帶奇偶校驗的信號組合編碼dna連接測序方法
2024-04-01 08:35:05
專利名稱：：帶奇偶校驗的信號組合編碼dna連接測序方法
技術領域：
：本發明帶奇偶校驗的信號組合編碼DNA連接測序方法涉及一種採用信號組合編碼的DNA連接測序方法，並結合奇偶校驗方案，是一種實現DNA序列分析的方法，屬於生物
技術領域：
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背景技術：
：隨著基因組研究的深入，特別是人類基因組計劃和各種模式生物基因組計劃的完成，生物學研究和醫學研究方式產生了巨大變革。從基因水平上認識生命的差異，疾病發生、發展的規律，藥物與生命體的相互作用，不同物種之間的遺傳差異以及同一物種內部不同個體間的遺傳差異成為可能。儘管導致疾病發生的因素眾多，但基因序列差異(包括單核苷酸多態性、DNA甲基化等)被廣泛認為是一個重要的內在因素。多數複雜疾病發生和發展，如癌症、糖尿病、心血管疾病、精神疾病等，是眾多基因和環境共同作用的結果。通過對某一特定疾病大量基因組樣本中基因突變的大規模檢測及與非患病對照基因組樣本的比對，即可獲得與該疾病有關的基因型信息，通過隨後對藥物敏感基因突變位點的篩查，可以獲得對臨床治療與用藥具有指導性意義的信息。無論是親緣關係較近的物種之間遺傳差異，還是同一物種內部不同個體之間的遺傳差異，都主要是以基因序列差異的形式體現出來。因此，如何快速的篩査基因組中的基因序列差異成為後基因組時代的主要課題之一。現有的基因序列差異的檢測方法主要為傳統SangerDNA測序法、限制性酶切長度多態性、單鏈構象多態性和基於基因晶片的寡核苷酸探針雜交法等。在這些方法中，僅有傳統的SangerDNA測序法能完成對目標片段的全方位序列測定，其餘方法均只能確定很少的一部分序列信息。但傳統的SangerDNA測序法存在通量低、成本高、耗時長等不足。第一個人類基因組序列測定的費用大約為IO億美元。儘管這一費用目前己經降低到2000萬美元，但依然是制約功能基因組研究的瓶頸，大幅度降低DNA測序的成本將會大大推動生命科學的發展。為此，美國Venter基金會在2003年提出了1000美元人類全基因組測序的研究目標。2004年初，美國國立衛生院投入4千多萬美元支持DNA測序新技術的研究計劃，累計已經超過1億美元。其目標是發展10萬美元的人類全基因組DNA測序技術，並最終減低為1000美元。目前，除對現有的基於電泳的測序技術的改進外，正在研發的測序技術總體上可以分為四類。第一類是延伸測序法，將信號標記的鹼基加入到正在發生聚合反應的DNA鏈中進行檢測，第二類是連接測序法，將信號標記的寡核苷酸片段加入到正在發生連接反應的DNA鏈中進行檢測；第三類是雜交測序法，通過製備一組高密度寡核苷酸微陣列晶片的雜交信號，進行目標基因的序列鑑定；第四類是分子影像等一系列可以在單分子的水平上進行測序的技術；最後一類技術是誘導DNA分子蜿蜒通過非常細微的小孔，在這個過程中藉助電子學或者光學的方法對鹼基進行讀出，也成為納米孔道測序技術。目前只有延伸測序方法和連接測序方法用於全基因組測序，並且開發出了商品化的儀器和試劑，大大提高了DNA測序的效率，大幅度降低了DNA測序的成本。然而，目前新一代的DNA測序在測序成本、通量和速度等方面仍然不能滿足生命科學研究的需要。主要原因之一是在檢測核酸的信號標記方法單一、效率不高。例如，在DNA連接測序方法中，受標記物(如螢光基團)種類的限制，每次連接反應一般僅能確定一個鹼基的信息，如需在一次連接反應確定兩個及兩個以上鹼基信息，則需要對標記物進行二維或多維編碼。然而現有編碼方法對多種標記物都"無信號"的狀態和未成功發生連接反應的"空信號"之間無法有效分辨，測序反應的存在一定的錯誤率。
發明內容本發明的目的就是針對現有DNA的連接測序技術在檢測核酸的信號標記方法單一、效率不高，試圖通過不同標記物狀態的組合進行二維的編碼，合成信號編碼的DNA測序探針，並通過奇偶校驗標記物的引入，分辨"無信號"和"空信號"，提高連接測序編碼方案的準確率，實現使用相同數量的標記物檢測較多鹼基或鹼基組合的目的，建立快速、準確、低成本和高通量的序列測定方法。DNA連接測序屬於一種DNA合成測序方法。DNA連接測序的基本步驟是首先在待測的DNA模板上雜交一條與特定區域互補配對的測序引物；接著向含有待測模板和測序引物的反應器中加入一種或一組寡核苷酸測序探針，每個寡核苷酸探針由三部分組成簡併鹼基或非嚴格配對鹼基、標記物和測序鹼基；簡併鹼基或非嚴格配對鹼基是一組非特異性的可與測序模板雜交的鹼基組合，標記物用於標記寡核苷酸探針，便於在發生DNA連接反應後進行檢測；測序鹼基是一個和多個確定的鹼基，用於使得測序探針有選擇性地與部分測序模板-測序引物複合物發生連接反應，發生反應的測序模板的相應鹼基與測序探針的測序鹼基互補配對，同時，測序鹼基與標記物存在某種對應關係；在進行了DNA連接測序反應後，利用相應的檢測手段對測序模板-引物-探針複合物進行檢測，獲得對應的信號信息，再利用預先設定的測序鹼基和標記物的對應關係判讀測序模板中相應位置的鹼基信息。