空間分辨的配體-受體結合試驗的製作方法

2024-04-03 03:22:05

空間分辨的配體-受體結合試驗的製作方法
【專利摘要】一種用於分析配體-受體結合試驗結果的方法，其中避免了傳統的洗滌步驟，所述方法包括：混合其中受體附著於固體載體的試劑、懷疑含有配體的樣品以及包含標記的綴合物形成複合物，其中標記以與樣品中存在的配體量直接成正比的濃度存在或以與樣品中存在的分析物量成反比的濃度存在。在兩種不同類型的照明下提供沉降/固定支持物的數字圖像並數位化減去所述圖像以僅識別結合事件而非反應組分。與標準曲線相比量化這樣產生的圖像強度以便提供分析物的濃度。
【專利說明】空間分辨的配體-受體結合試驗
[0001]本申請要求2011年6月6日提交的美國序列號13/153,934的優先權，其內容通過引用併入本文中。
_2] 發明背景
1.發明領域
本發明涉及樣品中配體(更具體地，特異性結合受體的配體)濃度的測定。
[0003]2.本領域討論
在過去幾十年中，免疫測定使用螢光、化學發光或產生響應於分析物的信號的其他方法來進行。目前，許多免疫測定通過測量反應混合物的總量中產生的光信號的強度來進行。所產生的光信號可通過光學方法來測量，其中所產生的光信號由大量分子發出。在一個典型的實施方案中，這些免疫測定可通過將懷疑含有抗原的樣品與包含附著於固體載體(例如，珠、微粒)的第一抗體的試劑混合以形成反應混合物來實現。所述抗原，如果存在於樣品中，特異性結合第一抗體。綴合物，其包含具有附著於其上的標記的第二抗體，被引入到反應混合物中，並特異性地結合至抗原，該抗原特異性結合第一抗體，如前所述，該第一抗體附著在固體載體上。這種免疫測定被稱為夾心免疫測定或免疫計量試驗。這種類型的免疫測定示意性地示於圖1中。然後將未結合的綴合物從反應混合物中移除(典型地通過洗滌步驟進行)後，測量由標記引起的信號。測量反應混合物的總量所產生的信號，然後與校準曲線對比以確定樣品中存在的抗原的濃度。
[0004]另一種類型的免疫測定被稱為競爭性免疫測定。在一個典型的實施方案中，未標記抗原和標記抗原競爭相同的抗體位點。或者，抗體和標記抗體競爭相同的抗原位點。在前者的實例中，使用標記抗原和未標記抗原。將固體載體用能特異性地結合至標記抗原或未標記抗原的抗體包被。將固體載體、標記抗原和懷疑含有抗原的患者樣品混合。當然，患者樣品中的任何抗原都是未標記的。標記抗原和未標記抗原競爭固體載體上的抗體位點。只有當標記抗原附著於固體載體上的抗體才能產生信號，因為只有標記抗原可以產生信號。患者樣品中的抗原量與信號的產生量成反比。這種類型的免疫測定示意性地示於圖2中。
[0005]在使用不同的光學方法進行免疫測定時，大量參數必須加以考慮。這些參數包括進行免疫測定所需要的時間、進行免疫測定所需要的樣品量、進行免疫測定所需要的其他試劑的量、完成免疫測定所需要的步驟數、免疫測定的靈敏度和免疫測定的動態範圍。該動態範圍通常可以覆蓋三個或更多個數量級。幾十年來，利用磁微粒的免疫測定已顯示可為前面提到的大部分參數提供足夠的值。磁微粒允許結合至綴合物的分析物以簡單的方式與未結合的綴合物和其它試劑分離。磁微粒的另一有吸引力的特性是可以在溶液中容易地控制它們以允許固相上的分析物或綴合物在相對短的時間內結合。通過利用磁性吸引力，可移動和洗滌磁微粒以提供僅結合至磁微粒的分析物的信息。
[0006]使用任何微粒作為固體載體的主要缺點是關於包被在微粒上的抗體的量，微粒與微粒之間缺乏均一性。另一個缺點是綴合物與微粒的不期望的相互作用。這種不期望的相互作用可能會影響免疫測定的結果，因此，可能需要對用於在免疫測定分析儀中使用的由不同製造商製造的大量不同微粒進行廣泛研究。當在反應器中進行免疫測定時，自身存在另一個缺點。綴合物可結合至反應器的表面，這是不希望的。這些缺點不僅限制了免疫測定的靈敏度，也可能對分析物的檢測產生錯誤的結果。
