番茄潰瘍病菌快速ims-pcr檢測試劑盒和製備方法及其使用方法

2024-04-01 08:48:05

專利名稱：番茄潰瘍病菌快速ims-pcr檢測試劑盒和製備方法及其使用方法
技術領域：
本發明涉及一種在番茄潰瘍病菌基因水平上快速檢測的試劑盒，屬於植物 檢疫和植物保護領域，專一針對番茄潰瘍病菌(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)的檢測。本試劑盒適用於番茄潰瘍病的田間預防和出入境植物檢疫 及植物保護中番茄潰瘍病菌的快速檢測。
背景技術：
番茄潰瘍病(Bacterial canker of tomato)是影響番茄生產最重要的細菌性病 害。該病分布廣泛，在世界範圍內已經廣泛流行並造成了巨大的經濟損失，在我國的東北、 華北、西北及東部沿海等地均有發生，部分地區產量減少在80%以上，導致我國番茄產量銳 減並造成了巨大的經濟損失，同時嚴重威脅著我國外繁種子基地的健康發展。番茄植株從幼苗到坐果期都可發病，發病的植株常表現為病苗矮化枯死、莖杆增 粗潰瘍、葉片壞死萎蔫、果實皺縮畸形等症狀，嚴重影響了番茄的產量和品質，給各國番茄 主要生產區造成了嚴重的經濟損失。在苗期染病，症狀初始於下部葉緣，隨後向上蔓延引 起整株葉片萎蔫，造成病苗矮化或枯死。在成株期染病，主要表現為植株葉片萎蔫、下垂、卷 縮，植株莖杆產生狹長稍凹陷的開裂狀條斑，莖杆增粗。病菌侵染種子時，通常表現為萎蔫， 此時維管束受到嚴重破壞；病菌通過植株表面的毛孔、水孔等自然孔口侵染後，則會出現葉 片邊緣壞死、萎蔫等局部症狀；病菌侵染維管束時，則造成果實皺縮、畸形；病菌侵染果實 時則出現白色圓形小點，後變黃褐色，病斑中央粗糙突起，四周有白色暈圈，呈「鳥眼狀」。 在葉片，最初的症狀是葉片出現可逆性的萎蔫，在葉片的葉脈之間產生白色隨後轉為褐色 的壞死條斑，最後表現出永久性萎蔫，使整個植株乾枯死亡。在田間，最初的症狀主要是低 位葉片的小葉邊緣出現捲縮、下垂、凋萎、似缺水狀，最後造成大片的缺株斷壟，危害十分嚴 重。番茄潰瘍病遠距離廣泛傳播最主要的途徑是種子中攜帶的番茄潰瘍病菌，有研究 表明0.01%的種子傳病率就能引起該病的大面積流行。更有研究表明，導致病害在田間流 行並造成較大經濟損失的最主要原因是初侵染，而初侵染最重要的來源是種子帶菌。至今， 尚無成功防治該病害的抗病品種和有效的藥物。因此，嚴格控制帶菌種子流入市場是防止 該病暴發的最重要的措施之一。但是，番茄種子的帶菌率普遍較低，一般為1 %，常規的檢測 方法常常導致漏檢。目前國內外對番茄潰瘍病菌檢測採用的方法主要有育苗檢測、分離培 養檢測、免疫血清學和PCR檢測等方法。育苗檢測、分離檢測所需檢測時間較長，無法滿足 多批次種子進出口檢測要求；免疫血清學如ELISA檢測靈敏度相對較低，且常有交叉反應， 種子樣品中的雜質和其他抑制劑等因素也使得PCR的檢測靈敏度較低。因此，發展一種將 病原富集技術和PCR高靈敏檢測有效結合的方法，是出入境商用番茄種子快速檢測急需解 決的實際問題。

發明內容
本發明的目的在於避免現有技術的不足提提供一種番茄潰瘍病菌快速免疫磁珠 分離PCR(Immunomagnetic separation-PCR, IMS-PCR)檢測試劑盒，以克服現有植物病原菌 檢測方法靈敏性低、特異性差、檢測周期長的缺點。本發明是將免疫磁珠分離技術和分子生 物學檢測技術結合起來，首先利用免疫磁珠對番茄潰瘍病菌進行富集，然後再利用分子生 物學的高檢測靈敏度，進行PCR擴增，從而建立了一種將免疫磁珠分離技術和分子生物學 技術有機結合起來的檢測方法。該方法檢測靈敏度高、特異性強、方便快捷、能直接對帶菌 種子進行檢測，同時省去了核酸提取的過程，降低了操作過程中病原的損失，極大地提高了 檢測的準確性和靈敏度，縮短了檢測周期，是一種特別適用於番茄種子等植物材料中微量 病原的檢測方法。為實現上述目的，本發明採取的技術方案為一種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢 測試劑盒，其主要特點是包括有10XPCR Buffer 1管，2. 5mM dNTPsl管，5U Taq DNA聚合 酶 1 管，5 ii M 上遊引物 5 『 -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 『 200u L,5uM 下遊引物 5 『 -TA CTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 『 200 u L，去離子水1管，PBST洗液1管，番茄潰瘍病菌特異性免 疫磁珠1管，體積為2 5_X 2 5_X 2 5_的普通磁體1塊，陽性對照1管。所述的免疫磁珠購買於Promega公司。