，癌細胞移植後第9天(9天)對確認了明確的腫瘤形成的個體(腫瘤平均體積約100mm3)進行分組，從第9天起按照每周2次的投與間隔進行抗體的腹腔內投與。癌細胞移植後第41天(41天)的對照組(投與pbs，n＝8)的腫瘤體積為395.7±221.2mm3，與此相對，k5-70抗體投與組(10mg/kg體重，n＝8)則為120.7±125.6mm3(p<0.01，利用學生t檢驗)，腫瘤形成受到顯著抑制(抑制率69.5％)，t6-16抗體投與組(10mg/kg體重，n＝8)則為146.3±128.4mm3(p<0.05，利用學生t檢驗)，腫瘤形成受到顯著抑制(抑制率63.0％)(圖60a)。腫瘤重量方面，對照組為0.301±0.189g，與此相對，k5-70抗體投與組則為0.08±0.085(g)(p<0.01，利用學生t檢驗)、為73.5％的抑制率，t6-16抗體投與組則為0.106±0.096(g)(p<0.05，利用學生t檢驗)、為64.9％的抑制率(圖60b)。

〔實施例46〕

[抗htrop-2小鼠單克隆抗體k5-70在人膽管癌細胞株tfk-1細胞異種移植預防模型中的抗腫瘤活性]

同樣地，在使用在細胞表面內源性表達htrop-2的人膽管癌細胞株tfk-1的異種移植預防模型中對k5-70抗體的體內的抗腫瘤活性進行了研究。將5×106細胞的tfk-1細胞移植到7周齡雌性裸小鼠的右脅腹皮下(1天)，從該天起按照每周2次的投與間隔開始抗體的腹腔內投與。癌細胞移植後第31天(31天)的對照組(投與pbs，n＝5)的腫瘤體積為1000.4±268.9mm3，與此相對，k5-70抗體投與組(10mg/kg體重，n＝5)則為197.2±215.5mm3(p<0.01，利用學生t檢驗)，腫瘤形成受到顯著抑制(抑制率80.3％)(圖61a)。腫瘤重量方面，對照組為0.443±0.070g，與此相對，k5-70抗體投與組則為0.063±0.052(g)(p<0.01，利用學生t檢驗)、為85.8％的抑制率(圖61b)。

〔實施例47〕

[huk5-70及hut6-16-2抗體的親合力解析]

關於huk5-70及hut6-16-2抗體的抗原結合活性，通過使用了將低密度的抗原固相化的96孔板的elisa法(低密度抗原固相化elisa)進行了研究。在96孔板中按照50μl/孔添加用0.1m乙酸緩衝液(ph5.3)製備成0.1μg/ml的重組htacstd2-fc-his蛋白(creativebiomart)，在4℃包覆一晩後，進行與實施例40同樣的解析。對於被測抗體，用elisa緩衝液(含有1％脫脂乳、0.025％tween20的pbs)由20μg/ml開始製作2倍稀釋系列(15點)而使用。其結果是，hut6-16-2抗體為與t6-16抗體幾乎同等的結合活性(ec50值分別為49ng/ml和41ng/ml)，與此相對，huk5-70抗體的ec50值為k5-70抗體的約20倍(分別為222ng/ml、12ng/ml、圖62)。

接下來，通過解析一價的抗原-抗體反應的elisa對huk5-70及k5-70抗體的抗原結合活性進行了研究。在96孔板中按照50μl/孔添加用0.1m乙酸緩衝液(ph5.3)稀釋成1μg/ml的山羊抗人igg(fcγ特異性的)(southernbiotech)及稀釋成3μg/ml的山羊抗小鼠igg(γ鏈特異性的)(southernbiotech)，在4℃包覆一晩。用洗滌緩衝液(含有0.05％tween20的pbs)洗滌後，按照200μl/孔添加封閉緩衝液(含有2％脫脂乳、0.05％tween20的pbs)進行封閉(室溫、1小時)。用洗滌緩衝液洗滌後，按照50μl/孔添加用elisa緩衝液(含有1％脫脂乳、0.025％tween20的pbs)稀釋成1μg/ml的試驗抗體。此時，向包覆了山羊抗人igg(fcγ特異性的)的孔中添加huk5-70抗體，向包覆了山羊抗小鼠igg(γ鏈特異性的)的孔中添加k5-70抗體。在室溫下靜置1小時後，用洗滌緩衝液洗滌，對於實施例3所示的htrop-2細胞外區域的重組蛋白(htrop-2ec)，用elisa緩衝液由5μg/ml起製作3倍稀釋系列(10點)，按照各50μl/孔進行添加。在室溫下靜置1小時後，用洗滌緩衝液洗滌，按照50μl/孔添加用elisa緩衝液稀釋成2μg/ml的抗his(g-18)(santacruz)作為一抗。在室溫下靜置1小時後，用洗滌緩衝液洗滌，按照50μl/孔添加用elisa緩衝液稀釋1000倍的hrp標記抗兔igg(gehealthcare)作為二抗。在室溫下靜置1小時後，用洗滌緩衝液洗滌，按照50μl/孔添加tmb(3,3』,5,5』-四甲基聯苯胺，sigma)作為底物溶液，進行顯色反應。以25μl/孔加入1m硫酸使反應停止後，使用酶標儀model550(biorad)，將655nm的吸光度作為參照來測定450nm的吸光度。其結果是，由htrop-2ec蛋白與k5-70及huk5-70抗體的結合曲線計算出的ec50分別為7ng/ml、6ng/ml(圖63)。由此表示，在一價的抗原-抗體反應中huk5-70抗體和k5-70抗體為同等的抗原親和性(親和)。

如實施例40所示，在使用了將高密度的抗原(0.5μg/ml)固相化的96孔板的elisa法(抗原固相化elisa)中，k5-70抗體和huk5-70抗體的抗原親和性同等(圖53)，因而，作為在將低密度的抗原(0.1μg/ml)固相化的elisa法中huk5-70抗體的抗原結合活性比k5-70抗體相對低的原因，認為是在huk7-50抗體中與2個抗原結合臂的運動能力有關的柔軟性、即所謂「親合力(avidity)」方面與k5-70抗體相比相對較低。

〔實施例48〕

[人源化k5-70抗體的突變體的製作和特性描述]

為了提高huk5-70抗體的「親合力(avidity)」，進行了以下的實驗。

利用以下的實驗對如上所述huk5-70抗體的「親合力(avidity)」相對較低是起因於vh和vl中哪一個進行了研究。首先，通過基因合成製作了編碼母源抗體k5-70抗體的h鏈可變區(k5-70vh)及l鏈可變區(k5-70vl)的基因(operon公司)。此時，在k5-70vh及k5-70vl的基因序列的5』末端側添加kozak序列(accacc)。進而在k5-70vh的5』末端附加了作為限制酶位點的ecori的位點(gaattc)，在3』末端附加了nhei的位點(gctagc)。同樣地，在k5-70vl的5』末端附加了作為限制酶位點的agei的位點(accggt)，在3』末端附加了bsiwi的位點(cgtacg)。所合成的k5-70vh基因及k5-70vl基因被引入pcr2.1載體(invitrogen)中。通過基因合成所製作的k5-70vh及vl的基因序列分別示於圖64和圖65中。被引入pcr2.1載體中的k5-70vh及k5-70vl基因分別利用限制酶ecori及nhei、agei及bsiwi消化，進行基因片段的回收。然後，所切出的k5-70vh基因插入人igg1型表達用載體pfuse-chig-hg1載體(invivogen)的ecori/nhei位點，k5-70vl基因插入人igκ型表達用載體pfuse2-clig-hk載體(invivogen)的agei/bsiwi位點，完成了小鼠-人嵌合結構(pfuse-chig-muk5-70、pfuse2-clig-muk5-70)。

將上述所製作的結構與實施例36中製作的huk5-70h鍊表達載體(pfuse-chig-huk5-70)及huk5-70l鍊表達載體(pfuse2-clig-huk5-70)以下表的1～4所示的組合在293f細胞(invitrogen)中共表達。

向293f細胞(invitrogen)的轉染使用neofection試劑(astec)按照所附方法進行。轉染後，使用freestyle293表達培養基(invitrogen)在37℃、co2濃度8％的co2培養箱中進行5天的培養，之後回收培養上清。培養上清中的抗體濃度用夾心elisa法進行測定。具體而言，在96孔板中以50μl/孔添加用pbs稀釋成1μg/ml的山羊抗人igg(fcγ特異性的)(southernbiotech)，在4℃包覆一晩。用洗滌緩衝液(含有0.05％tween20的pbs)洗滌後，以200μl/孔添加封閉緩衝液(含有2％脫脂乳和0.05％tween20的pbs)，在室溫下進行1小時封閉。用洗滌緩衝液洗滌後，以50μl/孔添加用elisa緩衝液(含有1％脫脂乳和0.025％tween20的pbs)稀釋成適當稀釋倍率的培養上清，在室溫下反應2小時。作為標準品，使用huk5-70抗體。用洗滌緩衝液洗滌後，以50μl/孔添加用elisa緩衝液稀釋1,000倍的hrp標記山羊抗人kappa(κ鏈特異性的)(southernbiotech)作為檢測用抗體，在室溫下反應1小時。用洗滌緩衝液洗滌後，以50μl/孔添加tmb(3,3』,5,5』-四甲基聯苯胺，sigma)底物溶液，進行顯色反應。以25μl/孔加入1m硫酸使反應停止後，使用imark酶標儀(biorad)，將655nm的吸光度作為參照來測定450nm的吸光度。4種培養上清中的抗體與htrop-2的結合利用前述的低密度抗原固相化elisa進行測定。其結果是，由小鼠k5-70vh和huk5-70vl構成的muvh/huvl抗體對於htrop-2的結合與chk5-70抗體同等，但是由huk5-70vh和小鼠k5-70vl構成的huvh/muvl抗體對於htrop-2的結合活性與chk5-70相比相對較低(圖66)。由此表示huk5-70vh與huk5-70的「親合力」有關。因而，為了製作提高了huk5-70抗體的「親合力」的改變抗體，進行了huk5-70vh的胺基酸的置換。由圖41所示的huk5-70vh與k5-70vh的胺基酸序列的比對可知，胺基酸號為5、7、11、12、13、20、38、40、44、73、75、81、82c、83、87、108及109位的合計17個胺基酸在huk5-70vh與k5-70vh之間不同(胺基酸號根據kabat等的定義(1991))。通過基因合成製作將huk5-70vh的這些胺基酸分別一個一個地置換成對應的k5-70vh的胺基酸的突變體，製作了表達載體(pfuse-chig-huk5-70突變體)。此外，根據landolfi等的報導(j.immunol.166:1748,2001)，vh的第11位和第38位的胺基酸與人源化抗體的親合力有關，通過將這兩個胺基酸置換成對應的小鼠來源的胺基酸，親合力及生物活性提高。因而，一併製作了第11位和第38位胺基酸的雙重突變體。圖67中示出所製作的18種huk5-70vh突變體的名稱和胺基酸序列。