[0007]免疫測定中可能出現的其他問題涉及(a)綴合物與固體載體的非特異性結合和(b)試劑的聚合。這些問題是試驗的開發者所主要關注的。典型地，減少非特異性結合的方法不僅涉及試劑的調整(tailoring)，還涉及以適當的比例將它們混合以提供所需結果。這些方法需要顯著量的反覆試驗(trial and error)，往往會導致使試驗的開發成為漫長的過程，以及使試驗的開發成為實驗性(empirical)過程，結果是從一批到另一批試劑經常變化。此外，綴合物的非特異性結合所產生的信號可能比綴合物與分析物特異性結合所產生的信號更高，從而限制了免疫測定的靈敏度。可僅通過使用不含任何分析物的樣品進行校準來評估實際試驗過程中非特異性結合的影響。
[0008]典型的免疫測定的另一個潛在缺點是進行試驗後，試驗的唯一記錄是信號的值。如果可獲取新的分析方法，沒有機會重新檢查樣品的缺陷或獲取更多的信息。將不僅沒有固相的性質的記錄，也沒有辦法使用新開發的算法來核查記錄的數據。使用歷史數據來提取新信息的能力是不可能的。
[0009]因此，存在開發用於解決當從試驗中同步獲取數據時，在給定試驗中固相的非特異性結合和非期望性能的分析儀器和方法以提高試驗的靈敏度的需求。存在減少試劑的使用並為實驗室設置和即時設置的使用提供足夠的測量時間的需求。原則上，由於試驗正在進行，這種方法也能提供實時質量控制。此外，期望緩解生成新的校準曲線並減少從一批到另一批的試劑的變化的需求。還期望以這種方式保持試驗的記錄，因為這些方法變為可獲取的，故可在稍後的日期通過使用不同方法進行核查。
[0010]新的檢測方法可配備來自納米技術和微流體的新興領域的設備以為生物樣品中分析物的檢測和測量提供更小、更有效和更靈敏的試驗。
[0011]發明概沭
本發明提供一種用於分析配體-受體結合試驗的方法，其包括以下步驟:
(a)使配體-受體結合試驗的至少一個信號合格；和
(b)提供配體-受體結合試驗結果。
[0012]更具體地，該配體-受體結合試驗涉及混合適當的試劑(其中受體附著於固體載體，例如，微粒)、懷疑含有配體(例如，分析物)的樣品和包含標記的綴合物以形成複合物，其中標記以與樣品中存在的配體量直接成正比的濃度存在。綴合物的標記附著於第二受體，所述第二受體不同於附著於固體載體的受體。或者，該配體-受體結合試驗涉及混合適當的試劑進行配體-受體結合試驗，其中附著於固體載體(例如，微粒)的受體、懷疑含有配體(例如，分析物)的樣品與包含標記的綴合物形成複合物，其中標記以與樣品中存在的分析物量成反比的濃度存在。綴合物的標記附著於配體，所述配體與懷疑存在於樣品中的配體是相同的配體。為提高免疫測定的靈敏度，可採用任選的反應步驟和任選的洗滌步驟以減少非特異性結合併清除任何過量的綴合物。另一替代方法是一步均相免疫測定，其不需要分離步驟。
[0013]在一個實施方案中，將在其表面上帶有受體的微粒、懷疑含有分析物(即配體)的樣品以及包含附著於第二受體的標記的綴合物(其中所述第二受體不同於附著於微粒的那些受體)引入到反應器中並使其反應，藉此形成包含發射光信號的標記的複合物。反應器能夠使包含發射光信號的標記的複合物記錄在圖像中。能夠存儲所得到的圖像以供稍後時間使用。在被用作測量分析物的濃度前使來自圖像的光信號合格。該圖像包括大量像素，並以逐個像素(pixel-by-pixel)為基礎使該圖像合格和定量該圖像。
[0014]使合格涉及將分析限制在複合物所在位置的那些圖像部分並測量圖像中複合物所發射的光的強度值。適於使來自圖像中複合物的光信號合格的算法包括以下步驟:
(a)獲取第一螢光圖像以確定複合物中第一綴合物的位置；
(b)在圖像中選擇像素進行分析；