一種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒的使用方法，其主要特點是步驟為(1)病菌富集取檢測樣品lmL置於離心管中，然後在每個離心管內加入50 PL 番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠，磁珠量為105-106個/mL，在搖床上室溫搖動2h，轉速為 150rpm，然後將檢測樣品置於磁體上靜置5min，待磁珠被收集到管壁的一側時，用移液器小 心吸去檢測樣品，然後再用PBST洗滌離心管3次，每次2min，在磁體上靜置5min，然後棄去 洗液；(2)PCR擴增將富集病菌後的免疫磁珠重懸於50iiL去離子水中，離心混 勻後再轉移到PCR管內，然後放於PCR儀中，99°C熱裂解15min，然後迅速轉移到冰 上冷卻5min，再5000rpm離心2min，取其上清36. 6yL轉移至另一 PCR管中，再在 該管內加入再加入 10XPCR buffer 5u L,2. 5mM dNTPs4 u L.5U/u L Taq DNA 聚合 酶 0. 4 ii L、5 ii M 上遊引物 5 ' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 『 2 ii L，5 ii M 下遊弓 | 物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 『 2 ii L，擴增條件為 94 °C 2min ；94°C 30s, 62. 5 °C 45s, 72°C 45s，35個循環，然後72°C延伸7min，最後4°C保存，陽性樣品可擴增出大小為270bp的 特異性目標片段。(3)結果分析灌制1.5%瓊脂糖凝膠，取10yL PCR產物進行電泳分離，在凝膠成 像系統下進行拍照並分析，若陽性對照和檢測樣品在270bp處可見特異性目標條帶，陰性 對照沒有特異性目標條帶，則判定檢測樣品為陽性。一種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒特異性免疫磁珠的製備方法，其主要 特點是步驟為(1)將N-羥基琥珀醯亞胺生物素(NHS-Biotin)溶於二甲基甲醯胺(DMF)中，調整 生物素濃度為50 u g/mL ；(2)測定抗體的濃度，並用pH為9. 6的碳酸鹽緩衝液將抗體稀釋到10 u g/mL ；(3)按生物素與抗體的質量比為1 10的比例混合，室溫振蕩反應4h;
(4)將透析孔徑為8000-14000的透析膜剪成長度為5-lOcm的小段，然後在500mL 2%的NaHC03和lmmol/L pH為8. 0的Na2EDTA 2H20中將透析膜煮沸lOmin,再用去離子 水徹底清洗透析膜，然後放於lmmol/L Na2EDTA -2H20中將之煮沸lOmin，冷卻後放於4°C冰 箱，確保透析膜始終浸沒在溶液內，最後用去離子水將透析膜內外衝洗乾淨，結紮透析膜的 一端後將生物素化的抗體移入透析袋中，然後再結紮透析袋的另一端，放於250mL PBS中透 析過夜，期間更換緩衝液2次；(5)將鏈黴親和素磁珠用碳酸鹽緩衝液洗滌3次，每次2min，然後在磁體上靜置 5min,棄去鏈黴親和素磁珠保存液，鏈黴親和素磁珠保存液為pH7. 4,0. 1% BSA和0. 02 % NaN3的溶液，然後將鏈黴親和素磁珠重懸於相同體積的碳酸鹽緩衝液中；(6)將經過透析後的生物素化抗體全部轉移至鏈黴親和素磁珠儲存管內，在振蕩 器上室溫振蕩2h，讓鏈黴親和素和生物素充分反應；(7)將連接抗體後的磁珠在磁體上靜置5min，去除未結合到鏈黴親和素磁珠上的 過量抗體，然後用PBST洗滌3次，每次2min，最後將連接抗化後的磁珠重懸於碳酸鹽緩衝液 中，從而製備出番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠。一種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒植物病原抽提方法，其主要特點是步 驟為(1)植物樣品病原抽提按照種子重量與病原提取液為1 4的比例(g/mL)，稱取 2g番茄種子，置於研缽中用棒杵研磨至種皮破裂，加入8mL普通病原抽提緩衝液，然後將病 原抽提緩衝液和種子碎片一同轉移到10mL離心管中，混勻，此時，抽提緩衝液與種子的種 皮內外層充分接觸，室溫靜置lh或4°C過夜後，則種子上攜帶的植物病原的多數位於抽提 緩衝液的上清部分中；(2)抽提緩衝液配方為硫酸鈉0. 13g/mL，聚乙烯吡咯烷酮2g/mL，疊氮化鈉 0. 02g/mL,吐溫-20 0. 5ml/L,調 pH 值至 7. 4。一種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒模板DNA快速獲取方法，其主要特點 是步驟為取檢測樣品lmL置於離心管中，然後在每個離心管內加入50 y L番茄潰瘍病菌 特異性免疫磁珠，在搖床上室溫搖動2h，然後將檢測樣品置於磁體上靜置5min，待磁珠被 收集到管壁的一側時，用移液器小心吸去檢測樣品，然後再用PBST洗滌離心管3次，每次 2min，在磁體上靜置5min，然後棄去洗液，將富集病菌後的免疫磁珠重懸於50 y L去離子水 中，離心混勻後再轉移到PCR管內，將PCR管放於PCR儀中，99°C裂解15min，然後迅速轉移 到冰上冷卻5min，再5000rpm離心2min，則其上清部分即為可用於PCR擴增的DNA。