一種唇顎裂易感基因檢測晶片及檢測方法
2023-12-09 04:46:26
專利名稱：一種唇顎裂易感基因檢測晶片及檢測方法
技術領域：
本發明涉及基因晶片，具體的說是一種唇顎裂易感基因檢測晶片及檢測方法。
背景技術：
非症候群性唇裂伴或不伴顎裂(nonsyndromiccleft with or without cleftpalate, NSCL/P)是一種不屬於任何症候群的不伴發其它系統器官畸形的比較常見的先天顏面部缺陷，是人類最常見的先天性畸形之一。非症候群唇顎裂的治療需要外科、營養、牙科、語言、內科和行為等各學科的介入，給社會和家庭帶來重大的經濟負擔。世界不同地區不同種族唇顎裂的發病率有較大不同，平均為1/700，我國的發病率較高，為1/500。雖然對唇顎裂的確切病因尚無定論，但遺傳和環境兩大因素是目前公認的主要病因，國外報導唇顎裂的遺傳率為60% -78%。
唇顎裂是多基因遺傳性疾病，它具有以下特點參與發病的基因不止一個，每個基因的作用程度不同，起主要作用的基因為主效基因，起次要作用的基因為次要基因，不同基因之間存在交互作用，各個致病基因作用於發育的不同環節。因此，研究唇顎裂的易感基因，探索易感基因與唇顎裂之間的相互聯繫，檢測易感人群的基因對提高我國人口素質，降低唇顎裂的發生率有重要意義。目前唇顎裂的研究表明下列幾種基因可能與唇顎裂的發生有關(I)轉化生長因子A (transforming growth factor a，TGFA)是一種生長因子,其受體是表皮生長因子受體，能刺激上皮細胞的增生並誘導其分化，對許多正常細胞的生長具有調節作用。Ardinger在1989年最早發現TGFA的Taq-I酶切位點與唇顎裂可能相關，隨後國內的學者也發現中國人群病例組TGFA的Taq-I位點C2等位基因頻率高於對照組，有統計學差異。(2)轉化生長因子B3 (transforming growth factor2 0 3, TGFB3)在顎板正常融合過程所需要的顎板中縫上皮細胞中特異性表達，對顎板中縫上皮細胞融合及顎板中線消失起作用。Kim在韓國人群中發現TGFB3的一個SNP位點，第五內含子的第104個鹼基有異常突變，即IVS5+104A —G，這種突變在病例組中出現頻率顯著高於對照組。(3)幹擾素調節因子6 (interferon regulatory factor 6, IRF6)屬於 IRFs 家族，即幹擾素調節因子家族。IFR6等位基因缺陷將導致唇顎裂及缺牙，說明IFR6直接參與唇、顎、牙的發育。Zuccheix)對來自亞洲、歐洲、南美洲的8003位患者的IFR6等位基因進行單體型和連鎖分析，並經過病例對照分析得出NSCL/P發生的風險性與IFR6等位基因的基因變異有關。研究人員還發現如果一個家庭已經出生一名IRF6的第274個胺基酸位點valine變異的NSCL/P患兒，那麼這個家庭再出生NSCL /P患兒的風險是正常家庭的3倍。(4)同源異型盒基因I (musclesegment homebox I, MSX1),該基因有核轉錄因子活性,可編碼具有生化特性的蛋白。它出現異常時，臨床上有下列表型NSCL/P、伴口面裂畸形的牙發育不全、常染色體顯性遺傳的牙發育不全等。MSXl基因敲除後小鼠顎裂的發生率為100%，MSXl表達於包括顎板在內的正在發育的頜面結構中。在人4p染色體病症候群中就有MSXl的缺失，且常有唇顎裂的發生。(5)亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是葉酸代謝的關鍵酶，編碼此酶的C677T的突變會導致酶不耐熱並且活性降低。Gaspar分析了雙親的遺傳後認為母親C677T位點的T或C的純合子基因型是CLP發生的一個重要易感因素。Martinelli發現同正常對照組相比NSCLP患者的母親的亞甲基四氫葉酸還原酶有更高的突變頻率。(6)脊髓灰質炎病毒受體相關基因I (poliovirus receptor2 related I,PVRLI)編碼結合素(nectin21)，結合素是a皰疹病毒間接進入人體的主要受體。最近的研究表明nectin21的主要功能應是細胞間黏附，在面部和顎部的角化細胞上優先表達。