(c)計算並記錄步驟(b)中所選擇的像素的每像素計數的平均值和方差；
(d)省略計數大於或小於方差的指定水平的分析像素；和
(e)計算剩餘像素的每像素計數的平均值。
[0015]從步驟(e)中獲取的數據，可確定樣品中分析物的濃度。
[0016]在任選的步驟中，可獲取反應混合物的白光圖像以確定附著於固體載體的複合物的位置。在另一個任選的步驟中，可獲取第二螢光圖像以確定複合物中第二綴合物的位置。對於確定樣品中分析物濃度，第二螢光圖像可用於增加靈敏度。
[0017]對於夾心免疫測定，附著於固體載體的受體通常被稱為捕獲抗體。附著於標記的第二受體通常被稱為檢測抗體。反應器可以是微孔板的微孔。在典型的夾心免疫測定中，將反應混合物孵育一段規定的時間後，通常洗滌反應混合物以移除任何過量的檢測抗體和其它未結合的物質。然後殘留在反應器中的複合物通過例如配備有數位相機的螢光顯微鏡進行成像。然後確定每像素的光強度的平均值。然後由此確定的值可以用來確定樣品中抗原的濃度。
[0018]對於某些類型的競爭性免疫測定，附著於固體載體的受體也可被視為捕獲抗體。然而，當抗原附著於標記，並且懷疑樣品含有該抗原時，這種特定類型的競爭性免疫測定不具有檢測抗體。反應器可以是微孔板的微孔。在這種特定類型的競爭性免疫測定中，將反應混合物孵育一段規定的時間後，通常洗滌反應混合物以除去過量的標記抗原和殘留在反應混合物中的任何其它物質。然後殘留在反應器內的物質通過例如配備有數位相機的螢光顯微鏡進行成像。然後確定每像素的光強度的平均值。然後所確定的值用於確定樣品中抗原的濃度。如前面所述，可以進行其他類型的免疫測定以提供進行本發明的成像方面所需要的結果。
[0019]在另一個實施方案中，配體可以是核酸的單鏈，例如，DNA、RNA，且受體可以是核酸的互補鏈，例如，DNA、RNA。在該實施方案中，配體-受體結合反應可用於鑑定基因或特定核酸序列的存在，例如，DNA序列、RNA序列。
[0020]用於提供關於上述配體-受體結合試驗的其他信息的替代方法涉及達到或超過至少一種所選標準的微粒或螢光斑點的數量的計數以用於計算強度。這種替代方法能夠為指示試驗的合適性能提供內部控制。原則上，可對試驗與試驗之間的結果進行對比以確保每個試驗可靠，即，足夠靈敏和足夠精確。相對於每像素的強度值，每個微粒的螢光強度平均值可用來確定配體的濃度。這兩個值都應該與校準品的值一致，由此產生可用於確定分析物濃度的兩個統計量度。
[0021]本文所述的方法還能以與保持X射線和組織病理學記錄類似的方式保持試驗的記錄。因為圖像為離線獲取並存儲，即通過計算機數據存儲，其不適於在無人工幹預下經系統要求立即使用，可在稍後的時間採用用於分析的不同程序。該特點的優勢是能夠實現在不同時間取自同一患者的樣品的試驗結果的直接對比。在該方式下，實際樣品及其試驗的信息不會丟失，並且可以在稍後的時間進行共享或核查。
[0022]本文所述的方法通過進行配體-受體結合試驗後生成包含微粒的複合物的螢光圖像，解決了總信號的測量中的固有問題。在本文所述的方法中，從樣品總量所發射的光強度的測量被替換為含有來自樣品的分析物的複合物的圖像分析以提高試驗的靈敏度。通過合併常規配體-受體結合試驗中未包含的空間信息，試劑的聚集和非特異性結合可以從產生的信號中消除，且可使樣品中的分析物合格並同時或隨後進行定量。例如，關於使合格，與固相相關的不期望的人工製品，例如，微粒，可被檢查出並在使用強度信息之前移除。或者，如果期望測量蛋白質的聚集程度，可測量上述聚集相關的空間信息，而不是從生成的信號中移除。例如，澱粉樣蛋白的聚集是阿爾茨海默病的指標。此外，關於定量，本文所述的方法允許省略非特異性結合至反應器的壁上的試劑和綴合物以及在反應混合物中擴散的試劑和綴合物的強度信息。空間信息可用於精確定義應從中測量強度的圖像的區域，以進行精確和準確的配體-受體結合試驗。