將所製作的18種huk5-70vh突變體(pfuse-chig-huk5-70突變體的表達載體)分別與huk5-70l鍊表達載體(pfuse2-clig-huk5-70)組合，轉染到hek293細胞，使用其培養上清通過低密度抗原固相化elisa研究了各胺基酸置換抗體與htrop-2的結合活性。其結果是，在18種huk5-70vh突變體中，在將huk5-70vh的第44位r(精氨酸)置換為g(甘氨酸)的r44g突變體(huk5-70r44g；以下為huk5-70-2)中確認到明確的抗原結合活性的提高(圖68)。huk5-70vhr44g(以下為huk5-70vh2)基因的序列示於圖69。

〔實施例49〕

[huk5-70-2抗體的純化及特性描述]

作為huk5-70r44g突變型抗體的huk5-70-2抗體如下純化。將pfuse-chig-huk5-70r44g和pfuse2-clig-huk5-70轉染到293f細胞，進行5天培養後，回收培養上清。使用rproteinasepharosefastflow(gehealthcare)由所回收的培養上清純化huk5-70-2抗體。在還原條件下利用sds-page將所純化的huk5-70-2抗體展開，結果確認到約50kda的h鏈和約25kda的l鏈，各個抗體的純度為95％以上(圖70)。

利用高密度抗原固相化elisa及低密度抗原固相化elisa對純化的huk5-70-2及huk5-70抗體與htrop-2的結合活性進行了研究。利用高密度抗原固相化elisa(使用將1μg/ml的htrop-2固相化的96孔板)進行了親和性的驗證，結果huk5-70抗體與huk5-70-2抗體的結合曲線幾乎重疊，兩者的親和性相同，接下來利用低密度抗原固相化elisa(使用將0.1μg/ml的htrop-2固相化的96孔板)進行了親合力的驗證，結果與使用培養上清時的結果同樣，huk5-70-2抗體的抗原結合活性比huk5-70抗體明顯更高(圖71)。具體而言，ec50值方面，k5-70抗體為11.4ng/ml、huk5-70抗體為33.4ng/ml、huk5-70-2抗體為11.4ng/ml，huk5-70-2抗體與huk5-70抗體相比「親合力」提高，表明具有與k5-70抗體同等的活性。

〔實施例50〕

[人源化抗htrop-2抗體的抗體依賴性細胞毒(adcc)活性的測定]

(1)靶細胞溶液的調整

作為靶細胞，使用內源性表達htrop-2的人大腸癌細胞株sw480、人胰臟癌細胞株pk-59、人前列腺癌細胞株pc-3。通過胰蛋白酶處理從板上剝離用10cm細胞培養皿所培養的靶細胞，懸浮於檢測培養基中。adcc檢測用的培養基使用加入了0.5％fbs的leivovitzl-15培養基(sw480細胞)或rpmi-1640培養基(pk-59、pc-3細胞)。離心後(1000rpm、3分鐘、室溫)，用同樣的培養基將顆粒製備成2×105細胞/ml的細胞密度，製成靶細胞溶液。

(2)人末梢血單核細胞的分離

對健康人靜脈血進行肝素採血，用pbs稀釋2倍後，重疊在lymphoprep(第一化學藥品)上並離心(室溫、750rpm、5分鐘，接著2000rpm、20分)。離心後，回收位於中間層級分的單核細胞(健康人末梢血單核細胞)，用pbs洗滌3次後，用檢測培養基製備細胞懸浮液，作為效應細胞使用。

(3)人源化抗htrop-2抗體(huk5-70、huk5-70-2及hut6-16-2抗體)的adcc活性

將所製備的靶細胞溶液100μl(2×104細胞/孔)分注到96孔平底板(falcon公司制)中。然後，按照效應細胞：靶細胞的比為40：1的方式添加人末梢血單核細胞(效應細胞)。此外，作為被測抗體，按照最終濃度為0.1～30μg/ml的方式加入人源化抗htrop-2抗體(huk5-70、huk5-70-2及hut6-16-2抗體)，使總量為200μl，在co2培養箱內(37℃、5％co2)進行6小時培養。培養後，使用細胞毒性檢測試劑盒(ldh)(roche,cat.no.11644793001)，根據試劑盒所附的方案，測定由因效應細胞而受到傷害的靶細胞的細胞質放出到培養上清中的乳酸脫氫酶(ldh)的活性，以該測定結果為指標來評價adcc活性。

如圖72a～72c所示，可以明確：對於在細胞表面表達htrop-2的人大腸癌細胞株sw480(圖72a)、人胰癌細胞株pk-59(圖72b)、人前列腺癌細胞株pc-3(圖72c)，huk5-70及hut6-16-2抗體用量依賴性地發揮出adcc活性。另外，如圖72b及圖72c所示，可以明確：huk5-70-2抗體對於人胰癌細胞株pk-59及人前列腺癌細胞株pc-3細胞發揮出比huk5-70抗體更強的adcc活性。如前所述，huk5-70-2抗體是通過將huk5-70vh的第44位的r(精氨酸)置換為g(甘氨酸)、從而對於htrop-2的結合能力(親合力)提高的抗體，表明與huk5-70抗體相比提高的親合力反映到adcc活性上。因此，huk5-70-2抗體在體內也具有與huk5-70抗體同樣優異的抗腫瘤活性(優選能夠具有比huk5-70抗體更高的抗腫瘤活性)。由以上結果表明，huk5-70、huk5-70-2及hut6-16-2抗體是對於在細胞表面表達htrop-2的癌有效的治療用抗體。

產業上的可利用性

根據本發明，可以提供與htrop-2特異性反應、在體內具有高抗腫瘤活性的抗體，具體而言可以提供以低用量在體內具有高抗腫瘤活性的單克隆抗體，特別是該抗體中的人源化抗體。進而，本發明可以提供產生該抗體的雜交瘤、該抗體的片段、該抗體等與各種藥劑的複合物、腫瘤的診斷用或治療用藥物組合物、腫瘤的檢測方法、腫瘤的檢測用或診斷用試劑盒。

序列表自由文本

序列號3：合成dna

序列號4：合成dna

序列號5：合成dna

序列號6：合成dna

序列號7：合成dna

序列號8：合成dna

序列號9：合成dna

序列號10：合成dna

序列號11：合成dna

序列號12：合成dna

序列號13：合成dna

序列號14：合成dna

序列號15：合成dna

序列號16：合成dna

序列號17：合成dna

序列號18：合成dna

序列號19：合成dna

序列號20：合成dna

序列號21：合成dna

序列號22：合成dna

序列號23：合成dna

序列號24：合成dna

序列號25：合成dna

序列號26：合成dna

序列號27：合成dna

序列號28：合成dna

序列號29：合成dna

序列號30：合成dna

序列號31：合成dna

序列號32：合成dna

序列號33：合成dna

序列號74：重組dna

序列號75：合成結構(重組蛋白)

序列號76：重組dna

序列號77：合成結構(重組蛋白)

序列號78：重組dna

序列號79：合成結構(重組蛋白)

序列號80：重組dna

序列號81：合成結構(重組蛋白)

序列號82：重組dna

序列號83：合成結構(重組蛋白)

序列號92：重組蛋白

序列號93：重組蛋白

序列號94：重組蛋白

序列號95：重組蛋白

序列號96：重組蛋白

序列號97：重組蛋白

序列號98：重組蛋白

序列號99：重組dna

序列號100：重組dna

序列表

株式會社立富泰克（livtech,inc.）

在體內具有抗腫瘤活性的抗人trop-2抗體

pct12-0027

us61/562,672

2011-11-22

234

patentinversion3.4

1

2080

dna

智人（homosapiens）

cds

(339)..(1310)