(7)SUMO — I基因作為一個修飾因子編碼小類泛素修飾蛋白，主要作用是翻譯後的調控，對基因表達及基因組的穩定性具有意義，幾個和類泛素化有關的蛋白也直接和唇顎裂相關聯，如MSX1、SATB2和TBX22編碼的蛋白。國內學者研究表明SUM0-1基因與唇顎裂發生相關。(8)B細胞淋巴因子3 (B cellleukemia / lymphoma 一 3, BCL3)是一個原癌基因。研究表明它的功能性突變會導致中部邊緣上皮過度生長，而引起面部始基融合紊亂。它的顯性突變會導致間充質發育中的重要基因表達受抑制，使細胞生長失常而引起CLP。基於上述這些基因可能與唇顎裂的發生相關，而國內外尚未涉及使用基因晶片方法來檢測唇顎裂易感人群的研究。
發明內容
本發明目的在於提供一種唇顎裂易感基因檢測晶片及檢測方法。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種唇顎裂易感基因檢測晶片，所述晶片包括基片和位於基片上的核酸探針，核酸探針包括核酸序列為SEQ NO. 1-38的核苷酸序列，所述探針的3』端進行氨基修飾。所述基片為經過表面活化處理的載玻片。所述晶片還包括陽性對照、陽性探針和陰性對照。所述晶片中的探針點樣矩陣以6*6陳列排布。唇顎裂易感基因檢測方法提取待檢驗的DNA，使用引物對進行PCR擴增；擴增產物再經延伸，延伸時加入混有CY3-dCTP的dNTP底物，延伸產物與所述唇顎裂易感基因檢測晶片雜交；通過檢測晶片上CY3的信號值來檢測晶片雜交的結果。所述PCR擴增所採用的引物為SEQ NO. 76-101中的核苷酸序列和延伸引物核酸序列為SEQ NO. 39-75的核苷酸序列所示。所述唇顎裂易感基因檢測晶片在檢測唇顎裂易感基因中的應用。本發明所具有的優點本發明的唇顎裂易感基因的基因晶片用以檢測各基因與唇顎裂之間的關係。該基因晶片將所有基因中可能與唇顎裂發生相關的位點探針集成到一張晶片上，利用鹼基互補雜交方法，實現了高通量，快速，準確的檢測。通過唇顎裂易感基因檢測晶片可快速簡便的對易感人群進行基因篩查，可在孕早期或孕前預測出高危人群，從而通過減少接觸危險因素，改善條件等手段，預防和降低唇顎裂的發生。
圖I為本發明實施例所提供的工藝流程圖。圖2為本發明實施例提供的TGFA TaqI位點OR值圖表。圖3為本發明實施例提供的唇顎裂基因晶片延伸引物設計原理圖。圖4為本發明實施例提供的探針點樣及陽性陰性對照點樣矩陣圖。圖5為本發明實施例提供的晶片檢驗效果圖。圖6為本發明實施例提供的PCR擴增樣品流程圖。
圖7為本發明實施例提供的樣品純化流程圖。
具體實施例方式實施例II.樣品提取DNA :取200ul樣品用血液DNA提取試劑盒(天根生化科技)提取樣品的DNA，待用。2.易感基因位點的選擇、引物及探針序列設計I)根據現有唇顎裂相關易感基因，通過meta分析方法，對每個易感基因進行分類統計，計算OR值，統計出與中國人群唇顎裂發生相關的易感基因位點。以TGFA的Taq I基 因位點為例，統計所有研究中國人群唇顎裂TGFATaq I位點文獻中的病例與對照的數據，用review manager 4. 2軟體進行計算,結果如下圖I,該位點OR值為2. 59,大於I,所以該位點為唇顎裂發生的危險因素。與中國人群唇顎裂相關的基因位點的OR值及SNP多態性核酸序列(參見表I)。表I唇顎裂各個相關基因SNP多態性核酸序列
序號 Gene SNP SNP sequenceOR 值
No. I~ TGFA 一 Taq I CCTATGAAAGGTCTC [TAAT/-] GACCTTAAAACCCT2.59
No. 2~ TGFA 一 C3827T TGTATCCTCTAACCACGAGAC[C/T]CTCAACCAGCC2. 16
No. 3~ TGFA 一 T3851C GCCCAACATCTTCCA [T/C]GGACACATGACAT1.87
No. 4~ TGFA 一 G3822A TGTATCCTC TAACCAC[G/A]AGACCCTCAACCAGCC1.96
No. 5~ IRF6 一 RS2235371 CCGTCAGCCTGGAGCAG[G/A]TCAAATTCCCAGGTCCTG2.76
No. 6~ IRF6 — RS2235375 AGACTTTATCTTTCTTGCT[C/T]GGTCTTCTGCTTCTATTAT2.31