番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒，屬於植物檢疫和植物保護範疇， 本發明是屬於基因水平檢測，檢測的基因位於16S-23S rRNA間隔區，上遊引物 序列為，Cmm F1 5 『 -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 『，下遊引物序列為，Cmm R1 5 『 -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 『，引物具有亞種特異性，專一針對番茄潰瘍病的病原密 執安棒形桿菌密執安棒形亞種。使用本發明試劑盒對參試的番茄潰瘍病菌菌株進行檢測， 可以擴增得到270bp大小的特異性目標片段，而參試的其餘非番茄潰瘍病菌菌株均未擴增 出特異性目標片段。同時用本試劑盒對ELISA檢測為陽性的樣品進行回顧性檢驗驗證，陽 性樣品符合率為100%，說明本試劑盒具有較好的檢測靈敏度。
番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒，是將免疫磁珠分離技術和PCR特異性擴 增結合起來的一種新技術，該技術集病原分離富集、特異性抗體捕捉和PCR擴增於一體，是 一種檢測靈敏度高、檢測周期短、結果準確、使用方便的植物病原檢測試劑盒，尤其適用於 植物保護和植物檢疫部門對可能含有微量番茄潰瘍病菌的樣品進行快速檢測。本發明試劑盒的有益效果番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒，涉及到檢測 危險性植物病原菌的一種新技術，試劑盒提供了一種依賴免疫磁珠分離技術富集病原和 PCR擴增的檢測技術，克服了現有植物病原菌檢測方法靈敏性低、特異性差、檢測周期長的 缺點，具有檢測靈敏度高，特異性強，檢測周期短，操作簡便快捷的優點，可以在5h內就完 成整個檢測過程。本試劑盒可以直接從番茄種子等植物組織中檢測番茄潰瘍病菌，大大簡 化了檢測程序，提高了我國口岸的檢疫水平，同時為病害防治策略的制定提供了依據。試劑盒特異性驗證試驗通過使用番茄潰瘍病菌亞種特異性引物Cmm F1和Cmm R1對番茄潰瘍病菌菌株和非番茄潰瘍病菌菌株進行檢測，結果表明引物Cmm F1和Cmm R1 在優化的PCR擴增條件下在番茄潰瘍病菌株中擴增出了大小約270bp的特異性目標片段， 而在其他7個參試的非番茄潰瘍病菌菌株中均未擴增出特異性目標片段，說明本發明中使 用的引物對番茄潰瘍病菌具有較高的特異性。試劑盒靈敏度驗證試驗在梯度稀釋的純菌懸液中，本試劑盒的檢測靈敏度可以 達到102cfu/mL，也即是4. 3X102cfu/mL ；在梯度稀釋的模擬帶菌種子提取液中，本試劑盒 的檢測靈敏度同樣可以達到102cfu/mL，也即是4. 3X102cfu/mL。而使用直接PCR在梯度稀 釋的純菌懸液和模擬帶菌種子提取液中的檢測靈敏度僅為104cfu/mL和106cfu/mL。也即是 說，本試劑盒在模擬帶菌種子提取液中的檢測靈敏度比普通PCR高104倍，比常規的ELISA 方法檢測靈敏度也高104倍。試劑盒實用性驗證使用本試劑盒對可能自然感染番茄潰瘍病菌的5批番茄種子 進行檢測，結果在5批種子中均擴增出大小為270bp的目標片段，而採用ELISA方法在同樣 的5批番茄種子中只有2批檢測為陽性，實驗結果表明本試劑盒的檢測靈敏度比ELISA試 劑盒高，更適用於實際的種子病原檢測。


圖1番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒原理圖；圖2試劑盒使用流程圖；圖3試劑盒特異性驗證結果；圖中1-7 號泳道分別為 Cmm、Pss、Pst、Xcv、Xcc、Xcp、Psl，細菌濃度均為 107cfu/ mL，M 為 lOObp DNA ladder。圖4梯度稀釋純菌液直接PCR結果；圖中1-7號泳道細菌濃度為2. 4X107-2. 4X101cfu/mL, N為陰性對照，P為陽性 對照，M 為 lOObp DNA laddero圖5梯度稀釋純菌液IMS-PCR結果；圖中1_6號泳道細菌濃度為4. 3X106_4. SXlOicfu/mLN為陰性對照，M為lOObp DNA laddero圖6梯度稀釋模擬帶菌種子提取液直接PCR結果；
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圖中1-7號泳道細菌分別為2. 4X107-2.4X IO1CfuAiI^N為陰性對照，M為IOObp DNA ladder。 圖7梯度稀釋模擬帶菌種子提取液IMS-PCR結果；圖中1_6號泳道細菌濃度為4. 3X 106-4.3Χ10、 \ι/ιΛ，N為陰性對照，M為IOObp DNA ladder。圖8自然感染種子IMS-PCR結果。圖中1-5號泳道分別為5批自然感染的番茄種子，P為陽性對照，M為IOObp DNA Iadder0