1

gcgggtccccagaagcctacaggtgagtatcggttctccccttcccggctttcggtccgg60

aggaggcgggagcagcttccctgttctgatcctatcgcgggcggcgcagggccggcttgg120

ccttccgtgggacggggaggggggcgggatgtgtcacccaaataccagtggggacggtcg180

gtggtggaaccagccgggcaggtcgggtagagtataagagccggagggagcggccgggcg240

gcagacgcctgcagaccatcccagacgccggagcccgagccccgacgagtccccgcgcct300

catccgcccgcgtccggtccgcgttcctccgccccaccatggctcggggccccggc356

metalaargglyprogly

15

ctcgcgccgccaccgctgcggctgccgctgctgctgctggtgctggcg404

leualaproproproleuargleuproleuleuleuleuvalleuala

101520

gcggtgaccggccacacggccgcgcaggacaactgcacgtgtcccacc452

alavalthrglyhisthralaalaglnaspasncysthrcysprothr

253035

aacaagatgaccgtgtgcagccccgacggccccggcggccgctgccag500

asnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysgln

404550

tgccgcgcgctgggctcgggcatggcggtcgactgctccacgctgacc548

cysargalaleuglyserglymetalavalaspcysserthrleuthr

55606570

tccaagtgtctgctgctcaaggcgcgcatgagcgcccccaagaacgcc596

serlyscysleuleuleulysalaargmetseralaprolysasnala

758085

cgcacgctggtgcggccgagtgagcacgcgctcgtggacaacgatggc644

argthrleuvalargprosergluhisalaleuvalaspasnaspgly

9095100

ctctacgaccccgactgcgaccccgagggccgcttcaaggcgcgccag692

leutyraspproaspcysaspprogluglyargphelysalaarggln

105110115

tgcaaccagacgtcggtgtgctggtgcgtgaactcggtgggcgtgcgc740

cysasnglnthrservalcystrpcysvalasnservalglyvalarg

120125130

cgcacggacaagggcgacctgagcctacgctgcgatgagctggtgcgc788

argthrasplysglyaspleuserleuargcysaspgluleuvalarg

135140145150

acccaccacatcctcattgacctgcgccaccgccccaccgccggcgcc836

thrhishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

155160165

ttcaaccactcagacctggacgccgagctgaggcggctcttccgcgag884

pheasnhisseraspleuaspalagluleuargargleupheargglu

170175180

cgctatcggctgcaccccaagttcgtggcggccgtgcactacgagcag932

argtyrargleuhisprolysphevalalaalavalhistyrglugln

185190195

cccaccatccagatcgagctgcggcagaacacgtctcagaaggccgcc980

prothrileglnilegluleuargglnasnthrserglnlysalaala

200205210

ggtgacgtggatatcggcgatgccgcctactacttcgagagggacatc1028

glyaspvalaspileglyaspalaalatyrtyrphegluargaspile

215220225230

aagggcgagtctctattccagggccgcggcggcctggacttgcgcgtg1076

lysglygluserleupheglnglyargglyglyleuaspleuargval

235240245

cgcggagaacccctgcaggtggagcgcacgctcatctattacctggac1124

argglygluproleuglnvalgluargthrleuiletyrtyrleuasp

250255260

gagattcccccgaagttctccatgaagcgcctcaccgccggcctcatc1172

gluileproprolysphesermetlysargleuthralaglyleuile

265270275

gccgtcatcgtggtggtcgtggtggccctcgtcgccggcatggccgtc1220

alavalilevalvalvalvalvalalaleuvalalaglymetalaval

280285290

ctggtgatcaccaaccggagaaagtcggggaagtacaagaaggtggag1268

leuvalilethrasnargarglysserglylystyrlyslysvalglu

295300305310

atcaaggaactgggggagttgagaaaggaaccgagcttgtag1310

ilelysgluleuglygluleuarglysgluproserleu

315320

gtacccggcggggcaggggatggggtggggtaccggatttcggtatcgtcccagacccaa1370

gtgagtcacgcttcctgattcctcggcgcaaaggagacgtttatcctttcaaattcctgc1430

cttccccctcccttttgcgcacacaccaggtttaatagatcctggcctcagggtctcctt1490

tctttctcacttctgtcttgaaggaagcatttctaaaatgtatcccctttcggtccaaca1550

acaggaaacctgactggggcagtgaaggaagggatggcatagcgttatgtgtaaaaaaca1610

agtatctgtatgacaacccgggatcgtttgcaagtaactgaatccattgcgacattgtga1670

aggcttaaatgagtttagatgggaaatagcgttgttatcgccttgggtttaaattatttg1730

atgagttccacttgtatcatggcctacccgaggagaagaggagtttgttaactgggccta1790

tgtagtagcctcatttaccatcgtttgtattactgaccacatatgcttgtcactgggaaa1850

gaagcctgtttcagctgcctgaacgcagtttggatgtctttgaggacagacattgcccgg1910

aaactcagtctatttattcttcagcttgcccttactgccactgatattggtaatgttctt1970

ttttgtaaaatgtttgtacatatgttgtctttgataatgttgctgtaattttttaaaata2030

aaacacgaatttaataaaatatgggaaaggcacaaaccagaaaaaaaaaa2080

2

323

prt

智人（homosapiens）

2

metalaargglyproglyleualaproproproleuargleuproleu

151015

leuleuleuvalleualaalavalthrglyhisthralaalaglnasp

202530

asncysthrcysprothrasnlysmetthrvalcysserproaspgly

354045

proglyglyargcysglncysargalaleuglyserglymetalaval

505560

aspcysserthrleuthrserlyscysleuleuleulysalaargmet

65707580

seralaprolysasnalaargthrleuvalargprosergluhisala

859095

leuvalaspasnaspglyleutyraspproaspcysaspproglugly

100105110

argphelysalaargglncysasnglnthrservalcystrpcysval

115120125

asnservalglyvalargargthrasplysglyaspleuserleuarg

130135140

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

145150155160

argprothralaglyalapheasnhisseraspleuaspalagluleu

165170175

argargleuphearggluargtyrargleuhisprolysphevalala

180185190

alavalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

195200205

thrserglnlysalaalaglyaspvalaspileglyaspalaalatyr

210215220

tyrphegluargaspilelysglygluserleupheglnglyarggly

225230235240

glyleuaspleuargvalargglygluproleuglnvalgluargthr

245250255

leuiletyrtyrleuaspgluileproprolysphesermetlysarg

260265270

leuthralaglyleuilealavalilevalvalvalvalvalalaleu

275280285

valalaglymetalavalleuvalilethrasnargarglyssergly

290295300

lystyrlyslysvalgluilelysgluleuglygluleuarglysglu

305310315320

proserleu

3

20

dna

人工序列

合成dna

3

ttcctccgccccaccatggc20

4

25

dna

人工序列

合成dna

4

ctcgagcaagctcggttcctttctc25

5

29

dna

人工序列

合成dna

5

ctcgagctcgtccaggtaatagatgagcg29

6

23

dna

人工序列

合成dna

6

gatccactagtcgcgagtggtgg23

7

23

dna

人工序列

合成dna

7

aattccaccactcgcgactagtg23

8

20

dna

人工序列

合成dna

8

tcctcgtgtcccactcccgg20

9

25

dna

人工序列

合成dna

9

ctcgagtgcattgagttccctatgc25

10

30

dna

人工序列

合成dna

10

cctgagcctacgctgcgacgaagtggtgcg30

11

30

dna

人工序列

合成dna

11

cgcaccacttcgtcgcagcgtaggctcagg30

12

30

dna

人工序列

合成dna

12

gactgctccacgctgacttccaagtgcctg30

13

30

dna

人工序列

合成dna

13

caggcacttggaagtcagcgtggagcagtc30

14

30

dna

人工序列

合成dna

14

ctcgtggacaacgatggcctctacgacccg30

15

30

dna

人工序列

合成dna

15

cgggtcgtagaggccatcgttgtccacgag30

16

31

dna

人工序列

合成dna

16

ccaaagcctgcgctgcgatgagctggtgcgc31

17

31

dna

人工序列

合成dna

17

gcgcaccagctcatcgcagcgcaggctttgg31

18

30

dna

人工序列

合成dna

18

agcttcctatccgcggtgcactacgagcag30

19

30

dna

人工序列

合成dna

19

ctgctcgtagtgcaccgcggataggaagct30

20

30

dna

人工序列

合成dna

20

gacattaaaggcgagtctctattccagggc30

21

30

dna

人工序列

合成dna

21

gccctggaatagagactcgcctttaatgtc30

22

21

dna

人工序列

合成dna

22

ctactccaccccaccctggcg21

23

25

dna

人工序列

合成dna

23

ctcgagcaagctaggttcgcttctc25

24

12

dna

人工序列

合成dna

24

tccakagttcca12

25

12

dna

人工序列

合成dna

25

gctgtcctgatc12

26

45

dna

人工序列

合成dna

26

ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt45

27

22

dna

人工序列

合成dna

27

ctaatacgactcactatagggc22

28

23

dna

人工序列

合成dna

28

gggaartarcccttgaccaggca23

29

23

dna

人工序列

合成dna

29

gggaartagcctttgacaaggca23

30

27

dna

人工序列

合成dna

30

cactgccatcaatvctccacttgaca27

31

23

dna

人工序列

合成dna

31

cgactggagcacgaggacactga23

32

20

dna

人工序列

合成dna

32

gccagtggatagacagatgg20

33

21

dna

人工序列

合成dna

33

gatggatacagttggtgcagc21

34

402

dna

智人（homosapiens）

cds

(1)..(402)

34

atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggt48

metglytrpsercysileileleupheleuvalalathralathrgly

151015

gtccactcccaggtccaactgcagcagcctggggctgagctggtgagg96

valhisserglnvalglnleuglnglnproglyalagluleuvalarg

202530

cctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacaccttc144

proglyalaservallysleusercyslysalaserglytyrthrphe

354045

accatctactggataaactgggtgaaacagaggcctggacaaggcctt192

thriletyrtrpileasntrpvallysglnargproglyglnglyleu

505560

gagtggatcggaaatatttatccttctgatagttatactaactacaat240

glutrpileglyasniletyrproseraspsertyrthrasntyrasn

65707580

caaaagttcaaggacaaggccacattgactgtagacaaatcctccagc288

glnlysphelysasplysalathrleuthrvalasplysserserser

859095

acagcctacatgcagctcagcagcccgacatctgaggactctgcggtc336

thralatyrmetglnleuserserprothrsergluaspseralaval

100105110

tattactgtacaagaacgtctatggcggactactggggccaaggcacc384

tyrtyrcysthrargthrsermetalaasptyrtrpglyglnglythr

115120125

actctcacagtctcctca402

thrleuthrvalserser

130

35

134

prt

智人（homosapiens）

35

metglytrpsercysileileleupheleuvalalathralathrgly

151015

valhisserglnvalglnleuglnglnproglyalagluleuvalarg

202530

proglyalaservallysleusercyslysalaserglytyrthrphe

354045

thriletyrtrpileasntrpvallysglnargproglyglnglyleu

505560

glutrpileglyasniletyrproseraspsertyrthrasntyrasn

65707580

glnlysphelysasplysalathrleuthrvalasplysserserser

859095

thralatyrmetglnleuserserprothrsergluaspseralaval

100105110

tyrtyrcysthrargthrsermetalaasptyrtrpglyglnglythr

115120125

thrleuthrvalserser

130

36

5

prt

智人（homosapiens）

36

iletyrtrpileasn

15

37

17

prt

智人（homosapiens）

37

asniletyrproseraspsertyrthrasntyrasnglnlysphelys

151015

asp

38

6

prt

智人（homosapiens）

38

thrsermetalaasptyr

15

39

381

dna

智人（homosapiens）

cds

(1)..(381)

39

atggtatccacacctcagttccttgtatttttgcttttctggattcca48

metvalserthrproglnpheleuvalpheleuleuphetrpilepro

151015

gcctccagaggtgacatcttgctgactcagtctccagccatcctgtct96

alaserargglyaspileleuleuthrglnserproalaileleuser

202530

gtgagtccaggagaaagagtcagtttctcctgcagggccagtcagagc144

valserproglygluargvalserphesercysargalaserglnser

354045

attggcacaagcatacactggtatcagcaaagaacaaatggttctcca192

ileglythrserilehistrptyrglnglnargthrasnglyserpro

505560

aggcttctcataaagtatgcttctgagtctatctctgggatcccttcc240

argleuleuilelystyralasergluserileserglyileproser

65707580

aggtttagtggcagtggatcagggacagattttactcttagcatcaac288

argpheserglyserglyserglythraspphethrleuserileasn

859095

agtgtggagtctgaagatattgcagattattactgtcaacaaagtaat336

servalglusergluaspilealaasptyrtyrcysglnglnserasn

100105110

agctggccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa381

sertrpprophethrpheglyserglythrlysleugluilelys

115120125

40

127

prt

智人（homosapiens）

40

metvalserthrproglnpheleuvalpheleuleuphetrpilepro

151015

alaserargglyaspileleuleuthrglnserproalaileleuser

202530

valserproglygluargvalserphesercysargalaserglnser

354045

ileglythrserilehistrptyrglnglnargthrasnglyserpro

505560

argleuleuilelystyralasergluserileserglyileproser

65707580

argpheserglyserglyserglythraspphethrleuserileasn

859095

servalglusergluaspilealaasptyrtyrcysglnglnserasn

100105110

sertrpprophethrpheglyserglythrlysleugluilelys

115120125

41

11

prt

智人（homosapiens）

41

argalaserglnserileglythrserilehis

1510

42

7

prt

智人（homosapiens）

42

tyralasergluserileser

15

43

9

prt

智人（homosapiens）

43

glnglnserasnsertrpprophethr

15

44

402

dna

智人（homosapiens）

cds

(1)..(402)