No7 IRF6 — RS2013162 GCTGGATCAGTC[G/T]CAGCACCATGTTCCCATCC1.75
No. 8~ BCL3 一 RS1046881 GGAGGGGCCCCCCTGCCCTG [T/A]GGGGTCAACCCTTCTGGAAACTGTG1.89
No. 9~ TGFB3~ RS3917201 ACAGAGGGTCCC TGAT[G/A]CTATTCACAAACATCTCCA2. 13
No. ~ MTHFR~ C677T CCATAAGCTCCCTCCA[C/T]CCCACTCTCAC2.05
No. ~ MTHFR~ A1298C AGGAGCTGACCAGTGAAG[A/C]AAGTGTCTTTGAAGTC1.75
No. ~ PVRLl~ G546A GCCTCCCAG TGTGGTATCCTG[G/A]GAAACTCGGTTAAAAGG1.62
No. ~ SUMO-T" RS7580433 TATTTTGAAATGGAGTTGTG [C/T] TCTTGTTGGCAGGCTGGAGTGC1.48
No. ~ MSXl — A1170G GAGAGGTTAACAGATTTATCTA[A/G]GGTCCCCAGCAGAATTG1.38
No. ~ MSXl一 C330T TCGCCGCGGCCGCTCGG[C/T]CATTTCTCGGTGGGGGGACTCC2.35
No. ~ MSXl一 ClOlG CAGCGCCGCCGCGGCCACGG[C/G]AGCCGCCATGGGCGCGGACGAGG1.64
No. ~ MSXl — C440A AGCCCCCGCTTCTC CC[C/A]GCCGCCGGCCAGTGAGTAGCCAG2.28
No. 18 MSXl G293A GTCCCGCCGGGGTCGCTGG[G/A]AGCCCCGGACGCGCCCTC1.962.引物設計。針對每個位點用引物設計軟體Primer5.0設計上下遊擴增引物(參見表2)。表2.引物序列
IFtJI 麗.....丨.....—^^1—畫.麗—p.麗雨^
p1TCACTTCCCCTTTTTCATCTGCGAGGAGGCTCCTCACCTC r.Taql__SEQ NO. 76__SEQ NO. 77_
權利要求
1.一種唇顎裂易感基因檢測晶片，所述晶片包括基片和位於基片上的核酸探針，其特徵在於核酸探針包括核酸序列為SEQ NO. 1-38的核苷酸序列，所述探針的3』端進行氨基修飾。
2.按權利要求I所述的唇顎裂易感基因檢測晶片，其特徵在於所述晶片還包括陽性對照、陽性探針和陰性對照。
3.—種權利要求I所述的唇顎裂易感基因檢測方法，其特徵在於提取待檢驗的DNA，使用引物對進行PCR擴增；擴增產物再經延伸，延伸時加入混有CY3-dCTP的dNTP底物，延伸產物與所述唇顎裂易感基因檢測晶片雜交；通過檢測晶片上CY3的信號值來檢測晶片雜交的結果。
4.按權利要求3所述唇顎裂易感基因檢測方法，其特徵在於所述PCR擴增所採用的引物為SEQ NO. 76-101中的核苷酸序列和延伸引物核酸序列為SEQ NO. 39-75的核苷酸序列所示。
5.按權利要求I所述唇顎裂易感基因檢測方法，其特徵在於所述唇顎裂易感基因檢測晶片在檢測唇顎裂易感基因中的應用。
全文摘要
本發明涉及基因晶片，具體地說，是一種唇顎裂易感基因檢測晶片及檢測方法。所述晶片包括基片和位於基片上的核酸探針，核酸探針包括核酸序列為SEQ ID NO.1-34的核苷酸序列，所述探針的3』端進行氨基修飾。本發明的唇顎裂易感基因的基因晶片用以檢測各基因與唇顎裂之間的關係。該基因晶片將所有基因中可能與唇顎裂發生相關的位點探針集成到一張晶片上，利用鹼基互補雜交方法，實現了高通量，快速，準確的檢測。通過唇顎裂易感基因檢測晶片可快速簡便的對易感人群進行基因篩查，可在孕早期或孕前預測出高危人群，從而通過減少接觸危險因素，改善條件等手段，預防和降低唇顎裂的發生。
文檔編號C40B40/06GK102747145SQ201210158599
公開日2012年10月24日 申請日期2012年5月21日 優先權日2012年5月21日
發明者劉強, 盧永平, 李增建, 李建新, 胥威, 韓維田 申請人:遼寧省計劃生育科學研究院