具體實施例方式以下結合附圖對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明，並 非用於限定本發明的範圍。實施例1 一種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒，包括有IOXPCRBuffer 1 管，2. 5mM dNTPs 1 管，5U Taq DNA 聚合酶 1 管，5 μ M 上遊引物 5' -TCATTGGTCAATTCTGTCTC CC-3' 200 μ L，5 μ M 下遊引物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 『 200 μ L,去離子水 1 管， PBST洗液1管，番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠1管，體積為2mmX3mmX5mm的普通磁體1 塊，陽性對照1管。實施例2 見圖2，一種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒的使用方法，其主要 特點是步驟為(1)病菌富集取檢測樣品ImL置於離心管中，然後在每個離心管內加入50 μ L 番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠，磁珠量為IO5-IO6個/mL，在搖床上室溫搖動2h，轉速為 150rpm，然後將檢測樣品置於磁體上靜置5min，待磁珠被收集到管壁的一側時，用移液器小 心吸去檢測樣品，然後再用PBST洗滌離心管3次，每次2min，在磁體上靜置5min，然後棄去 洗液；(2)PCR擴增將富集病菌後的免疫磁珠重懸於50μ L去離子水中，離心混 勻後再轉移到PCR管內，然後放於PCR儀中，99 °C熱裂解15min，然後迅速轉移到冰 上冷卻5min，再5000rpm離心2min，取其上清36. 6yL轉移至另一 PCR管中，再在 該管內加入再加入 10XPCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTPs4 μ L、5U/μ L Taq DNA 聚合 酶 0. 4 μ L、5 μ M 上遊引物 5 『 -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 『 2 μ L，5 μ M 下遊弓| 物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 『 2 μ L，擴增條件為 94 °C 2min ；94 °C 30s, 62. 5 °C 45s, 72°C 45s，35個循環，然後72°C延伸7min，最後4°C保存，陽性樣品可擴增出大小為270bp的 特異性目標片段。(3)結果分析灌制1.5%瓊脂糖凝膠，取IOyL PCR產物進行電泳分離，在凝膠成 像系統下進行拍照並分析，若陽性對照和檢測樣品在270bp處可見特異性目標條帶，陰性 對照沒有特異性目標條帶，則判定檢測樣品為陽性。實施例3 —種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒特異性免疫磁珠的製備方 法，其主要特點是步驟為(1)將N-羥基琥珀醯亞胺生物素(NHS-Biotin)溶於二甲基甲醯胺(DMF)中，調整 生物素濃度為50 μ g/mL ；
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(2)測定抗體的濃度，並用pH為9. 6的碳酸鹽緩衝液將抗體稀釋到10 μ g/mL ；(3)按生物素與抗體的質量比為1 10的比例混合，室溫振蕩反應4h;(4)將透析分子量為8000-14000的透析膜剪成長度為5-lOcm的小段，然後在 500mL 2% 的 NaHCO3 和 lmmol/L pH 為 8. 0 的 Na2EDTA · 2H20 中將透析膜煮沸 IOmin,再用 去離子水徹底清洗透析膜，然後放於lmmol/L Na2EDTA · 2H20中將之煮沸lOmin，冷卻後放 於4°C冰箱，確保透析膜始終浸沒在溶液內，最後用去離子水將透析膜內外衝洗乾淨，結紮 透析膜的一端後將生物素化的抗體移入透析袋中，然後再結紮透析袋的另一端，放於250mL PBS中透析過夜，期間更換緩衝液2次；(5)將鏈黴親和素磁珠用碳酸鹽緩衝液洗滌3次，每次2min，然後在磁體上靜置 5min，棄去鏈黴親和素磁珠保存液，鏈黴親和素磁珠保存液為pH7. 4,0. 1 % BSA和0. 02% NaN3的溶液，然後將鏈黴親和素磁珠重懸於相同體積的碳酸鹽緩衝液中；(6)將經過透析後的生物素化抗體全部轉移至鏈黴親和素磁珠儲存管內，在振蕩 器上室溫振蕩2h，讓鏈黴親和素和生物素充分反應；(7)將連接抗體後的磁珠在磁體上靜置5min，去除未結合到鏈黴親和素磁珠上的 過量抗體，然後用PBST洗滌3次，每次2min，最後將連接抗化後的磁珠重懸於碳酸鹽緩衝液 中，從而製備出番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠。實施例4 一種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒植物病原抽提方法，其步驟 為(1)植物樣品病原抽提按照種子重量與病原提取液為1 4的比例(g/mL)，稱取 2g番茄種子，置於研缽中用棒杵研磨至種皮破裂，加入SmL普通病原抽提緩衝液，然後將病 原抽提緩衝液和種子碎片一同轉移到IOmL離心管中，混勻，此時，抽提緩衝液與種子的種 皮內外層充分接觸，室溫靜置Ih或4°C過夜後，則種子上攜帶的植物病原的多數位於抽提 緩衝液的上清部分中；(2)抽提緩衝液配方為硫酸鈉0. 13g/mL,聚乙烯吡咯烷酮2g/mL，疊氮化鈉 0. 02g/mL,吐溫-200. 5ml/L,調 pH 值至 7. 4。實施例5 —種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒模板DNA快速獲取方法，其 步驟為取檢測樣品ImL置於離心管中，然後在每個離心管內加入50 μ L番茄潰瘍病菌 特異性免疫磁珠，在搖床上室溫搖動2h，然後將檢測樣品置於磁體上靜置5min，待磁珠被 收集到管壁的一側時，用移液器小心吸去檢測樣品，然後再用PBST洗滌離心管3次，每次 2min，在磁體上靜置5min，然後棄去洗液，將富集病菌後的免疫磁珠重懸於50 μ L去離子水 中，離心混勻後再轉移到PCR管內，將PCR管放於PCR儀中，99°C裂解15min，然後迅速轉移 到冰上冷卻5min，再5000rpm離心2min，則其上清部分即為可用於PCR擴增的DNA。實施例6 見圖3，對番茄潰瘍病菌和非番茄潰瘍病菌菌株特異性性驗證試驗收集 1 株番爺饋蕩病菌(Clavibacter michiganensi s subsp. michiganensis， Cmm)和6株非番茄潰瘍病菌菌株驗證本試劑盒的特異性，這6株病菌分別為丁香假 單胞桿菌丁香致病型(Pseudomonas syringae pv. syringae，Pss)，番爺細菌性葉斑
(Pseudomonas syringae pv. toma to, Pst),番茄細菌性瘡痂病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv),十字花禾鬥蔬菜黑腐致病變禾中(Xanthomonas
9campestris pv. campestris, Xcc),大醜細菌斑疫病菌(Xanthomonas campestris phaseoli，Xcp)，甜瓜細菌性葉斑病菌(Pseudomonas syringae pv· lachrymans，Psl)。分別取上述6株非番茄潰瘍病菌菌株和1株番茄潰瘍病菌菌株純菌液(細菌濃度 為107CfU/mL)各ImL置於離心管中，然後在每個離心管內加入50yL番茄潰瘍病菌特異性 免疫磁珠(磁珠量約為106/mL)，在搖床上室溫搖動2h，轉速為150rpm。然後將檢測樣品置 於磁體上靜置5min，待磁珠被收集到管壁的一側時，用移液器小心吸去檢測樣品，然後再用 PBST洗滌離心管3次，每次2min，在磁體上靜置5min，然後棄去洗液。將富集病菌後的免 疫磁珠重懸於50 μ L去離子水中，離心混勻後再轉移到PCR管內，然後放於PCR儀中，99°C 熱裂解15min，然後迅速轉移到冰上冷卻5min，再5000rpm離心2min，取其上清36. 6 μ L轉 移至另一 PCR 管中，再在該管內加入 IOXPCRbuffer 5μ L,2. 5mM dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L、5 μ M 上遊引物 5' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 『 2μ L，5yM 下遊引物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3『 2 μ L，擴增條件為 94°C 2min，94°C 30s,62. 5°C 45s, 72°C 45、35個循環，然後721延伸71^11，最後41保存。取10 μ L PCR產物在1. 5%瓊脂 糖凝膠中進行電泳分離，在凝膠成像系統下進行拍照並分析。實驗結果如圖3所示，圖中只有1號泳道可見特異性目標條帶，大小約為270bp， 2-7號泳道均未見特異性目標條帶。實驗結果表明，本試劑盒特異性針對番茄潰瘍病菌，而 在參試的其他6株非番茄潰瘍病菌菌株上均未擴增出特異性的目標條帶，說明本試劑盒對 番茄潰瘍病菌具有較高的特異性。實施例7 梯度稀釋番茄潰瘍病菌純菌液直接PCR檢測試驗(見圖4)將標準菌培養12h後，測其吸光值(A6。。J，待A6tltlnm值=0.25_0.3(此時菌液 濃度約為108CfU/mL)，取此菌液2mL依次10倍稀釋到無菌PBS中，並分別標記為10人 10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7，然後取 10_5、10_6、10_7 梯度純菌液各 100 μ L 於培養皿 中進行平板菌落計數。取濃度為ZjXKfjjXlOkfu/mL的梯度純菌液各5μ L於 PCR管中，加入31.6yL去離子水，在PCR儀上99 °C裂解IOmin，然後迅速置於冰上冷 卻 5min，離心後加入 10XPCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚 合酶 0. 