44

atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggt48

metglytrpsercysileileleupheleuvalalathralathrgly

151015

gtccactcccaggtccaactgcagcaacctgggtctgagctggtgagg96

valhisserglnvalglnleuglnglnproglysergluleuvalarg

202530

cctggagcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacacattc144

proglyalaservallysleusercyslysalaserglytyrthrphe

354045

accagctactggatgcactgggtgaagcagaggcatggacaaggcctt192

thrsertyrtrpmethistrpvallysglnarghisglyglnglyleu

505560

gagtggattggaaatatttatcctggtggtggttatactaactacgat240

glutrpileglyasniletyrproglyglyglytyrthrasntyrasp

65707580

gagaagttcaagagcaagggcacactgactgtagacacatcctccagc288

glulysphelysserlysglythrleuthrvalaspthrserserser

859095

acagcctacatgcacctcagcagcctgacatctgaggactctgcggtc336

thralatyrmethisleuserserleuthrsergluaspseralaval

100105110

tattactgtacaagatcatccgtttttgactactggggccaaggcacc384

tyrtyrcysthrargserservalpheasptyrtrpglyglnglythr

115120125

actctcacagtctcctca402

thrleuthrvalserser

130

45

134

prt

智人（homosapiens）

45

metglytrpsercysileileleupheleuvalalathralathrgly

151015

valhisserglnvalglnleuglnglnproglysergluleuvalarg

202530

proglyalaservallysleusercyslysalaserglytyrthrphe

354045

thrsertyrtrpmethistrpvallysglnarghisglyglnglyleu

505560

glutrpileglyasniletyrproglyglyglytyrthrasntyrasp

65707580

glulysphelysserlysglythrleuthrvalaspthrserserser

859095

thralatyrmethisleuserserleuthrsergluaspseralaval

100105110

tyrtyrcysthrargserservalpheasptyrtrpglyglnglythr

115120125

thrleuthrvalserser

130

46

5

prt

智人（homosapiens）

46

sertyrtrpmethis

15

47

17

prt

智人（homosapiens）

47

asniletyrproglyglyglytyrthrasntyraspglulysphelys

151015

ser

48

6

prt

智人（homosapiens）

48

serservalpheasptyr

15

49

381

dna

智人（homosapiens）

cds

(1)..(381)

49

atggtatccacacctcagttccttgtatttttgcttttctggattcca48

metvalserthrproglnpheleuvalpheleuleuphetrpilepro

151015

gcctccagaggtgacatcttgctgactcagtctccagccatcctgtct96

alaserargglyaspileleuleuthrglnserproalaileleuser

202530

gtgagtccaggagaaagagtcagtttctcctgcagggccagtcagaac144

valserproglygluargvalserphesercysargalaserglnasn

354045

attggcacaagcatacactggtttcagcaaagaacaaatggttctcca192

ileglythrserilehistrppheglnglnargthrasnglyserpro

505560

aggcttctcataaagtatgcttctgagtctatctctgggatcccttcc240

argleuleuilelystyralasergluserileserglyileproser

65707580

aggtttagtggcagtggatcagggacagattttactcttagcatcaac288

argpheserglyserglyserglythraspphethrleuserileasn

859095

agtgtggagtctgaagatattgcagattattactgtcaacaaagtaat336

servalglusergluaspilealaasptyrtyrcysglnglnserasn

100105110

agctggccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa381

sertrpprophethrpheglyserglythrlysleugluilelys

115120125

50

127

prt

智人（homosapiens）

50

metvalserthrproglnpheleuvalpheleuleuphetrpilepro

151015

alaserargglyaspileleuleuthrglnserproalaileleuser

202530

valserproglygluargvalserphesercysargalaserglnasn

354045

ileglythrserilehistrppheglnglnargthrasnglyserpro

505560

argleuleuilelystyralasergluserileserglyileproser

65707580

argpheserglyserglyserglythraspphethrleuserileasn

859095

servalglusergluaspilealaasptyrtyrcysglnglnserasn

100105110

sertrpprophethrpheglyserglythrlysleugluilelys

115120125

51

11

prt

智人（homosapiens）

51

argalaserglnasnileglythrserilehis

1510

52

7

prt

智人（homosapiens）

52

tyralasergluserileser

15

53

9

prt

智人（homosapiens）

53

glnglnserasnsertrpprophethr

15

54

396

dna

智人（homosapiens）

cds

(1)..(396)

54

atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggt48

metglytrpsercysileileleupheleuvalalathralathrgly

151015

gtccactcccaggtccaactgcagcagcctggggctgagctggtgagg96

valhisserglnvalglnleuglnglnproglyalagluleuvalarg

202530

cctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacaccttc144

proglyalaservallysleusercyslysalaserglytyrthrphe

354045

accagctactggataacctgggtgaagcagaggcctggacaaggcctt192

thrsertyrtrpilethrtrpvallysglnargproglyglnglyleu

505560

gagtggatcggaaatatttatccttctgatagttatactaactacaat240

glutrpileglyasniletyrproseraspsertyrthrasntyrasn

65707580

caaaagttcagggacaaggccacattgactgtagacaaatcctccagt288

glnlyspheargasplysalathrleuthrvalasplysserserser

859095

acagcctacatgcagctcagcagcccgacatctgaggactctgcggtc336

thralatyrmetglnleuserserprothrsergluaspseralaval

100105110

tattactgttcagccctctttgactactggggccaaggcaccactctc384

tyrtyrcysseralaleupheasptyrtrpglyglnglythrthrleu

115120125

acagtctcctca396

thrvalserser

130

55

132

prt

智人（homosapiens）

55

metglytrpsercysileileleupheleuvalalathralathrgly

151015

valhisserglnvalglnleuglnglnproglyalagluleuvalarg

202530

proglyalaservallysleusercyslysalaserglytyrthrphe

354045

thrsertyrtrpilethrtrpvallysglnargproglyglnglyleu

505560

glutrpileglyasniletyrproseraspsertyrthrasntyrasn

65707580

glnlyspheargasplysalathrleuthrvalasplysserserser

859095

thralatyrmetglnleuserserprothrsergluaspseralaval

100105110

tyrtyrcysseralaleupheasptyrtrpglyglnglythrthrleu

115120125

thrvalserser

130

56

5

prt

智人（homosapiens）

56

sertyrtrpilethr

15

57

17

prt

智人（homosapiens）

57

asniletyrproseraspsertyrthrasntyrasnglnlysphearg

151015

asp

58

4

prt

智人（homosapiens）

58

leupheasptyr

1

59

381

dna

智人（homosapiens）

cds

(1)..(381)

59

atggtatccacacctcagttccttgtatttttgcttttctggattcca48

metvalserthrproglnpheleuvalpheleuleuphetrpilepro

151015

gcctccagaggtgacatcttgctgactcagtctccagccatcctgtct96

alaserargglyaspileleuleuthrglnserproalaileleuser

202530

gtgagtccaggagaaagagtcagtttctcctgcagggccagtcagagc144

valserproglygluargvalserphesercysargalaserglnser

354045

attggcacaagcatacactggtatcagcaaagaacaaatggttctcca192

ileglythrserilehistrptyrglnglnargthrasnglyserpro

505560

aggcttctcataaagtatgcttctgagtctatctctgggatcccttcc240

argleuleuilelystyralasergluserileserglyileproser

65707580

aggtttagtggcagtggatcagggacagattttattcttagcatcaac288

argpheserglyserglyserglythrasppheileleuserileasn

859095

agtgtggagtctgaagatattgcagattattactgtcaacaaagtaat336

servalglusergluaspilealaasptyrtyrcysglnglnserasn

100105110

agctggccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa381

sertrpprophethrpheglyserglythrlysleugluilelys

115120125

60

127

prt

智人（homosapiens）

60

metvalserthrproglnpheleuvalpheleuleuphetrpilepro

151015

alaserargglyaspileleuleuthrglnserproalaileleuser

202530

valserproglygluargvalserphesercysargalaserglnser

354045

ileglythrserilehistrptyrglnglnargthrasnglyserpro

505560

argleuleuilelystyralasergluserileserglyileproser

65707580

argpheserglyserglyserglythrasppheileleuserileasn

859095

servalglusergluaspilealaasptyrtyrcysglnglnserasn

100105110

sertrpprophethrpheglyserglythrlysleugluilelys

115120125

61

11

prt

智人（homosapiens）

61

argalaserglnserileglythrserilehis

1510

62

7

prt

智人（homosapiens）

62

tyralasergluserileser

15

63

9

prt

智人（homosapiens）

63

glnglnserasnsertrpprophethr

15

64

423

dna

智人（homosapiens）

cds

(1)..(423)

64

atgggatggagctggatctttctcttcctcctgtcaggaactgcaggc48

metglytrpsertrpilepheleupheleuleuserglythralagly

151015

gtccactctgaggtccagcttcagcagtcaggacctgagctggtgaaa96

valhissergluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallys

202530

cctggggcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggatacacattc144

proglyalaservallysilesercyslysalaserglytyrthrphe

354045

actgactacaatatgcactgggtgaagcagagccatggaaagaacctt192

thrasptyrasnmethistrpvallysglnserhisglylysasnleu

505560

gaatggattggatatatttatccttacaatggtggtactggctacaac240

glutrpileglytyriletyrprotyrasnglyglythrglytyrasn

65707580

cagaggttcaagagcagggccacaatgactgtagacaaatcctccagc288

glnargphelysserargalathrmetthrvalasplysserserser

859095

acagcctacatggagctccgcagcctgacatctgatgactctgcagtc336

thralatyrmetgluleuargserleuthrseraspaspseralaval

100105110

tattactgtgcaagagaagactacggtagtagcccctcttatgctatg384

tyrtyrcysalaarggluasptyrglyserserprosertyralamet

115120125

gactattggggtcaaggaacctcagtcatcgtctcctca423

asptyrtrpglyglnglythrservalilevalserser

130135140

65

141

prt

智人（homosapiens）

65

metglytrpsertrpilepheleupheleuleuserglythralagly

151015

valhissergluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallys

202530

proglyalaservallysilesercyslysalaserglytyrthrphe

354045

thrasptyrasnmethistrpvallysglnserhisglylysasnleu

505560

glutrpileglytyriletyrprotyrasnglyglythrglytyrasn

65707580

glnargphelysserargalathrmetthrvalasplysserserser

859095

thralatyrmetgluleuargserleuthrseraspaspseralaval

100105110

tyrtyrcysalaarggluasptyrglyserserprosertyralamet

115120125

asptyrtrpglyglnglythrservalilevalserser

130135140

66

5

prt

智人（homosapiens）

66

asptyrasnmethis

15

67

17

prt

智人（homosapiens）

67

tyriletyrprotyrasnglyglythrglytyrasnglnargphelys

151015

ser

68

13

prt

智人（homosapiens）

68

gluasptyrglyserserprosertyralametasptyr

1510

69

390

dna

智人（homosapiens）

cds

(1)..(390)