當完成一次連接測序反應後，移除測序模板-引物-探針複合物上的標記物，以測序探針作為新的連接起點進行下一次的連接測序反應，連續進行連接反應直至完成所需測序長度。5測序引物與待測模板變性分離，隨後在待測模板上雜交與第一條引物序列平移一個和多個鹼基的測序引物，進行新一輪多次連接反應；完成後重複變性、雜交、連接過程直至所有位置的鹼基信息均完成測定。本發明技術方案帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特徵在於針對某一種特定的DNA測序探針，利用一組編碼標記物和一種信號編碼標記物狀態的組合進行標記，對於一批DNA測序探針，採用一組編碼標記物狀態結合信號編碼標記物的不同組合方案進行標記，製備一套帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA測序探針，從而實現在檢測時對不同DNA測序探針的區分和鑑別A—套帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA測序探針的製備首先製備未標記的DNA測序探針，每一種未標記的DNA測序探針由一個或多個測序鹼基、一個或多個簡併鹼基N或非嚴格配對鹼基組成。測序鹼基用於通過鹼基互補配對法則測定待測DNA中相應位置的鹼基信息，簡併鹼基N為A、T、C、G四種鹼基中的任意一個。完成未標記的DNA測序探針的製備後，針對每一種未標記的DNA測序探針，採用多種編碼標記物狀態的一種組合進行標記，每種編碼標記物在該DNA測序探針上標記與否由該編碼標記物在狀態的組合中所對應的狀態決定，同時結合奇偶校驗標記物，當標記的編碼標記物個數為奇數個時，則不標記奇偶校驗標記物，當標記的編碼標記物為偶數個時，則標記奇偶校驗標記物。採用不同的狀態組合方案並結合奇偶校驗標記物對不同的未標記DNA測序探針進行標記，完成一套帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA測序探針的製備。B利用上述一套帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA測序探針的測序流程如下a.選取一條測序引物與待測的DNA模板依據鹼基互補配對原理進行雜交；b.向反應體系中加入上述的一套帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA測序探針和DNA連接酶及其反應體系，進行DNA連接反應；c.完成DNA連接反應後，檢測全部參與狀態組合的標記物及奇偶校驗標記物的信號，判讀編碼標記物信號所處的狀態，計算獲得信號的編碼標記物的數量，並利用奇偶校驗標記物的信號對該數值進行奇偶校驗，如校驗通過，根據全部編碼標記物狀態的組合情況，確定發生連接反應的DNA測序探針的種類，從而確定該測序探針上測序鹼基的類型和排布，並最終確定被測DNA模板上對應位置的鹼基或鹼基序列信息；d.完成對標記物信號的檢測後，移除DNA測序探針上的標記物；e.重複上述步驟b-d直至DNA測序探針達到或超出待測DNA模板待測區域末端；f.該測序引物與待測DNA模板變性分離，選取第二條測序引物；g.重複上述步驟a-f,直至全部未知DNA模板的待測區域的全部序列信息得以確定。所述的多種標記物對未標記DNA測序探針進行組合標記，其方案是對同一DNA測序探針分子同時標記一種或多種標記物，或者分別用不同的標記物標記同一種DNA測序探針的不同分子，隨後將上述不同測序探針分子混合。所述的測序引物是指一組只能和所有DNA模板的一段通用序列雜交的寡核苷酸片段，一組測序引物在DNA模板上雜交區域彼此相差一個或數個鹼基，能夠在數輪測序反應中完成對DNA模板全長的測序工作；測序模板上的通用序列，是在測序模板製備過程中通過連接反應加入，或者在擴增過程中通過引物引入。所述的DNA模板是通過對待測的DNA片段通過DNA擴增技術增加基因組中感興趣的目的片段的量，擴增是單重的，即一次擴增一個目的片段，或者是多重的，即一次擴增多個目的片段；所述的待測的DNA模板中的固定是通過化學或者物理方法固定於平面片基上，或固定於"96孔板"、"384孔板"及各種修飾的珠子載體上。所述的連接反應，可以是自測序引物開始5'末端向3'末端的連接反應，也可以是3'末端向5'末端的連接反應。所述的標記物，是採用的螢光基團，或利用測序探針化學的、物理的性質的改變，如電阻變化、電流變化。所述的檢測是指與所述的標記物性質相適應的，在雷射激發的螢光標記基團時，雷射激發強度可為95%、70%、45%等多個不同強度，光電倍增可以分別為95%、70%、45%等多個檢測區間。所述的標記物的移除，是標記基團通過化學的、物理的方法與DNA測序探針分離，或者DNA測序探針化學的、物理的性質恢復原有狀態。標記物的移除，是僅僅移除標記物本身，或者同時移除與標記物相連或不相連的一個或多個鹼基及相關基團。所述的第二條測序引物是一組測序引物中除已經使用的測序引物中的任何一條，並不一定是與已使用的測序引物對應在測序模板上雜交位置最為接近的一條。技術原理本發明的目的是提供一種帶奇偶驗證信號編碼的DNA連接測序方法，在一次連接反應中同時檢測多個鹼基，並通過奇偶校驗標記物的引入，提高實驗的準確率。