4 μ L、5 μ M 上遊引物 5 ' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 『 2 μ L，5 μ M 下遊弓 | 物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3『 2 μ L, PCR反應成分同實施例6，然後再進行PCR擴增。實驗結果如圖4所示，圖中1-4號泳道均可見特異性目標條帶，片段大小約為 270bp，且亮度依次減弱；5-7號泳道未見特異性目標條帶。試驗結果表明，在純菌液中直接 PCR的檢測靈敏度為104cfu/mL。實施例8 梯度稀釋番茄潰瘍病菌純菌液IMS-PCR檢測試驗，見圖5，取番茄潰瘍病菌濃度分別為4. 3X106-4. 3X IO1CfuAiL的梯度稀釋純菌液各ImL 置於離心管中，然後在每個離心管內加入50 μ L番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠(磁珠量約 為IO6個/mL)，在搖床上室溫搖動2h，轉速為150rpm。然後將檢測樣品置於磁力架上靜置 5min，待磁珠被收集到管壁的一側時，用移液器小心吸去檢測樣品，然後再用PBST洗滌離 心管3次，每次2min，在磁力架上靜置5min，然後棄去洗液。將富集病菌後的免疫磁珠重 懸於50 μ L去離子水中，離心混勻後再轉移到PCR管內，將PCR管放於PCR儀中，99°C熱裂 解15min，然後迅速轉移到冰上冷卻5min，再5000rpm離心2min，取其上清36. 6 μ L轉移 至另一 PCR 管中，再在該管內加入 10XPCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTPs 4μ L,5U/y L TaqDNA 聚合酶 0. 4 μ L、5 μ M 上遊引物 5 『 -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 『 2 μ L，5 μ M 下遊弓丨 物 5' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3『 2 μ L，擴增條件為 94°C 2min ；94°C 30s,62. 5°C 45s, 72°C 45s，35個循環；72°C 7min，4°C保存。取10 μ L PCR產物在1. 5%瓊脂糖凝膠中進行電 泳分離，在凝膠成像系統下進行拍照並分析。實驗結果如圖5所示，圖中1-5號泳道均可見特異性目標條帶，大小約為270bp，且 條帶亮度依次減弱，而6號泳道未見特異性目標條帶。實驗結果表明，本試劑盒在梯度稀釋 的純菌液中可以檢出濃度為IO2CfuAiL的番茄潰瘍病菌，具有較高的檢測靈敏度。實施例9 梯度稀釋模擬帶菌種子提取液直接PCR試驗，見圖6稱取50g經檢測不帶番茄潰瘍病菌的種子放於研缽內，用缽杵將番茄種子在研缽 內研碎後，加入200mL普通種子病原提取液，將種子病原提取液及種子碎片全部轉移至錐 形瓶中4°C冰箱過夜，次日取出經抽提病原後的病原提取液，取其上清分裝到小錐形瓶中。 然後取經過計數後的上一梯度純菌液2mL依次10倍稀釋到種子病原提取液中，並分別標記 為 10人 10_2、ΙΟ—3、10人 1(Γ5、ΙΟ—6、1(Γ7。取番茄潰瘍病菌濃度為 2. 4X 107_2· 4X IO1CfuAiL 的 模擬帶菌種子提取液各5 μ L於PCR管中，再加入31. 6 μ L去離子水，在PCR儀中99°C裂解 lOmin，其餘方法同實施例6。實驗結果如圖6所示，圖中只有1、2號泳道可見較淡的特異性目標條帶，大小約為 270bp，其餘泳道均未見到明顯目標條帶。試驗表明直接PCR在模擬帶菌種子提取液中的檢 測靈敏度僅為106cfu/mL。實施例10 梯度稀釋模擬帶菌種子提取液IMS-PCR試驗，見圖7取4. 3 X 106-4. 3 X IO1CfuZmL梯度稀釋模擬帶菌種子液各ImL置於離心管 中，然後在每個離心管內加入50 μ L番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠，在搖床上室溫搖 動2h，轉速為150rpm，然後將檢測樣品置於磁體上靜置5min，待磁珠被收集到管壁的 一側時，用移液器小心吸去檢測樣品，然後再用PBST洗滌離心管3次，每次2min，在磁 體上靜置5min，然後棄去洗液。將富集病菌後的免疫磁珠重懸於50μ L去離子水中， 離心混勻後再轉移到PCR管內，將PCR管放於PCR儀中，99 °C熱裂解15min，然後迅速 轉移到冰上冷卻5min，再5000rpm離心2min，取其上清36. 6 μ L轉移至另一 PCR管 中，再在該管內加入 IOXPCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合 酶 0. 