69

atgaagttgcctgttaggctgttggtgctgatgttctggattcctgct48

metlysleuprovalargleuleuvalleumetphetrpileproala

151015

tccagcagtgatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtc96

serserseraspvalvalmetthrglnthrproleuserleuproval

202530

agtcttggagatcaggcctccatctcttgcagatctagtcagagcctt144

serleuglyaspglnalaserilesercysargserserglnserleu

354045

gtacacggtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagcca192

valhisglyasnglyasnthrtyrleuhistrptyrleuglnlyspro

505560

ggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttct240

glyglnserprolysleuleuiletyrlysvalserasnargpheser

65707580

ggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacggatttcaca288

glyvalproaspargpheserglyserglyserglythraspphethr

859095

ctcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgc336

leulysileserargvalglualagluaspleuglyvaltyrphecys

100105110

tctcaaactacacatgttcccacgttcggctcggggacaaagttggaa384

serglnthrthrhisvalprothrpheglyserglythrlysleuglu

115120125

ataaaa390

ilelys

130

70

130

prt

智人（homosapiens）

70

metlysleuprovalargleuleuvalleumetphetrpileproala

151015

serserseraspvalvalmetthrglnthrproleuserleuproval

202530

serleuglyaspglnalaserilesercysargserserglnserleu

354045

valhisglyasnglyasnthrtyrleuhistrptyrleuglnlyspro

505560

glyglnserprolysleuleuiletyrlysvalserasnargpheser

65707580

glyvalproaspargpheserglyserglyserglythraspphethr

859095

leulysileserargvalglualagluaspleuglyvaltyrphecys

100105110

serglnthrthrhisvalprothrpheglyserglythrlysleuglu

115120125

ilelys

130

71

16

prt

智人（homosapiens）

71

argserserglnserleuvalhisglyasnglyasnthrtyrleuhis

151015

72

7

prt

智人（homosapiens）

72

lysvalserasnargpheser

15

73

8

prt

智人（homosapiens）

73

serglnthrthrhisvalprothr

15

74

402

dna

人工序列

重組dna

cds

(1)..(402)

74

atggggtggagctgcattatcctgtttcttgtcgcaactgcaacaggc48

metglytrpsercysileileleupheleuvalalathralathrgly

151015

gttcactcacaggttcagctagtccagtctggagctgaggtgaagaaa96

valhisserglnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslys

202530

ccaggggcatctgtcaaagtgagctgtaaggcctctggctatacgttc144

proglyalaservallysvalsercyslysalaserglytyrthrphe

354045

acgatatactggatcaattgggtgaggcaagctcctggacaacggttg192

thriletyrtrpileasntrpvalargglnalaproglyglnargleu

505560

gaatggattggcaacatctatccctcagactcctacaccaactacaat240

glutrpileglyasniletyrproseraspsertyrthrasntyrasn

65707580

cagaagttcaaggacaaagccactctcaccgtagataccagtgcctcc288

glnlysphelysasplysalathrleuthrvalaspthrseralaser

859095

acagcctatatggagctgagcagtttacgcagcgaagatacagcggtg336

thralatyrmetgluleuserserleuargsergluaspthralaval

100105110

tactactgcaccagaacctccatggctgactattggggtcagggtaca384

tyrtyrcysthrargthrsermetalaasptyrtrpglyglnglythr

115120125

ctggtgactgtgagctcc402

leuvalthrvalserser

130

75

134

prt

人工序列

合成結構（重組蛋白）

75

metglytrpsercysileileleupheleuvalalathralathrgly

151015

valhisserglnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslys

202530

proglyalaservallysvalsercyslysalaserglytyrthrphe

354045

thriletyrtrpileasntrpvalargglnalaproglyglnargleu

505560

glutrpileglyasniletyrproseraspsertyrthrasntyrasn

65707580

glnlysphelysasplysalathrleuthrvalaspthrseralaser

859095

thralatyrmetgluleuserserleuargsergluaspthralaval

100105110

tyrtyrcysthrargthrsermetalaasptyrtrpglyglnglythr

115120125

leuvalthrvalserser

130

76

381

dna

人工序列

重組dna

cds

(1)..(381)

76

atggtaagcacaccccagttcctcgttttcctcctgttttggattccc48

metvalserthrproglnpheleuvalpheleuleuphetrpilepro

151015

gcaagtagaggggagatcgtcttgactcagagtcctgccacactgtct96

alaserargglygluilevalleuthrglnserproalathrleuser

202530

ctttcaccaggagaaagggcgacacttagctgtcgagcttctcagagc144

leuserproglygluargalathrleusercysargalaserglnser

354045

attggcacgtccatacactggtatcagcagaaaccgggacaagctcca192

ileglythrserilehistrptyrglnglnlysproglyglnalapro

505560

cggttactgatcaagtatgcctccgaaagcatctctgggattcctgca240

argleuleuilelystyralasergluserileserglyileproala

65707580

cgctttagcggaagcggtagtggtaccgacttcactctgaccatatcc288

argpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrileser

859095

tcactagaacccgaggattttgccgtgtactactgccagcagtccaac336

serleugluprogluaspphealavaltyrtyrcysglnglnserasn

100105110

tcatggcctttcacctttggccaaggcaccaaagtggagatcaag381

sertrpprophethrpheglyglnglythrlysvalgluilelys

115120125

77

127

prt

人工序列

合成結構（重組蛋白）

77

metvalserthrproglnpheleuvalpheleuleuphetrpilepro

151015

alaserargglygluilevalleuthrglnserproalathrleuser

202530

leuserproglygluargalathrleusercysargalaserglnser

354045

ileglythrserilehistrptyrglnglnlysproglyglnalapro

505560

argleuleuilelystyralasergluserileserglyileproala

65707580

argpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrileser

859095

serleugluprogluaspphealavaltyrtyrcysglnglnserasn

100105110

sertrpprophethrpheglyglnglythrlysvalgluilelys

115120125

78

423

dna

人工序列

重組dna

cds

(1)..(423)

78

atgggatggtcttggatctttctcttcctgctgtctggcacagctgga48

metglytrpsertrpilepheleupheleuleuserglythralagly

151015

gtgcattcccaagttcagctggtccagtccggagctgaagttaaaaag96

valhisserglnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslys

202530

cccggggccagcgtcaaagtctcctgcaaggcatccgggtatactttt144

proglyalaservallysvalsercyslysalaserglytyrthrphe

354045

accgattataacatgcactgggtgcgccaagcacccggccagggcctg192

thrasptyrasnmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleu

505560

gagtggattggctatatctatccttataatggagggaccggctacaac240

glutrpileglytyriletyrprotyrasnglyglythrglytyrasn

65707580

cagagattcaagagcagagccaccatgacagtggataaatctaccagc288

glnargphelysserargalathrmetthrvalasplysserthrser

859095

actgcctacatggagctgagaagcctgcggagcgacgacacagccgtg336

thralatyrmetgluleuargserleuargseraspaspthralaval

100105110

tactactgtgcccgcgaggattacggaagcagcccaagctacgccatg384

tyrtyrcysalaarggluasptyrglyserserprosertyralamet

11512012

gattactggggccaaggcactatggtgaccgtgagcagc423

asptyrtrpglyglnglythrmetvalthrvalserser

130135140

79

141

prt

人工序列

合成結構（重組蛋白）

79

metglytrpsertrpilepheleupheleuleuserglythralagly

151015

valhisserglnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslys

202530

proglyalaservallysvalsercyslysalaserglytyrthrphe

354045

thrasptyrasnmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleu

505560

glutrpileglytyriletyrprotyrasnglyglythrglytyrasn

65707580

glnargphelysserargalathrmetthrvalasplysserthrser

859095

thralatyrmetgluleuargserleuargseraspaspthralaval

100105110

tyrtyrcysalaarggluasptyrglyserserprosertyralamet

115120125

asptyrtrpglyglnglythrmetvalthrvalserser

130135140

80

423

dna

人工序列

重組dna

cds

(1)..(423)

80

atgggctggtcttggatcttcctcttcctgctgagcgggaccgctgga48

metglytrpsertrpilepheleupheleuleuserglythralagly

151015

gtccattctcaagtccaactggtccagtccggggctgaagtgaaaaaa96

valhisserglnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslys

202530

ccaggagcatccgttaaggtgtcctgtaaggcaagcggatacaccttt144

proglyalaservallysvalsercyslysalaserglytyrthrphe

354045

accgactataacatgcactgggtgaggcaggcccccggacaggggctg192

thrasptyrasnmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleu

505560

gagtggatcggctatatttatccttacaacgggggcactggctataat240

glutrpileglytyriletyrprotyrasnglyglythrglytyrasn

65707580

cagagatttaagagccgcgctaccatgaccgtggacacctccacttct288

glnargphelysserargalathrmetthrvalaspthrserthrser

859095

acagcctatatggagctgagaagcctgcggagcgatgatacagccgtg336

thralatyrmetgluleuargserleuargseraspaspthralaval

100105110

tactactgcgccagagaagattacggcagcagccccagctacgccatg384

tyrtyrcysalaarggluasptyrglyserserprosertyralamet

115120125

gactactggggccagggcacaatggttactgtgagcagc423

asptyrtrpglyglnglythrmetvalthrvalserser

130135140

81

141

prt

人工序列

合成結構（重組蛋白）

81

metglytrpsertrpilepheleupheleuleuserglythralagly

151015

valhisserglnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslys

202530

proglyalaservallysvalsercyslysalaserglytyrthrphe

354045

thrasptyrasnmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleu

505560

glutrpileglytyriletyrprotyrasnglyglythrglytyrasn

65707580

glnargphelysserargalathrmetthrvalaspthrserthrser

859095

thralatyrmetgluleuargserleuargseraspaspthralaval

100105110

tyrtyrcysalaarggluasptyrglyserserprosertyralamet

115120125

asptyrtrpglyglnglythrmetvalthrvalserser

130135140

82

390

dna

人工序列

重組dna

cds

(1)..(390)