該方法的原理是根據連接測序反應中信號編碼標記物的奇偶數決定是否想連接測序反應中條件奇偶校驗標記物，並通過在檢測時奇偶校驗標記物的狀態校驗信號編碼標記物的實現對無信號狀態和為成功發生連接反應的分辨，提高信號編碼循環連接的DNA測序方法的可靠性。本發明的目的是提供一種帶背景驗證信號組合編碼的DNA連接測序方法，在一次連接反7應中同吋檢測多個鹼基，並通過背景標記物的引入，降低測序反應的錯誤率。該方法的原理是通過向連接測序反應中添加特定的背景驗證標記物，有效分辨"無信號"未成功連接兩種狀態，提高信號組合編碼的連接測序反應的準確率。信號組合編碼的連接測序方法利用不同標記物在被檢測信號的有無(二維)和強度差異(多維)進行二進位編碼或多進位編碼。這裡我們以信號的有無為例，當標記物為兩種時，通過兩種標記物"有信號"和"無信號"排列組合，共得到22=4種複合狀態，即"標記物1有信號、標記物2有信號"、"標記物l有信號、標記物2無信號"、"標記物l無信號、標記物2有信號"、"標記物1無信號、標記物2無信號"。當標記物數量為n時(n為大於等於2的整數)，記錄標記物複合狀態為全部n位二進位數，二進位數的每一位記錄1種標記物的被檢狀態，"1"為檢測到信號，"0"為未檢測到信號，全部2"個n位二進位數與n個信號標記物的2。種複合狀態一一對應。由於構成DNA的常見鹼基共有4種，分別為腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)，因此需要準確檢測一個鹼基的4種類型需要兩種標記物"有信號"和"無信號"的4種複合狀態；2個鹼基組成的鹼基組合共有4X4=16種類型，需要4種標記物共24=16種複合狀態來檢測依此類推，n個(n為大於等於2的整數)鹼基組成的鹼基組合共需要2n種標記物共22"種複合信號狀態來檢測，每種複合狀態通過一個位二進位數來唯一表示，並與測序探針的類型一一對應。然而，單純的信號組合編碼的連接測序方法存在如下問題當待測鹼基或鹼基組合對應的互補測序探針沒有與之對應的修飾標記物時，由於加入反應體系中的測序探針均不含修飾標E物，因此通過檢測全部標記物後我們得到一組全為"無信號"的信號組合；同時，當加入反應體系的測序探針因為連接反應失敗等或其他原因導致測序反應失敗，通過檢測我們同樣可以獲得一組全為"無信號"的信號組合。此時一組全為"無信號"的信號組合對應了兩種可能，傳統組合編碼的測序方法無法有效分辨這兩種可能，因而測序過程存在一定的錯誤率。同時，連接測序屬於一種生物化學反應，其本身也存在一定的錯誤率。本發明，在現有信號編碼的基礎上增加了一種標記物作為奇偶校驗標記物(見表l),參與測序探針的修飾。奇偶校驗標記物和測序探針類型的組合按照如下規則進行當一種測序探針類型同時由O種或偶數種編碼標記物組合時，則增加奇偶校驗標記物對該測序探針類型的修飾；當一種測序探針類型同時由奇數種編碼標記物組合時，則不增加奇偶校驗標記物對該測序探針類型的修飾；奇偶校驗標記物的主要作用是1,驗證測序反應後編碼標記物"有信號"個數的奇偶數數量是否正確，以提高測序的準確性；2，分辨測序反應後全部編碼標記物"無信號"的狀態和連接反應失敗的狀態。表1帶奇偶校驗的編碼方法2n種標記物22"種複合狀態檢測n個鹼基寡核苷酸配方列表(表中"1"表示探針混合物含有該寡核苷酸，"0"表示探針混合物不含該寡核苷酸探針)tableseeoriginaldocumentpage9本發明的有益效果:1.本發明最大的優點通過奇偶校驗標記物的引入，對信號編碼標記物的狀態進行奇偶校驗，在有效分辨編碼標記物全為"無信號"和未成功發生連接反應兩種情況的同時，提高測序反應的準確率，使得信號編碼的循環連接測序法更加具有實用性。通過的編碼標記物的組合信號編碼，實現在一次連接反應中同時檢測較多鹼基或鹼基組合。2.由於在單次連接反應中檢測多個鹼基的類別所需的標記物種類與傳統方法相比呈現指數型的下降，使得在單次連接反應中同時檢測多個鹼基的類別成為可能，成倍縮短了對全部序列測定所需的時間。3.通過信號組合編碼，檢測相同長度的序列所需的連接反應次數的減少，測序的成本也成倍降低。同時，通過信號組合編碼，檢測相同數量的鹼基類型所需的標記物種類大幅降低，降低了對檢測標記物設備的需求，從而降低成本。以下結合附圖對本發明進行進一步說明。圖1是當標記物狀態為二維時，即信號的"有"或"無"時，通過兩種標記物的二維狀態組合檢測在一次連接測序反應中A、T、C、G四種鹼基的原理圖，圖中實心圖標表示"有信號"，空心圖標表示"無信號"。