4 μ L、5 μ M 上遊引物 5 ' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 『 2 μ L，5 μ M 下遊弓| 物 5 『 -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 『 2 μ L,其餘步驟同實施例 6。實驗結果如圖7所示，圖中可見1-5號泳道均可見特異性目標條帶，大小約為 270bp，且條帶亮度依次減弱，6號泳道未見特異性目標條帶。實驗結果表明，本試劑盒在模 擬帶菌種子提取液中的檢測靈敏度為102cfu/mL，比傳統的ELISA檢測試劑盒的檢測靈敏度 高IO4倍。實施例11 自然感染番茄潰瘍病菌的出口種子檢測試驗，見圖8 選取5批可能自然感染番茄潰瘍病菌的出口番茄種子，各稱量2g置於研缽中用棒 杵研磨至種皮破裂，加入8mL普通病原抽提緩衝液，然後將病原抽提緩衝液和種子碎片一 同轉移到IOmL離心管中，混勻。此時，抽提緩衝液與種皮的內外層充分接觸，室溫靜置Ih 或4°C過夜對種皮上的病原進行抽提，則種子上攜帶的植物病原大部分被抽提到緩衝液的 上清部分中。然後再取上清部分ImL置於離心管中，在每個離心管內加入50 μ L番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠，在搖床上室溫搖動2h，轉速為150rpm。然後將檢測樣品置於磁體上 靜置5min，待磁珠被收集到管壁的一側時，用移液器小心吸去檢測樣品，然後再用PBST洗 滌離心管3次，每次2min，在磁體上靜置5min，然後棄去洗液。將富集病菌後的免疫磁珠 重懸於50 μ L去離子水中，離心混勻後再轉移到PCR管內，將PCR管放於PCR儀中，99°C熱 裂解15min，然後迅速轉移到冰上冷卻5min，再5000rpm離心2min，取其上清36. 6 μ L轉移 至另一 PCR 管中，再在該管內加入 10XPCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L、5 μ M 上遊引物 5' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 『 2μ L，5yM 下遊弓丨物 5 『 -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 『 2 μ L,其餘步驟同實施例 6。實驗結果如圖8所示，圖中可見1-5號泳道可見特異性目標條帶，大小約為270bp， 其中2、3號泳道條帶較亮，1、4、5泳道條帶較淡。實驗結果表明，在可能自然感染番茄潰瘍 病菌的5批出口番茄種子中均能擴增出特異性的目標條帶，而採用ELISA方法時從同樣的5 批種子中只有2批檢測為陽性。同時試驗表明，本試劑盒在實際的種子病原檢測中具有較 高的實用價值，能直接對帶菌番茄種子進行檢測，具有較大的推廣應用基礎以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和 原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
1權利要求
一種番茄潰瘍病菌快速IMS PCR檢測試劑盒，其特徵是包括有10×PCRBuffer 1管，2.5mM dNTPs 1管，5U Taq DNA聚合酶1管，5μM上遊引物5′ TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC 3′200μL，5μM下遊引物5′ TACTGAGATGTTTCACTTCCCC 3′200μL，去離子水1管，PBST洗液1管，番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠1管，體積為2～5mm×2～5mm×2～5mm的普通磁體1塊，陽性對照1管。
2.一種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒的使用方法，其特徵是步驟為(1)病菌富集取檢測樣品lmL置於離心管中，然後在每個離心管內加入50y L番茄潰 瘍病菌特異性免疫磁珠，磁珠量為105_106個/mL，在搖床上室溫搖動2h，轉速為150rpm，然 後將檢測樣品置於磁體上靜置5min，待磁珠被收集到管壁的一側時，用移液器小心吸去檢 測樣品，然後再用PBST洗滌離心管3次，每次2min，在磁體上靜置5min，然後棄去洗液；(2)PCR擴增將富集病菌後的免疫磁珠重懸於5 0 y L去離子水中，離心混勻 後再轉移到PCR管內，然後放於PCR儀中，99°C熱裂解15min，然後迅速轉移到冰上 冷卻5min，再5000rpm離心2min，取其上清36. 6 y L轉移至另一 PCR管中，再在該 管內加入再加入 10XPCR buffer 5u L,2. 5mM dNTPs4 u L.5U/u L Taq DNA 聚合 酶 0. 4 ii L、5 ii M 上遊引物 5 ' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3 『 2 ii L，5 ii M 下遊弓 | 物 5 ' -TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3 『 2 u L,擴增條件為 94 °C 2min ；94°C 30s, 62. 5 °C 45s, 72°C 45s，35個循環，然後72°C延伸7min，最後4。C保存，陽性樣品可擴增出大小為270bp的 特異性目標片段。