82

atgaagctcccagtgcgcctcctggtcctgatgttctggattcccgct48

metlysleuprovalargleuleuvalleumetphetrpileproala

151015

tcctctagcgatatcgtcatgacccaatccccactgtctctgcctgtg96

serserseraspilevalmetthrglnserproleuserleuproval

202530

acaccaggcgaacctgcatctattagctgtagaagcagccagtccctg144

thrproglygluproalaserilesercysargserserglnserleu

354045

gtgcacggaaacggaaacacctatctgcactggtacctgcaaaaacct192

valhisglyasnglyasnthrtyrleuhistrptyrleuglnlyspro

505560

ggacagagcccccagctgctgatctacaaagtcagcaatagatttagc240

glyglnserproglnleuleuiletyrlysvalserasnargpheser

65707580

ggggtgcccgacaggtttagcggcagcggcagcggcacagatttcacc288

glyvalproaspargpheserglyserglyserglythraspphethr

859095

ctgaaaatctcccgggtggaagccgaggacgttggggtttactattgc336

leulysileserargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcys

100105110

agccagacaacccatgtgcccactttcgggggcggcactaaggtggag384

serglnthrthrhisvalprothrpheglyglyglythrlysvalglu

115120125

atcaag390

ilelys

130

83

130

prt

人工序列

合成結構（重組蛋白）

83

metlysleuprovalargleuleuvalleumetphetrpileproala

151015

serserseraspilevalmetthrglnserproleuserleuproval

202530

thrproglygluproalaserilesercysargserserglnserleu

354045

valhisglyasnglyasnthrtyrleuhistrptyrleuglnlyspro

505560

glyglnserproglnleuleuiletyrlysvalserasnargpheser

65707580

glyvalproaspargpheserglyserglyserglythraspphethr

859095

leulysileserargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcys

100105110

serglnthrthrhisvalprothrpheglyglyglythrlysvalglu

115120125

ilelys

130

84

563

dna

智人（homosapiens）

cds

(102)..(458)

84

aaccacatccctcctcagaagcccccagagcacaactccttaccatggactggacctgga60

ggatcctctttttggtggcagcagccacaggtgcccactcccaggtccagcttgtg116

glnvalglnleuval

15

cagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcc164

glnserglyalagluvallyslysproglyalaservallysvalser

101520

tgcaaggcttctggatacaccttcactaactatgctctgcattgggtg212

cyslysalaserglytyrthrphethrasntyralaleuhistrpval

25303

cgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacact260

argglnalaproglyglnargleuglutrpmetglytrpileasnthr

404550

ggcaatggtaacacaaaatattcacagaagttccagggcagagtcacc308

glyasnglyasnthrlystyrserglnlyspheglnglyargvalthr

556065

cttaccagtgacacatccgcgagcacagcctacatggagatgagcagc356

leuthrseraspthrseralaserthralatyrmetglumetserser

70758085

ctgagatctgaagacacggctgtgtattactgtgcgaggagcagtggc404

leuargsergluaspthralavaltyrtyrcysalaargsersergly

9095100

tggtacgtttggttcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtc452

trptyrvaltrppheaspprotrpglyglnglythrleuvalthrval

105110115

tcctcagcttccaccaagggcccatcggttttccccctggcgccctgctccaggag508

serser

cacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaa563

85

119

prt

智人（homosapiens）

85

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr

202530

alaleuhistrpvalargglnalaproglyglnargleuglutrpmet

354045

glytrpileasnthrglyasnglyasnthrlystyrserglnlysphe

505560

glnglyargvalthrleuthrseraspthrseralaserthralatyr

65707580

metglumetserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargserserglytrptyrvaltrppheaspprotrpglyglngly

100105110

thrleuvalthrvalserser

115

86

384

dna

智人（homosapiens）

cds

(1)..(384)

86

atggaagtcctcgtgcagcttctcttcctcctgctactctggctccca48

metgluvalleuvalglnleuleupheleuleuleuleutrpleupro

151015

gataccaccggagaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtct96

aspthrthrglygluilevalleuthrglnserproalathrleuser

202530

ttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagt144

leuserproglygluargalathrleusercysargalaserglnser

354045

gttagcagctacttagcctggtatcaacagaaacctggccaggctccc192

valsersertyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalapro

505560

aggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagcc240

argleuleuiletyraspalaserasnargalathrglyileproala

65707580

aggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagc288

argpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrileser

859095

agcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagc336

serleugluprogluaspphealavaltyrtyrcysglnglnargser

100105110

aactggcctcggtcgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacga384

asntrpproargserpheglyglnglythrlysvalgluilelysarg

115120125

87

128

prt

智人（homosapiens）

87

metgluvalleuvalglnleuleupheleuleuleuleutrpleupro

151015

aspthrthrglygluilevalleuthrglnserproalathrleuser

202530

leuserproglygluargalathrleusercysargalaserglnser

354045

valsersertyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalapro

505560

argleuleuiletyraspalaserasnargalathrglyileproala

65707580

argpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrileser

859095

serleugluprogluaspphealavaltyrtyrcysglnglnargser

100105110

asntrpproargserpheglyglnglythrlysvalgluilelysarg

115120125

88

601

dna

智人（homosapiens）

cds

(112)..(477)

88

acccaaaaaccacacccctccttgggagaatcccctagatcacagctcctcaccatggac60

tggacctggagcatccttttcttggtggcagcagcaacaggtgcccactcccaggtt117

glnval

1

cagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtg165

glnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalaserval

51015

aaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccagttatggtatc213

lysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyrglyile

202530

agttgggtgcgccaggcccctggacaagggcttgagtggatgggattg261

sertrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetglyleu

35404550

atcagcgcttacaatggtaacacaaactatgcacagaagctccagggc309

ileseralatyrasnglyasnthrasntyralaglnlysleuglngly

556065

agagtcaccatgaccgtagacacgtctacgagcacagcctatatggaa357

argvalthrmetthrvalaspthrserthrserthralatyrmetglu

707580

ctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtctattactgtgcgaga405

leuargserleuargseraspaspthralavaltyrtyrcysalaarg

859095

gatggaatagcagtggcgaccaaagatgcttttgatatctggggccaa453

aspglyilealavalalathrlysaspalapheaspiletrpglygln

100105110

gggacaatggtcaccgtctcttcagcacccaccaaggctccggatgtgttcccc507

glythrmetvalthrvalserser

115120

atcatatcagggtgcagacacccaaaggataacagccctgtggtcctggcatgcttgata567

actgggtaccacccaacgtccgtgactgtcacct601

89

122

prt

智人（homosapiens）

89

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr

202530

glyilesertrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet

354045

glyleuileseralatyrasnglyasnthrasntyralaglnlysleu

505560

glnglyargvalthrmetthrvalaspthrserthrserthralatyr

65707580

metgluleuargserleuargseraspaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargaspglyilealavalalathrlysaspalapheaspiletrp

100105110

glyglnglythrmetvalthrvalserser

115120

90

342

dna

智人（homosapiens）

cds

(1)..(342)

90

gatattgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctgga48

aspilevalmetthrglnserproleuserleuprovalthrprogly

151015

gagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgcatagt96

gluproalaserilesercysargserserglnserleuleuhisser

202530

aatggatacaactatttggattggtacctgcagaagccagggcagtct144

asnglytyrasntyrleuasptrptyrleuglnlysproglyglnser

354045

ccacagctcctgatctatttgggttctaatcgggcctccggggtccct192

proglnleuleuiletyrleuglyserasnargalaserglyvalpro

505560

gacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatc240

aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile

65707580

agcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaagct288

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnala

859095

ctacaaactctggggctcactttcggcggagggaccaaggtggagatc336

leuglnthrleuglyleuthrpheglyglyglythrlysvalgluile

100105110

aaacga342

lysarg

91

114

prt

智人（homosapiens）

91

aspilevalmetthrglnserproleuserleuprovalthrprogly

151015

gluproalaserilesercysargserserglnserleuleuhisser

202530

asnglytyrasntyrleuasptrptyrleuglnlysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrleuglyserasnargalaserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnala

859095

leuglnthrleuglyleuthrpheglyglyglythrlysvalgluile

100105110

lysarg

92

115

prt

人工序列

重組蛋白

92

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethriletyr

202530

trpileasntrpvalargglnalaproglyglnargleuglutrpile

354045

glyasniletyrproseraspsertyrthrasntyrasnglnlysphe

505560

lysasplysalathrleuthrvalaspthrseralaserthralatyr

65707580

metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys

859095

thrargthrsermetalaasptyrtrpglyglnglythrleuvalthr

100105110

valserser

115

93

107

prt

人工序列

重組蛋白

93

gluilevalleuthrglnserproalathrleuserleuserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaserglnserileglythrser

202530

ilehistrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile

354045

lystyralasergluserileserglyileproalaargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglupro

65707580

gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnserasnsertrpprophe

859095

thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys

100105

94

122

prt

人工序列

重組蛋白

94

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

asnmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile

354045

glytyriletyrprotyrasnglyglythrglytyrasnglnargphe

505560

lysserargalathrmetthrvalasplysserthrserthralatyr

65707580

metgluleuargserleuargseraspaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaarggluasptyrglyserserprosertyralametasptyrtrp

100105110

glyglnglythrmetvalthrvalserser

115120

95

122

prt

人工序列

重組蛋白

95

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

asnmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile

354045

glytyriletyrprotyrasnglyglythrglytyrasnglnargphe

505560

lysserargalathrmetthrvalaspthrserthrserthralatyr

65707580

metgluleuargserleuargseraspaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaarggluasptyrglyserserprosertyralametasptyrtrp

100105110

glyglnglythrmetvalthrvalserser

115120

96

111

prt

人工序列

重組蛋白

96

aspilevalmetthrglnserproleuserleuprovalthrprogly

151015

gluproalaserilesercysargserserglnserleuvalhisgly

202530

asnglyasnthrtyrleuhistrptyrleuglnlysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrlysvalserasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysserglnthr

859095

thrhisvalprothrpheglyglyglythrlysvalgluilelys

100105110

97

134

prt

人工序列

合成結構（重組蛋白）

97

metglytrpsercysileileleupheleuvalalathralathrgly

151015

valhisserglnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslys

202530

proglyalaservallysvalsercyslysalaserglytyrthrphe

354045

thriletyrtrpileasntrpvalargglnalaproglyglnglyleu

505560

glutrpileglyasniletyrproseraspsertyrthrasntyrasn

65707580

glnlysphelysasplysalathrleuthrvalaspthrseralaser

859095

thralatyrmetgluleuserserleuargsergluaspthralaval

100105110

tyrtyrcysthrargthrsermetalaasptyrtrpglyglnglythr

115120125

leuvalthrvalserser

130

98

115

prt

人工序列

重組蛋白

98

glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethriletyr

202530

trpileasntrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile

354045

glyasniletyrproseraspsertyrthrasntyrasnglnlysphe

505560

lysasplysalathrleuthrvalaspthrseralaserthralatyr

65707580

metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys

859095

thrargthrsermetalaasptyrtrpglyglnglythrleuvalthr

100105110

valserser

115

99

420

dna

人工序列

重組dna

cds

(13)..(414)