1，當待測鹼基為A時，由測序鹼基為U的測序探針所對應的編碼標記物的組合狀態為"標記物I有信號，標記物2有信號"，即"l，1"，隨後獲得奇偶校驗標記物(圖中方塊，實心為有信號，空心為無信號)信號為"有信號"，即"1"，根據預設就校驗原理，編碼標記物狀態有兩個I,為偶數，對應的奇偶校驗標記物應為1,與實際奇偶校驗標記物狀態相符；當待測鹼基為C時，由測序鹼基為G的測序探針所對應的編碼標記物的組合狀態為"標記物l有信號，標記物2無信號"，即"1,0"，隨後獲得奇偶校驗標記物(圖中方塊，實心為有信號，空心為無信號)信號為"無信號"，即"0"，根據預設就校驗原理，編碼標記物狀態有l個l，為奇數，對應的奇偶校驗標記物應為0，與實際奇偶校驗標記物狀態相符；當待測鹼基為G時，由測序鹼基為U的測序探針所對應的編碼標記物的組合狀態為"標記物1無信號，標記物2有信號"，即"0，1",隨後獲得奇偶校驗標記物(圖中方塊，實心為有信號，空心為無信號)信號為"無信號"，即"0"，根據預設就校驗原理，編碼標記物狀態有l個l,為奇數，對應的奇偶校驗標記物應為0，與實際奇偶校驗標記物狀態相符；當待測鹼基為T時，由測序鹼基為A的測序探針所對應的編碼標記物的組合狀態為"標記物l無信號，標記物2無信號"，即"0，0"，隨後獲得奇偶校驗標記物(圖中方塊，實心為有信號，空心為無信號)信號為"有信號"，即"1"，根據預設就校驗原理，編碼標記物狀態有0個1，為0，對應的奇偶校驗標記物應為1，與實際奇偶校驗標記物狀態相符。圖2是實例2和實例3的工作流程圖。1,將P1、P2引物擴增後的PCR產物固定於玻片表面；2，第一條測序引物Il與固定於玻片表面的PCR產物雜交；3,測序引物I1上連接了測序鹼基與PCR待測位置互補的寡核苷酸探針；4，完成檢測後移除螢光修飾基團5,II連接進行第二次測序探針的連接；6，完成檢測後再次移除螢光修飾基團；7，11完成全部4次連接反應；8,測序引物II與PCR產物變性分離；9,第二條測序引物12與PCR產物雜交開始新一輪測序反應。圖3是實例2測序引物II進行前兩次測序連接反應的詳細圖解。1，測序引物II與固定於玻片表面的PCR產物雜交，II的全部15個鹼基與PCR引物P2互補鏈5'端15個鹼基互補配對；2,進行第一次連接反應，40種寡核苷酸探針(32種編碼寡核苷酸探針，8種奇偶校驗寡核苷酸探針)組成的混合物中測序鹼基為"5'-AA-3'"的寡核苷酸單體(寡核苷酸探針其餘位置為簡併鹼基N)與雜交於PCR產物上的II連接，通過檢測全部標記物僅獲得CY7的信號，編碼標記物狀態為全部"無信號"，奇偶校驗標記物為"有信號"，符合預先設定的奇偶校驗規則，奇偶校驗通過。査寡核苷酸探針配方表得知當編碼標記物均為"無信號"時待測DNA的3'末端第3、4號鹼基為"5'-AA-3'";3,移除寡核苷酸探針末端的螢光修飾基團；4，進行第二次連接，檢測待測DNA的3'末端第11、12號鹼基。具體實施方案本發明的實施方法分為兩種第一種是針對某一種測序探針，選用若干種編碼標記物和一種奇偶校驗標記物同時對同一測序探針分子進行標記。針對一次連接反應，各個標記物在被檢測時分別呈現"有信號"、"無信號"的兩種狀態，由向測序連接反應體系中加入的特定測序探針決定，製備含有不同編碼標記物和背景標記物的測序探針是本發明的關鍵。加入反應體系中的測序探針由一組標記了不同標記物的寡核苷酸探針組成。每個寡核苷酸探針由一個或多個測序鹼基(通過鹼基互補配對法則測定待測DNA中相應位置的鹼基信息)、一個或多個簡併鹼基N(N為A、T、C、G四種鹼基中的任意一個)或非嚴格配對鹼基(如次黃嘌呤等)和一種具有被檢測能力的標記物構成。測序鹼基與標記物之間的組合按照表1所列狀態製備，當表1中所確定的"測序探針類型i"對應k種標記物的狀態為"1"時，則在製備測序鹼基為"鹼基組合類型i"的測序探針分子時，同時標記表格中"測序探針類型i"所有狀態為"1"的標記物；逐行合成表1所列全部22"種寡核苷酸探針，該探針混合物即為所需製備的寡核苷酸探針混合物。第二種是將該種測序探針分為若干部分，每一部分分別標記一種標記物(標記物包含編碼標記物和奇偶標記物)。針對一次連接反應，各個標記物在被檢測時分別呈現"有信號"、"無信號"的兩種狀態，由向測序連接反應體系中加入的特定測序探針決定。因此製備含有不同編碼標記物和背景標記物的測序探針是本發明的關鍵。加入反應體系中的測序探針由一組標記了不同標記物的寡核苷酸探針組成。每個寡核苷酸探針由一個或多個測序鹼基(通過鹼基互補配對法則測定待測DNA中相應位置的鹼基信息)、一個或多個簡併鹼基N(N為A、T、C、G四種鹼基中的任意一個)或非嚴格配對鹼基(如次黃嘌呤等)和一種具有被檢測能力的標記物構成。測序鹼基與標記物之間的組合按照表1所列狀態製備.當表1中所確定的"鹼基組合類型i"與"標記物j"所列狀態為"1"時，則製備測序鹼基為"鹼基組合類型i"、標記物為"標記物j"的寡核苷酸探針如所列狀態為"0"時則不合成，合成表l所列全部狀態為"1"的寡核苷酸探針，該探針混合物即為所需製備的寡核苷酸探針混合物。實施例l:帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特徵在於針對某一種特定的DNA測序探針，利用一組編碼標記物和一種信號編碼標記物狀態的組合進行標記，對於一批DNA測序探針，採用一組編碼標記物狀態結合信號編碼標記物的不同組合方案進行標記，製備一套帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA測序探針，從而實現在檢測時對不同DNA測序探針的區分和鑑別A—套帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA測序探針的製備首先製備未標記的DNA測序探針，每一種未標記的DNA測序探針由一個或多個測序鹼基、一個或多個簡併鹼基N或非嚴格配對鹼基組成。