3.一種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒特異性免疫磁珠的製備方法，其特徵是 步驟為(1)將N-羥基琥珀醯亞胺生物素溶於二甲基甲醯胺中，調整生物素濃度為50yg/mL ；(2)測定抗體的濃度，並用pH為9.6的碳酸鹽緩衝液將抗體稀釋到10 u g/mL ；(3)按生物素與抗體的質量比為1 10的比例混合，室溫振蕩反應4h;(4)將透析分子量為8000-14000的透析膜剪成長度為5-lOcm的小段，然後在500mL 2 %的NaHC03和lmmol/L pH為8. 0的Na2EDTA 2H20中將透析膜煮沸lOmin,再用去離子 水徹底清洗透析膜，然後放於lmmol/L Na2EDTA -2H20中將之煮沸lOmin，冷卻後放於4°C冰 箱，確保透析膜始終浸沒在溶液內，最後用去離子水將透析膜內外衝洗乾淨，結紮透析膜的 一端後將生物素化的抗體移入透析袋中，然後再結紮透析袋的另一端，放於250mL PBS中透 析過夜，期間更換緩衝液2次；(5)將鏈黴親和素磁珠用碳酸鹽緩衝液洗滌3次，每次2min，然後在磁體上靜置5min， 棄去鏈黴親和素磁珠保存液，鏈黴親和素磁珠保存液為PH7. 4,0. 1%BSA和0. 02 % NaN3的 溶液；然後將鏈黴親和素磁珠重懸於相同體積的碳酸鹽緩衝液中；(6)將經過透析後的生物素化抗體全部轉移至鏈黴親和素磁珠儲存管內，在振蕩器上 室溫振蕩2h，讓鏈黴親和素和生物素充分反應；(7)將連接抗體後的磁珠在磁體上靜置5min，去除未結合到鏈黴親和素磁珠上的過量 抗體，然後用PBST洗滌3次，每次2min，最後將連接抗化後的磁珠重懸於碳酸鹽緩衝液中， 從而製備出番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠。
4.一種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒植物病原抽提方法，其特徵是步驟為(1)植物樣品病原抽提按照種子重量與病原提取液為1 4的比例(g/mL)，稱取2g番茄種子，置於研缽中用棒杵研磨至種皮破裂，加入8mL普通病原抽提緩衝液，然後將病原 抽提緩衝液和種子碎片一同轉移到10mL離心管中，混勻，此時，抽提緩衝液與種子的種皮 內外層充分接觸，室溫靜置lh或4°C過夜後，則種子上攜帶的植物病原的多數位於抽提緩 衝液的上清部分中；(2)抽提緩衝液配方為硫酸鈉0. 13g/mL，聚乙烯吡咯烷酮2g/mL，疊氮化鈉0. 02g/mL, 吐溫-200. 5ml/L,調 pH 值至 7. 4。
5. 一種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒模板DNA快速獲取方法，其特徵是步驟為取檢測樣品lmL置於離心管中，然後在每個離心管內加入50 y L番茄潰瘍病菌特異性 免疫磁珠，在搖床上室溫搖動2h，然後將檢測樣品置於磁體上靜置5min，待磁珠被收集到 管壁的一側時，用移液器小心吸去檢測樣品，然後再用PBST洗滌離心管3次，每次2min，在 磁體上靜置5min，然後棄去洗液，將富集病菌後的免疫磁珠重懸於50 y L去離子水中，離心 混勻後再轉移到PCR管內，將PCR管放於PCR儀中，99°C裂解15min，然後迅速轉移到冰上冷 卻5min，再5000rpm離心2min，則其上清部分即為可用於PCR擴增的DNA。
全文摘要
本發明涉及一種在番茄潰瘍病菌基因水平上快速檢測的試劑盒，屬於植物檢疫和植物保護領域，專一針對番茄潰瘍病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm)的檢測。本試劑盒適用於番茄潰瘍病的田間預防和出入境植物檢疫及植物保護中番茄潰瘍病菌的快速檢測。一種番茄潰瘍病菌快速IMS-PCR檢測試劑盒，其主要特點是包括有10×PCR Buffer 1管，2.5mm dNTPs 1管，5U Taq DNA聚合酶1管，5μm上遊引物5′-TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3′200μl，5μm下遊引物5′-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3′200μl，去離子水1管，PBST洗液1管，番茄潰瘍病菌特異性免疫磁珠1管，普通磁體1塊，陽性對照1管。
文檔編號C12Q1/68GK101948916SQ20101026627
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月29日 優先權日2010年8月29日
發明者劉箐, 閔現華 申請人:甘肅出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心