99

gaattcaccaccatgggatggtcctgcattattctctttctcgtcgccacc51

metglytrpsercysileileleupheleuvalalathr

1510

gccacaggcgtgcacagccaggttcaactgcagcaacctggggcagag99

alathrglyvalhisserglnvalglnleuglnglnproglyalaglu

152025

ctggttcggccaggggcctccgtcaaactgtcctgcaaagcttctggc147

leuvalargproglyalaservallysleusercyslysalasergly

30354045

tacactttcaccatctactggatcaactgggtgaagcagaggcccggc195

tyrthrphethriletyrtrpileasntrpvallysglnargprogly

505560

cagggcctggaatggatcggaaatatctatcctagcgattcttacaca243

glnglyleuglutrpileglyasniletyrproseraspsertyrthr

657075

aattacaaccagaagttcaaggacaaggctaccctgaccgtggacaaa291

asntyrasnglnlysphelysasplysalathrleuthrvalasplys

808590

tctagctccacagcctacatgcagctgagcagccccactagcgaggat339

serserserthralatyrmetglnleuserserprothrsergluasp

95100105

agcgcagtgtattattgtaccagaaccagcatggccgactattgggga387

seralavaltyrtyrcysthrargthrsermetalaasptyrtrpgly

110115120125

cagggcacaactctgaccgtgagcagcgctagc420

glnglythrthrleuthrvalserser

130

100

399

dna

人工序列

重組dna

cds

(13)..(393)