測序鹼基用於通過鹼基互補配對法則測定待測DNA中相應位置的鹼基信息，簡併鹼基N為A、T、C、G四種鹼基中的任意一個。完成未標記的DNA測序探針的製備後，針對每一種未標記的DNA測序探針，採用多種編碼標記物狀態的一種組合進行標記，每種編碼標記物在該DNA測序探針上標記與否由該編碼標記物在狀態的組合中所對應的狀態決定，同時結合奇偶校驗標記物，當標記的編碼標記物個數為奇數個時，則不標記奇偶校驗標記物，當標記的編碼標記物為偶數個時，則標記奇偶校驗標記物。採用不同的狀態組合方案並結合奇偶校驗標記物對不同的未標記DNA測序探針進行標記，完成一套帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA測序探針的製備。B利用上述一套帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA測序探針的測序流程如下a.選取一條測序引物與待測的DNA模板依據鹼基互補配對原理進行雜交；b.向反應體系中加入上述的一套帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA測序探針和DNA連接酶及其反應體系，進行DNA連接反應；c.完成DNA連接反應後，檢測全部參與狀態組合的標記物及奇偶校驗標記物的信號，判讀編碼標記物信號所處的狀態，計算獲得信號的編碼標記物的數量，並利用奇偶校驗標記物的信號對該數值進行奇偶校驗，如校驗通過，根據全部編碼標記物狀態的組合情況，確定發生連接反應的DNA測序探針的種類，從而確定該測序探針上測序鹼基的類型和排布，並最終確定被測DNA模板上對應位置的鹼基或鹼基序列信息d.完成對標記物信號的檢測後，移除DNA測序探針上的標記物；e.重複上述步驟b-d直至DNA測序探針達到或超出待測DNA模板待測區域末端；f.該測序引物與待測DNA模板變性分離，選取第二條測序引物g.重複上述步驟a-f，直至全部未知DNA模板的待測區域的全部序列信息得以確定。所述的多種標記物對未標記DNA測序探針進行組合標記，其方案是對同一DNA測序探針分子同時標記一種或多種標記物，或者分別用不同的標記物標記同一種DNA測序探針的不同分子，隨後將上述不同測序探針分子混合。所述的測序引物是指一組只能和所有DNA模板的一段通用序列雜交的寡核苷酸片段，一組測序引物在DNA模板上雜交區域彼此相差一個或數個鹼基，能夠在IS[輪測序反應中完成對DNA模板全長的測序工作；測序模板上的通用序列，是在測序模板製備過程中通過連接反應加入，或者在擴增過程中通過引物引入。所述的DNA模板是通過對待測的DNA片段通過DNA擴增技術增加基因組中感興趣的目的片段的量，擴增是單重的，即一次擴增一個目的片段，或者是多重的，即一次擴增多個目的片段；所述的待測的DNA模板中的固定是通過化學或者物理方法固定於平面片基上，12或固定於"96孔板"、"384孔板"及各種修飾的珠子載體上。所述的連接反應，可以是自測序引物開始5'末端向3'末端的連接反應，也可以是3'末端向5'末端的連接反應。所述的標記物，是採用的螢光基團，或利用測序探針化學的、物理的性質的改變，如電阻變化、電流變化。所述的檢測是指與所述的標記物性質相適應的，在雷射激發的螢光標記基團時，雷射激發強度可為95%、70%、45%等多個不同強度，光電倍增可以分別為95%、70%、45°/。等多個檢測區間。所述的標記物的移除，是標記基團通過化學的、物理的方法與DNA測序探針分離，或者DNA測序探針化學的、物理的性質恢復原有狀態。標記物的移除，是僅僅移除標記物本身，或者同時移除與標記物相連或不相連的一個或多個鹼基及相關基團。所述的第二條測序引物是一組測序引物中除已經使用的測序引物中的任何一條，並不一定是與已使用的測序引物對應在測序模板上雜交位置最為接近的一條。實施例2:帶奇偶校驗的四色螢光複合編碼法(分別標記方案)檢測人類17號染色體上，RP11-354P11克隆上45332-45363共32個鹼基對序列；提取人類全基因組DNA,利用PCR方法擴增目的片段，引物為P1、P2(序列見表2),引物P1的5'末端採用羥基修飾。擴增後的PCR產物固定於醛基修飾的玻片表面後，加熱玻片至95t:使雙鏈PCR產物的一條鏈與固定鏈脫離，隨後開始測序反應。表2實例2中相關寡核苷酸序列信息序列名序列信息待測序列5'-CACGGACCAGCTGCCCTGGACCAGCTGCAAGA-3'Pl0H-5'-CGCTATACTACCTCATCTCCTCCTTCACG-3'P25'-GCAGTTGCCAGTGTTCCAGGAGT-3'115'-CAGTGTTCCAGGAGT-3'125'-GTGTTCCAGGAGTNN-3'135'-GTTCCAGGAGTNNNN-3'145'-GCCAGTGTTCCAGGA-3'向玻片表面加入雜交緩衝液和第一條測序引物Il(序列見表2)，37'C雜交復性20分鐘。