具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列及胺基酸序列的製作方法
2023-12-09 04:45:56 1
具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列及胺基酸序列的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種編碼海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列及其胺基酸序列，其核苷酸序列全長880bp，編碼海蚯蚓蛋白酶的核苷酸序列長813bp，編碼的海蚯蚓蛋白酶的胺基酸序列全長270個胺基酸殘基，包含15個胺基酸組成的信號肽，屬於醫藥生物工程領域。本發明的有益效果是：根據本發明的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列，可以從海蚯蚓的消化道組織中克隆該蛋白酶的編碼基因。該編碼基因通過基因重組技術，可以在原核表達系統中獲得表達。重組海蚯蚓蛋白酶具有抑制腫瘤細胞增殖的活性，可作為潛在的基因工程抗腫瘤藥物，進一步開發。
【專利說明】具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列及胺基酸序列
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種海蚯蚓蛋白酶，具體地說是一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的基因核苷酸序列及其胺基酸序列，屬於醫藥生物工程領域。
【背景技術】
[0002]海蟲丘蝴(Arenicola cristata),屬於海洋環節動物門多毛綱小頭蟲目沙糹屬科,形似蚯蚓，生活於潮間帶多沙地帶，營管居生活，故名海蚯蚓。主要分布於我國渤海、黃海沿岸。海蚯蚓始載於《中國藥用動物志》，用於癰瘡腫毒，有清熱解毒之功效。目前國內外有關海蚯蚓的研究報導不多，僅有I篇文獻報導從海蚯蚓體內提取到一種具有細胞毒性的烯醇硫酸留醇，而對具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的基因核苷酸序列及其胺基酸序列沒有任何報導。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其胺基酸序列。
[0004]為了實現上述發明目的，本發明採用以下技術方案:
以來自海蚯蚓消化道上皮細胞的mRNA為模板，採用同源序列克隆法，通過3' RACE、RACE技術，獲得了一種`編碼具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列。將該序列表達活性肽的部分經PCR擴增，克隆到表達載體pET-2Ia上，在原核表達系統大腸桿菌E.coliBL21中誘導表達，生產具有抗腫瘤活性的重組海蚯蚓蛋白酶。重組海蚯蚓蛋白酶具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，可作為新型的基因工程藥物。
[0005]海蚯蚓蛋白酶cDNA序列的克隆:
(O設計引物:根據絲氨酸蛋白酶家族的蛋白酶催化活性中心Ser附近所含的高度保守序列GDSGGP設計引物。
[0006](2)目的基因cDNA 3'端序列擴增及測序:由步驟(1)得到引物，和來自海蚯蚓消化道組織的總cDNA為模板，通過3' RACE CcDNASi末端快速擴增技術)擴增海蚯蚓蛋白酶的基因cDNA 3'端序列。PCR產物膠回收後分別連TA克隆載體，轉化細菌E.coli DH5 α，測序。
[0007](3)目的基因cDNA 5'端序列擴增及測序:根據獲得的目的基因cDNA 3'端序列設計兩對特異性引物，以來自海蚯蚓消化道組織的總cDNA為模板，採用5' RACECcDNA 5'末端快速擴增技術)，進行套式PCR，擴增海蚯蚓蛋白酶基因cDNA 5'端序列。PCR產物膠回收後分別連TA克隆載體，轉化細菌E.coli DH5a，測序。
[0008](4)拼接:應用contigexpress軟體對步驟(2)和(3)得到的目的基因cDNA端和5'端序列進行拼接，獲得本發明的海蚯蚓蛋白編碼基因的DNA (mRNA)序列。
[0009](5)根據上述步驟(4)得到的DNA (mRNA)序列，使用DNAMAN軟體，獲得該海蚯蚓蛋白酶cDNA編碼的胺基酸序列。
[0010]一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的編碼基因序列，該序列如下:
【權利要求】
1.一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列，其特徵在於，此序列由880個鹼基對組成，此核苷酸序列為:
2.根據權利要求1所述的海蚯蚓蛋白酶基因核苷酸序列，其表達的蛋白質為海蚯蚓蛋白酶，其特徵在於，海蚯蚓蛋白酶由270個胺基酸組成，其胺基酸序列為: IMKFLLIALFV SCASAFRLKA PTPKLffSSED SYIVGGDEAA VGQFPFQAVL LSSTSPGGSL `61TCGGVYIGAN SGGNHWLLNA AHCTQSSARS TffLGLHRRSD TSDGQHFTFV RIVNHPNYGS` `121 GAGAFPNDIS LCEINGAVDT SGSNVGMDL AE⑶NDYAGV SAIISGffGRT CGGCALPDEL `181 RFVETTVLPN SGANSCQTDff GSNVNDGHIC VKS⑶QSSGA CNGDSGGPMS IGNMVIGVTS `241 WGASGCLTSY PSAYSRVSFF RDWIREVSDI。
【文檔編號】A61P35/00GK103555744SQ201310524045
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月30日 優先權日:2013年10月30日
【發明者】趙春玲 申請人:濰坊醫學院