100

accggtaccaccatggttagcacacctcaatttctggtcttcctgctcttc51

metvalserthrproglnpheleuvalpheleuleuphe

1510

tggattcctgccagcagaggagatatcctcctgacacaaagccccgca99

trpileproalaserargglyaspileleuleuthrglnserproala

152025

atcctgagcgtgtcccccggagagcgcgtgagctttagctgccgggcc147

ileleuservalserproglygluargvalserphesercysargala

30354045

agccagagcattggaaccagcatccactggtatcagcagagaaccaac195

serglnserileglythrserilehistrptyrglnglnargthrasn

505560

gggtctcccaggctgctgattaaatacgcttctgagtctatttccggg243

glyserproargleuleuilelystyralasergluserilesergly

657075

atcccaagcagattctccggctctggcagcggcactgattttactctg291

ileproserargpheserglyserglyserglythraspphethrleu

808590

tctatcaacagcgtggagtccgaagacatcgccgactactattgtcag339

serileasnservalglusergluaspilealaasptyrtyrcysgln

95100105

cagagcaattcctggccattcacctttggcagcggcaccaagctggaa387

glnserasnsertrpprophethrpheglyserglythrlysleuglu

11011512012

atcaagcgtacg399

ilelys

101

30

prt

智人（homosapiens）

101

asnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysgln

151015

cysargalaleuglyserglymetalavalaspcysserthr

202530

102

30

prt

智人（homosapiens）

102

thrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncysargala

151015

leuglyserglymetalavalaspcysserthrleuthrser

202530

103

30

prt

智人（homosapiens）

103

thrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcys

151015

glncysargalaleuglyserglymetalavalaspcysser

202530

104

30

prt

智人（homosapiens）

104

metthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncysarg

151015

alaleuglyserglymetalavalaspcysserthrleuthr

202530

105

30

prt

智人（homosapiens）

105

lysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncys

151015

argalaleuglyserglymetalavalaspcysserthrleu

202530

106

30

prt

智人（homosapiens）

106

prothrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyarg

151015

cysglncysargalaleuglyserglymetalavalaspcys

202530

107

30

prt

智人（homosapiens）

107

valcysserproaspglyproglyglyargcysglncysargalaleu

151015

glyserglymetalavalaspcysserthrleuthrserlys

202530

108

33

prt

智人（homosapiens）

108

cysalaalavalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuarg

151015

cysalaalavalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuarg

202530

cys

109

30

prt

智人（homosapiens）

109

cysprothrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglygly

151015

argcysglncysargalaleuglyserglymetalavalasp

202530

110

33

prt

智人（homosapiens）

110

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

151015

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

202530

cys

111

32

prt

智人（homosapiens）

111

hisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluargcys

151015

hisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluargcys

202530

112

30

prt

智人（homosapiens）

112

argleuphearggluargtyrargleuhisprolysphevalalaala

151015

valhistyrgluglnprothrileglnilegluleuarggln

202530

113

15

prt

智人（homosapiens）

113

alavalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuarggln

151015

114

33

prt

智人（homosapiens）

114

cysalaglyalapheasnhisseraspleuaspalagluleuargarg

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

115

33

prt

智人（homosapiens）

115

cysprolysphevalalaalavalhistyrgluglnprothrilegln

151015

cysglyleuaspleuargvalargglygluproleuglnvalgluarg

202530

cys

116

23

prt

智人（homosapiens）

116

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

151015

cysglyleuaspleuargval

20

117

15

prt

智人（homosapiens）

117

pheglnglyargglyglyleuaspleuargvalargglyglupro

151015

118

33

prt

智人（homosapiens）

118

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

151015

cysaspleuaspalagluleuargargleuphearggluargtyrarg

202530

cys

119

23

prt

智人（homosapiens）

119

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

151015

cysargglygluproleugln

20

120

33

prt

智人（homosapiens）

120

cysthrileglnilegluleuargglnasnthrserglnlysalaala

151015

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

202530

cys

121

33

prt

智人（homosapiens）

121

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

122

33

prt

智人（homosapiens）

122

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

123

33

prt

智人（homosapiens）

123

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

151015

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

202530

cys

124

33

prt

智人（homosapiens）

124

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

151015

cysglyleuaspleuargvalargglygluproleuglnvalgluarg

202530

cys

125

33

prt

智人（homosapiens）

125

cysaspalagluleuargargleuphearggluargtyrargleuhis

151015

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

202530

cys

126

17

prt

智人（homosapiens）

126

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

151015

cys

127

33

prt

智人（homosapiens）

127

cysalapheasnhisseraspleuaspalagluleuargargleuphe

151015

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

202530

cys

128

33

prt

智人（homosapiens）

128

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

129

33

prt

智人（homosapiens）

129

cysaspleuaspalagluleuargargleuphearggluargtyrarg

151015

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

202530

cys

130

32

prt

智人（homosapiens）

130

valhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasncys

151015

glyleuaspleuargvalargglygluproleuglnvalgluargcys

202530

131

33

prt

智人（homosapiens）

131

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

151015

cysaspleuaspalagluleuargargleuphearggluargtyrarg

202530

cys

132

32

prt

智人（homosapiens）

132

alavalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglncys

151015

alavalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglncys

202530

133

33

prt

智人（homosapiens）

133

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

151015

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

202530

cys

134

30

prt

智人（homosapiens）

134

thrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcys

151015

glncysargalaleuglyserglymetalavalaspcysser

202530

135

30

prt

智人（homosapiens）

135

asnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysgln

151015

cysargalaleuglyserglymetalavalaspcysserthr

202530

136

30

prt

智人（homosapiens）

136

lysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncys

151015

argalaleuglyserglymetalavalaspcysserthrleu

202530

137

30

prt

智人（homosapiens）

137

metthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncysarg

151015

alaleuglyserglymetalavalaspcysserthrleuthr

202530

138

30

prt

智人（homosapiens）

138

cysprothrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglygly

151015

argcysglncysargalaleuglyserglymetalavalasp

202530

139

30

prt

智人（homosapiens）

139

thrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncysargala

151015

leuglyserglymetalavalaspcysserthrleuthrser

202530

140

30

prt

智人（homosapiens）

140

thrcysprothrasnlysmetthrvalcysserproaspglyprogly

151015

glyargcysglncysargalaleuglyserglymetalaval

202530

141

30

prt

智人（homosapiens）

141

prothrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyarg

151015

cysglncysargalaleuglyserglymetalavalaspcys

202530

142

30

prt

智人（homosapiens）

142

valcysserproaspglyproglyglyargcysglncysargalaleu

151015

glyserglymetalavalaspcysserthrleuthrserlys

202530

143

30

prt

智人（homosapiens）

143

cysserproaspglyproglyglyargcysglncysargalaleugly

151015

serglymetalavalaspcysserthrleuthrserlyscys

202530

144

30

prt

智人（homosapiens）

144

cysthrcysprothrasnlysmetthrvalcysserproaspglypro

151015

glyglyargcysglncysargalaleuglyserglymetala

202530

145

30

prt

智人（homosapiens）

145

asncysthrcysprothrasnlysmetthrvalcysserproaspgly

151015

proglyglyargcysglncysargalaleuglyserglymet

202530

146

30

prt

智人（homosapiens）

146

aspasncysthrcysprothrasnlysmetthrvalcysserproasp

151015

glyproglyglyargcysglncysargalaleuglysergly

202530

147

33

prt

智人（homosapiens）

147

cysthrvalalaserproaspglyproglyglyargalaglnalaarg

151015

cysleuglyserglymetalavalaspalaserthrleuthrserlys

202530

cys

148

30

prt

智人（homosapiens）

148

glnaspasncysthrcysprothrasnlysmetthrvalcysserpro

151015

aspglyproglyglyargcysglncysargalaleuglyser

202530

149

30

prt

智人（homosapiens）

149

serproaspglyproglyglyargcysglncysargalaleuglyser

151015

glymetalavalaspcysserthrleuthrserlyscysleu

202530

150

33

prt

智人（homosapiens）

150

cysthrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyarg

151015

cysglncysargalaleuglyserglymetalavalaspalaserthr

202530

cys

151

15

prt

智人（homosapiens）

151

thrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncysarg

151015

152

33

prt

智人（homosapiens）

152

cysalaprolysasnalaargthrleuvalargprosergluhisala

151015

cysalaargthrleuvalargprosergluhisalaleuvalaspasn

202530

cys

153

32

prt

智人（homosapiens）

153

hisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluargcys

151015

hisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluargcys

202530

154

30

prt

智人（homosapiens）

154

thrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncysargala

151015

leuglyserglymetalavalaspcysserthrleuthrser

202530

155

30

prt

智人（homosapiens）

155

asnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysgln

151015

cysargalaleuglyserglymetalavalaspcysserthr

202530

156

30

prt

智人（homosapiens）

156

thrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcys

151015

glncysargalaleuglyserglymetalavalaspcysser

202530

157

30

prt

智人（homosapiens）

157

metthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncysarg

151015

alaleuglyserglymetalavalaspcysserthrleuthr

202530

158

30

prt

智人（homosapiens）

158

lysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyargcysglncys

151015

argalaleuglyserglymetalavalaspcysserthrleu

202530

159

30

prt

智人（homosapiens）

159

cysprothrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglygly

151015

argcysglncysargalaleuglyserglymetalavalasp

202530

160

30

prt

智人（homosapiens）

160

prothrasnlysmetthrvalcysserproaspglyproglyglyarg

151015

cysglncysargalaleuglyserglymetalavalaspcys

202530

161

33

prt

智人（homosapiens）

161

cysalaglyalapheasnhisseraspleuaspalagluleuargarg

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

162

17

prt

智人（homosapiens）

162

cysthrhishisileleuileaspleuarghisargprothralagly

151015

cys

163

33

prt

智人（homosapiens）

163

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

164

33

prt

智人（homosapiens）

164

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

165

32

prt

智人（homosapiens）

165

hisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluargcys

151015

hisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluargcys

202530

166

33

prt

智人（homosapiens）

166

cysaspalagluleuargargleuphearggluargtyrargleuhis

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

167

19

prt

智人（homosapiens）

167

cysaspalagluleuargargleuphearggluargtyrargleuhis

151015

cysprolys

168

30

prt

智人（homosapiens）

168

valcysserproaspglyproglyglyargcysglncysargalaleu

151015

glyserglymetalavalaspcysserthrleuthrserlys

202530

169

30

prt

智人（homosapiens）

169

aspleuserleuargcysaspgluleuvalargthrhishisileleu

151015

ileaspleuarghisargprothralaglyalapheasnhis

202530

170

33

prt

智人（homosapiens）

170

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

151015

cysaspleuaspalagluleuargargleuphearggluargtyrarg

202530

cys

171

17

prt

智人（homosapiens）

171

cyspheglnglyargglyglyleuaspleuargvalargglyglupro

151015

cys

172

33

prt

智人（homosapiens）

172

cysaspalagluleuargargleuphearggluargtyrargleuhis

151015

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

202530

cys

173

33

prt

智人（homosapiens）

173

cysglyleuaspleuargvalargglygluproleuglnvalgluarg

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

174

33

prt

智人（homosapiens）

174

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

175

33

prt

智人（homosapiens）

175

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

176

33

prt

智人（homosapiens）

176

cysaspalagluleuargargleuphearggluargtyrargleuhis

151015

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

202530

cys

177

33

prt

智人（homosapiens）

177

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

151015

cysargglygluproleuglnvalgluargthrleuiletyrtyrleu

202530

cys

178

15

prt

智人（homosapiens）

178

cysserproaspglyproglyglyargcysglncysargalaleu

151015

179

33

prt

智人（homosapiens）

179

cysthrvalalaserproaspglyproglyglyargalaglnalaarg

151015

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

202530

cys

180

33

prt

智人（homosapiens）

180

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

151015

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

202530

cys

181

30

prt

智人（homosapiens）

181

leuserleuargcysaspgluleuvalargthrhishisileleuile

151015

aspleuarghisargprothralaglyalapheasnhisser

202530

182

33

prt

智人（homosapiens）

182

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

183

33

prt

智人（homosapiens）

183

cystyraspproaspalaaspprogluglyargphelysalaarggln

151015

cysalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasnglnthr

202530

cys

184

15

prt

智人（homosapiens）

184

proaspcysaspprogluglyargphelysalaargglncysasn

151015

185

31

prt

智人（homosapiens）

185

cysalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasncyspro

151015

aspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasncys

202530

186

33

prt

智人（homosapiens）

186

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

151015

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

202530

cys

187

15

prt

智人（homosapiens）

187

valcysserproaspglyproglyglyargcysglncysargala

151015

188

33

prt

智人（homosapiens）

188

cystyraspproaspalaaspprogluglyargphelysalaarggln

151015

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

202530

cys

189

33

prt

智人（homosapiens）

189

cysalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasnglnthr

151015

cystyraspproaspalaaspprogluglyargphelysalaarggln

202530

cys

190

15

prt

智人（homosapiens）

190

aspcysaspprogluglyargphelysalaargglncysasngln

151015

191

33

prt

智人（homosapiens）

191

cysthrvalalaserproaspglyproglyglyargalaglnalaarg

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

192

33

prt

智人（homosapiens）

192

cysaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasngln

151015

cysaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasngln

202530

cys

193

33

prt

智人（homosapiens）

193

cysglyargphelysalaargglnalaasnglnthrservalalatrp

151015

cysalaargthrleuvalargprosergluhisalaleuvalaspasn

202530

cys

194

33

prt

智人（homosapiens）

194

cysalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasnglnthr

151015

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

202530

cys

195

33

prt

智人（homosapiens）

195

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

151015

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

202530

cys

196

15

prt

智人（homosapiens）

196

cysserproaspglyproglyglyargcysglncysargalaleu

151015

197

33

prt

智人（homosapiens）

197

cysgluglyargphelysalaargglnalaasnglnthrservalala

151015

cysgluglyargphelysalaargglnalaasnglnthrservalala

202530

cys

198

33

prt

智人（homosapiens）

198

cysthrvalalaserproaspglyproglyglyargalaglnalaarg

151015

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

202530

cys

199

33

prt

智人（homosapiens）

199

cysglyleutyraspproaspalaaspprogluglyargphelysala

151015

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

202530

cys

200

31

prt

智人（homosapiens）

200

aspproaspcysaspprogluglyargphelysalaargglncysasn

151015

cysglnthrservalcystrpcysvalasnservalglyvalarg

202530

201

32

prt

智人（homosapiens）

201

cysprogluglyargphelysalaargglnalaasnglnthrserval

151015

cysaspgluleuvalarghishisileleuileaspleuarghiscys

202530

202

33

prt

智人（homosapiens）

202

cysproaspglyproglyglyargalaglnalaargalaleuglyser

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

203

33

prt

智人（homosapiens）

203

cysthrleuvalargprosergluhisalaleuvalaspasnaspgly

151015

cysglyargphelysalaargglnalaasnglnthrservalalatrp

202530

cys

204

33

prt

智人（homosapiens）

204

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

151015

cystyraspproaspalaaspprogluglyargphelysalaarggln

202530

cys

205

33

prt

智人（homosapiens）

205

cysglyleutyraspproaspalaaspprogluglyargphelysala

151015

cysprogluglyargphelysalaargglnalaasnglnthrserval

202530

cys

206

15

prt

智人（homosapiens）

206

tyraspproaspcysaspprogluglyargphelysalaarggln

151015

207

33

prt

智人（homosapiens）

207

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

151015

cysalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasnglnthr

202530

cys

208

15

prt

智人（homosapiens）

208

cysaspprogluglyargphelysalaargglncysasnglnthr

151015

209

33

prt

智人（homosapiens）

209

cysvalasnservalglyvalargargthrasplysglyaspleuser

151015

cystyraspproaspalaaspprogluglyargphelysalaarggln

202530

cys

210

33

prt

智人（homosapiens）

210

cysservalglyvalargargthrasplysglyaspleuserleuarg

151015

cystyraspproaspalaaspprogluglyargphelysalaarggln

202530

cys

211

32

prt

智人（homosapiens）

211

hisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluargcys

151015

hisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluargcys

202530

212

33

prt

智人（homosapiens）

212

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

151015

cysaspleuaspalagluleuargargleuphearggluargtyrarg

202530

cys

213

30

prt

智人（homosapiens）

213

cysvalasnservalglyvalargargthrasplysglyaspleuser

151015

leuargcysaspgluleuvalargthrhishisileleuile

202530

214

30

prt

智人（homosapiens）

214

valargargthrasplysglyaspleuserleuargcysaspgluleu

151015

valargthrhishisileleuileaspleuarghisargpro

202530

215

33

prt

智人（homosapiens）

215

cysvalgluargthrleuiletyrtyrleuaspgluileproprolys

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

216

33

prt

智人（homosapiens）

216

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

217

33

prt

智人（homosapiens）

217

cysvalasnservalglyvalargargthrasplysglyaspleuser

151015

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

202530

cys

218

33

prt

智人（homosapiens）

218

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

219

30

prt

智人（homosapiens）

219

valglyvalargargthrasplysglyaspleuserleuargcysasp

151015

gluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

202530

220

33

prt

智人（homosapiens）

220

cysalaglyalapheasnhisseraspleuaspalagluleuargarg

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

221

33

prt

智人（homosapiens）

221

cysservalglyvalargargthrasplysglyaspleuserleuarg

151015

cysproaspalaaspprogluglyargphelysalaargglnalaasn

202530

cys

222

33

prt

智人（homosapiens）

222

cysvalargprosergluhisalaleuvalaspasnaspglyleutyr

151015

cysservalglyvalargargthrasplysglyaspleuserleuarg

202530

cys

223

33

prt

智人（homosapiens）

223

cysaspalagluleuargargleuphearggluargtyrargleuhis

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

224

33

prt

智人（homosapiens）

224

cysservalglyvalargargthrasplysglyaspleuserleuarg

151015

cysasnaspglyleutyraspproaspalaaspprogluglyargphe

202530

cys

225

33

prt

智人（homosapiens）

225

cysvalasnservalglyvalargargthrasplysglyaspleuser

151015

cysglyleutyraspproaspalaaspprogluglyargphelysala

202530

cys

226

33

prt

智人（homosapiens）

226

cysaspleuaspalagluleuargargleuphearggluargtyrarg

151015

cyshisseraspleuaspalagluleuargargleuphearggluarg

202530

cys

227

33

prt

智人（homosapiens）

227

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

228

33

prt

智人（homosapiens）

228

cysalaglyalapheasnhisseraspleuaspalagluleuargarg

151015

cysaspleuaspalagluleuargargleuphearggluargtyrarg

202530

cys

229

33

prt

智人（homosapiens）

229

cysaspalagluleuargargleuphearggluargtyrargleuhis

151015

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

202530

cys

230

33

prt

智人（homosapiens）

230

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

151015

cysaspleuaspalagluleuargargleuphearggluargtyrarg

202530

cys

231

33

prt

智人（homosapiens）

231

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

151015

cysvalhistyrgluglnprothrileglnilegluleuargglnasn

202530

cys

232

33

prt

智人（homosapiens）

232

cysglyvalargargthrasplysglyaspleuserleuargalaasp

151015

cysglyvalargargthrasplysglyaspleuserleuargalaasp

202530

cys

233

33

prt

智人（homosapiens）

233

cysglyleuaspleuargvalargglygluproleuglnvalgluarg

151015

cyshishisileleuileaspleuarghisargprothralaglyala

202530

cys

234

33

prt

智人（homosapiens）

234

cysaspleuaspalagluleuargargleuphearggluargtyrarg

151015

cysaspgluleuvalargthrhishisileleuileaspleuarghis

202530

cys