向反應池中加入表3所列的全部40種測序探針組成的混合物，其中CY7為奇偶校驗標記物，其餘四種標記物為編碼標記物，由標記物CY7組成的寡核苷酸探針僅出現在相應的測序鹼基對應編碼寡核苷酸探針種類為0種或偶數種時，而測序鹼基對應的編碼寡核苷酸探針為奇數種時，不合成由該測序鹼基和CY7構成的寡核苷酸探針。採用T4核酸連接酶進行連接反應，反應條件為25'C連接30分鐘。連接完成後利用雷射共聚焦顯微鏡對玻片進行掃描，掃描分別採用對應於CY7、CY3、CY5、TXR和FTC的波長進行，根據獲得的螢光信號判讀對應的鹼基信息(附圖2)。表3測序探針混合物詳細列表tableseeoriginaldocumentpage14在第一次連接反應中，II引物與P2互補鏈上的"5'-AAGAACTCCTGGAACACTG-3'"序列雜交，加入寡核苷酸探針混合物後，寡核苷酸探針混合物中測序鹼基如果與待測DNA位於Il引物3'端下遊的第3、4號鹼基(也是待測DNA的3'末端第3、4號鹼基)互補配對，則這些寡核苷酸探針與待測DNA雜交並與引物II發生連接反應。待測DNA位於II引物3'端下遊的第3、4個鹼基為"5'-AA-3'",其反向互補鹼基為"5'-TT-3'"，則所有測序鹼基為"5'-TT-3'"的寡核苷酸探針僅有一條，為"5'-,TTN剛N-3，-CY7"，與待測DNA模板及引物II發生連接反應(附圖3-2)。在進行信號檢測時，首先檢測了編碼標記物的複合狀態類型，為"CY3無信號，CY5無信號，TXR無信號，FTC無信號"，共有0種標記物有信號，同時檢測到奇偶校驗標記物狀態為"有信號"，符合編碼標記物為o種或偶數種標記物"有信號"時，奇偶校驗標記物為"有信號"的奇偶校驗規則，奇偶校驗通過。隨後通過查表得知當編碼標記物狀態均為"無信號"時，待測DNA的3'末端第3、4號鹼基的反向互補鏈信息為"5'-TT-3，"，從而可以獲得待測DNA的3'末端第3、4號鹼基為"5'-AA-3'"。完成次輪檢測後，利用化學方法切除連結與引物I1上寡核苷酸探針3'末端的螢光基團，在3'末端獲得一個游離的羥基進行再次連接反應(附圖3-3)。向反應池中再次加入表3所列全部苷酸探針混合物，進行第二輪連接反應,此次連接反應是檢測待測DNA位於II引物3'端下遊的第11、12號鹼基(待測DNA的3'末端第11、12號鹼基)"5'-CC-3'"，此時三種測序鹼基為"5'13'"的寡核苷酸探針"5'-NNGGNNNN-3，-CY7"、"5，-NNGGN國-3，-CY5"、"5'-NNGG隨NN-3'-FTC"發生連接反應，進行螢光檢測是同時檢測到CY7、CY5、FTC，奇偶校驗標記物驗證成功，隨後査表判讀並進行反向互補獲得待測DNA的3'末端第ll、12號鹼基為"5'-CC-3'"(附圖3-4)。化學方法切除連接上的寡核苷酸末端螢光基團後再次進行II引物的第3、4輪連接反應，分別測得待測DNA的3'末端第19、20號鹼基和第27、28號鹼基信息。完成四輪連接反應後，95'C使測序引物II與待測DNA分離，向玻片表面加入雜交緩衝液和第二條測序引物I2(序列見表2)，37"C雜交復性20分鐘。隨後開始四輪連接反應分別檢測待測DNA的3'末端第5、6號，13、14號，21、22號以及29、30號四組鹼基。同樣的，禾U用測序引物I3檢測待測DNA的3'末端第7、8號，15、16號，23、24號以及31、32號四組鹼基，利用測序引物I4檢測待測DNA的3'末端第1、2號，9、10號，17、18號以及25、26號四組鹼基。通過所獲得序列信息進行拼接即可獲得待測DNA全部32個鹼基的序列信息。實施例3:帶奇偶校驗的四色螢光複合編碼法(共同標記方案)檢測人類17號染色體上，RP11-354P11克隆上45332-45363共32個鹼基對序列表4實例3中相關寡核苷酸序列信息序列名序列信息待測序列5'-CACGGACCAGCTGCCCTGGACCAGCTGCAAGA-3'Pl0H-5'-CGCTATACTACCTCATCTCCTCCTTCACG-3'P25'-GCAGTTGCCAGTGTTCCAGGAGT-3'115'-CAGTGTTCCAGGAGT-3'125，—GTGTTCCAGGAGTNN—3'135'-GTTCCAGGAGTNNNN-3'145'-GCCAGTGTTCCAGGA-3，提取人類全基因組DNA，利用PCR方法擴增目的片段，引物為P1、P2(序列見表4),引15物P1的5'末端採用羥基修飾。擴增後的PCR產物固定於醛基修飾的玻片表面後，加熱玻片至95'C使雙鏈PCR產物的一條鏈與固定鏈脫離，隨後開始測序反應。向玻片表面加入雜交緩衝液和第一條測序引物Il(序列見表4),37'C雜交復性20分鐘。向反應池中加入表5所列的全部16種寡核苷酸探針組成的混合物，表格中每行為一種寡核苷酸探針，其中CY7為奇偶校驗標記物，其餘四種標記物為編碼標記物。每個寡核苷酸探針分子上同時標記了一種或多種的信號標記物，標記物CY7僅參與標記那些已經標記了0種或偶數種信號編碼標記物的測序探針，而測序探針已標記的信號標記物為奇數種時，不標記CY7基團。採用T4核酸連接酶進行連接反應，反應條件為25'C連接30分鐘。連接完成後利用雷射共聚焦顯微鏡對玻片進行掃描，掃描分別採用對應於CY7、CY3、CY5、TXR和FTC的波長進行，根據獲得的螢光信號判讀對應的鹼基信息(附圖2)。在第一次連接反應中，II引物與P2互補鏈上的"5'-AAGAACTCCTGGAACACTG-3，"序列雜交，加入寡核苷酸探針混合物後，寡核苷酸探針混合物中測序鹼基如果與待測DNA位於Il引物3，端下遊的第3、4號鹼基(也是待測DNA的3'末端第3、4號鹼基)互補配對，則這些寡核苷酸探針與待測DMA雜交並與引物II發生連接反應。待測DNA位於II引物3'端下遊的第3、4個鹼基為"5'-AA-3'",其反向互補鹼基為"5'-TT-3'"，測序探針"5'-隨17,，-3'"僅標記了CY7—種螢光基團，與待測DNA模板及引物II發生連接反應。在進行信號檢測時，首先檢測了編碼標記物的複合狀態類型，為"CY3無信號，CY5無信號，TXR無信號，FTC無信號"，共有O種標記物有信號，同時檢測到奇偶校驗標記物狀態為"有信號"，符合編碼標記物為0種或偶數種標記物"有信號"時，奇偶校驗標記物為"有信號"的奇偶校驗規則，奇偶校驗通過。隨後通過査表得知當編碼標記物狀態均為"無信號"時，待測DNA的3'末端第3、4號鹼基的反向互補鏈信息為"5'-TT-3'"，從而可以獲得待測DNA的3'木端第3、4號鹼基為"5'-AA-3'"。完成次輪檢測後，利用化學方法切除連結與引物I1上寡核苷酸探針3'末端的螢光基團，在3'末端獲得一個游離的羥基進行再次連接反應。向反應池中再次加入表5所列全部苷酸探針混合物，進行第二輪連接反應，此次連接反應是檢測待測DNA位於Il引物3'端下遊的第11、12號鹼基(待測D、A的3'末端第11、12號鹼基)"5，-CC-3'"，此時測序探針"5'-NNGGNNNN-3'"上同時標記了CY7、CY5和FTC三種基團。發生連接反應後，進行螢光檢測是同時檢測到CY7、CY5、FTC，奇偶校驗標記物驗證成功，隨後査表判讀並進行反向互補獲得待測DNA的3'末端第11、12號鹼基為"5'-CC-3'"。化學方法切除連接上的寡核苷酸末端螢光基團後再次進行Il引物的第3、4輪連接反應，分別測得待測DNA的3'末端第19、20號鹼基和第27、28號鹼基信息。完成四輪連接反應後，95'C使測序引物I1與待測DNA分離，向玻片表面加入雜交緩衝液和第二條測序引物I2(序列見表4)，37'C雜交復性20分鐘。隨後開始四輪連接反應分別檢測待測DNA的3'末端第5、6號，13、14號，21、22號以及29、30號四組鹼基。表5寡核苷酸探針混合物詳細列表共同修飾基團成分測序鹼基測序探針(從5'末端到3'末端)CY7CY3CY5TXRFTCAANNAANNNN有有有有有ACNNACNNNN無有有有無AGNNAGNNNN無有有無有AT瞧TNNN有有有無無CANNCA薩N無有無有有CCNNCC,N有有無有無CGNNCGN,有有無無有CTNNCTNNNN無有無無無GAN歸,N無無有有有GCNNGC,N有無有有無GGNNGG薩N有無有無有GT跳T國無無有無無TA瞎A國有無無有有TC匿CNNNN無無無有無TG瞎GN醒無無無無有TTNNTT!WNN有無無無無同樣的，利用測序引物I3檢測待測DNA的3'末端第7、8號，15、16號，23、24號以及31、32號四組鹼基，利用測序引物I4檢測待測DNA的3'末端第1、2號，9、10號，17、18號以及25、26號四組鹼基。通過所獲得序列信息進行拼接即可獲得待測DNA全部32個鹼基的序列信息。1權利要求1.一種帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特徵在於針對某一種特定的DNA測序探針，利用一組編碼標記物和一種信號編碼標記物狀態的組合進行標記，對於一批DNA測序探針，採用一組編碼標記物狀態結合信號編碼標記物的不同組合方案進行標記，製備一套帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA測序探針，從而實現在檢測時對不同DNA測序探針的區分和鑑別A一套帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA測序探針的製備首先製備未標記的DNA測序探針，每一種未標記的DNA測序探針由一個或多個測序鹼基、一個或多個簡併鹼基N或非嚴格配對鹼基組成；測序鹼基用於通過鹼基互補配對法則測定待測DNA中相應位置的鹼基信息，簡併鹼基N為A、T、C、G四種鹼基中的任意一個；完成未標記的DNA測序探針的製備後，針對每一種未標記的DNA測序探針，採用多種編碼標記物狀態的一種組合進行標記，每種編碼標記物在該DNA測序探針上標記與否由該編碼標記物在狀態的組合中所對應的狀態決定，同時結合奇偶校驗標記物，當標記的編碼標記物個數為奇數個時，則不標記奇偶校驗標記物，當標記的編碼標記物為偶數個時，則標記奇偶校驗標記物。採用不同的狀態組合方案並結合奇偶校驗標記物對不同的未標記DNA測序探針進行標記，完成一套帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA測序探針的製備；B利用上述一套帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA測序探針的測序流程如下a.選取一條測序引物與待測的DNA模板依據鹼基互補配對原理進行雜交；b.向反應體系中加入上述的一套帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA測序探針和DNA連接酶及其反應體系，進行DNA連接反應；c.完成DNA連接反應後，檢測全部參與狀態組合的標記物及奇偶校驗標記物的信號，判讀編碼標記物信號所處的狀態，計算獲得信號的編碼標記物的數量，並利用奇偶校驗標記物的信號對該數值進行奇偶校驗，如校驗通過，根據全部編碼標記物狀態的組合情況，確定發生連接反應的DNA測序探針的種類，從而確定該測序探針上測序鹼基的類型和排布，並最終確定被測DNA模板上對應位置的鹼基或鹼基序列信息；d.完成對標記物信號的檢測後，移除DNA測序探針上的標記物；e.重複上述步驟b-d直至DNA測序探針達到或超出待測DNA模板待測區域末端；f.該測序引物與待測DNA模板變性分離，選取第二條測序引物；g.重複上述步驟a-f，直至全部未知DNA模板的待測區域的全部序列信息得以確定。2.根據權利要求1所述的帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特徵在於所述的多種標記物對未標記DNA測序探針進行組合標記，其方案是對同一DNA測序探針分子同時標記一種或多種標記物，或者分別用不同的標記物標記同一種DNA測序探針的不同分子，隨後將上述不同測序探針分子混合。3.根據權利要求1所述的帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特徵在於所述的測序引物是指一組只能和所有DNA模板的一段通用序列雜交的寡核苷酸片段，一組測序引物在DNA模板上雜交區域彼此相差一個或數個鹼基，能夠在數輪測序反應中完成對DNA模板全長的測序工作；測序模板上的通用序列，是在測序模板製備過程中通過連接反應加入，或者在擴增過程中通過引物引入。4.根據權利要求1所述的帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特徵在於所述的DNA模板是通過對待測的DNA片段通過DNA擴增技術增加基因組中感興趣的目的片段的量，擴增是單重的，即一次擴增一個目的片段，或者是多重的，即一次擴增多個目的片段；所述的待測的DNA模板中的固定是通過化學或者物理方法固定於平面片基上，或固定於"96孔板"、"384孔板"及各種修飾的珠子載體上。5.根據權利要求1所述的帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特徵在於所述的連接反應，可以是自測序引物開始5'末端向3'末端的連接反應，也可以是3'末端向5'末端的連接反應。6.根據權利要求1所述的帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特徵在於所述的標記物，是採用的螢光基團，或利用測序探針化學的、物理的性質的改變，如電阻變化、電流變化。7.根據權利要求1所述的帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特徵在於所述的標記物的移除，是標記基團通過化學的、物理的方法與DNA測序探針分離，或者DNA測序探針化學的、物理的性質恢復原有狀態；標記物的移除，是僅僅移除標記物本身，或者同時移除與標記物相連或不相連的一個或多個鹼基及相關基團。8.根據權利要求1所述的帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特徵在於所述的第二條測序引物是一組測序引物中除已經使用的測序引物中的任何一條，並不一定是與已使用的測序引物對應在測序模板上雜交位置最為接近的一條。全文摘要本發明帶奇偶校驗的信號組合編碼的DNA連接測序方法涉及一種信號組合編碼的DNA測序方法，屬於生物
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。本發明的特徵在於向信號組合編碼的連接測序的編碼中增加了奇偶校驗，有效地對檢測獲得的編碼結果進行奇偶校驗，並成功分辨全空信號與未發生連接反應兩種情況，提高測序的準確率。本發明在信號組合編碼標記物外增加一種奇偶校驗標記物，利用奇偶校驗標記物「有信號」和「無信號」兩種狀態與所獲得的編碼標記物狀態的「有信號」的標記物的種類進行奇偶校驗，校驗成功後通過不同編碼標記物在被檢測時多個標記物「有信號」、「無信號」的排列組合進行信號組合編碼的連接DNA測序反應，在不降低測序通量的基礎上提高測序反應的準確率。文檔編號C12Q1/68GK101565746SQ20091002689公開日2009年10月28日申請日期2009年6月3日優先權日2009年6月3日發明者孫蓓麗,琦楊,景塗,白雲飛,陸祖宏申請人:東南大學