[0023]常規試驗需要大量的樣品和大量的試劑以提供足夠的信號。本文所述的方法只需要少量的固體載體材料，例如，僅幾百個包被的微粒，例如，至多約兩百(200)個微粒，或更少。如果新的分析方法變得可用，本文所述的方法能夠對缺陷進行樣品的復檢或獲取更多的信息。 [0024]附圖簡要說明
圖1為闡述夾心免疫測定的示意圖。
[0025]圖2為闡述競爭性免疫測定的示意圖。
[0026]圖3為紅色螢光團標記的捕獲抗體的螢光圖像。
[0027]圖4為附著於微粒的檢測抗體的螢光圖像。
[0028]圖5為顯示目標區域的圖像，從中可計算每像素的平均強度。
[0029]圖6為具有附著於其上的抗體:分析物:綴合物(即，單克隆抗體19C7:肌鈣蛋白:綴合物M06-PE)的複合物的微粒的白光圖像。
[0030]圖7為具有附著於其上的抗體:分析物:綴合物(即，單克隆抗體19C7:肌鈣蛋白:綴合物M06-PE)的複合物的微粒的螢光圖像。
[0031]圖8為基於圖6和圖7的圖像的目標區域的圖像。圖8由軟體程序生成。
[0032]圖9為圖7的螢光圖像在圖8的目標區域的圖像上的覆蓋圖。
[0033]圖10為顯示由使用本文所述的成像算法所引起的免疫測定的靈敏度增加的校準曲線。對於該校準曲線，分析物(即，肌鈣蛋白)的校準品的範圍為10 ?8/!^至50，000 pg/
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[0034]圖11為顯示由使用本文所述的成像算法所引起的免疫測定的靈敏度增加的校準曲線。對於該校準曲線，分析物(即，肌鈣蛋白)的校準品的範圍為O pg/mL至200 pg/mL。在圖11中，還示出了來自每個校準品的圖像總面積的每像素的螢光強度平均值。
[0035]圖12為顯示分析物(即，中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白，或者在本文中被稱為「NGAL」)的校準品的每像素的平均螢光強度的校準曲線。對於該校準曲線，分析物NGAL的校準品的範圍為O pM至94 pM。[0036]圖13為顯示分析物(即，中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白，或者在本文中被稱為「NGAL」)的校準品的每像素的平均螢光強度的校準曲線。對於該校準曲線，分析物NGAL的校準品的範圍為O pM至6 pM。
[0037]圖14為具有附著於其上的抗體:分析物:綴合物(即，單克隆抗體19C7:肌鈣蛋白:綴合物M06-PE)的複合物的微粒的白光圖像。
[0038]圖15為基於圖14的圖像的目標區域的圖像。圖14由軟體程序生成。
[0039]圖16為具有附著於其上的抗體:分析物:綴合物(即，單克隆抗體19C7:肌鈣蛋白:綴合物M06-PE)的複合物的微粒的螢光圖像。
[0040]圖17為由每個濃度的校準品肌鈣蛋白的每像素的平均強度值生成的校準曲線。
[0041]圖18為顯示用於檢測DNA的試驗方案的插圖。
[0042]詳細說明
如本文所用，術語「分析物」是指待測量的化合物或組合物，其可以是配體，其為單表位或者多表位，抗原或半抗原，單個或多個化合物，其共享至少一個共同表位位點或受體。
[0043]免疫測定是一種測量在經常含有物質的複雜混合物的溶液中物質的存在或濃度的生化試驗。生物液體例如血清或尿液中的分析物經常使用免疫測定方法進行檢測。這種試驗是基於抗體高特異性結合於一個或非常有限組的分子的獨特能力。結合至抗體的分子被稱為抗原。免疫測定可以對抗原/抗體對的任一成員進行。除了結合特異性，所有免疫測定的另一關鍵特徵是響應於特異性結合產生可測量的信號的方法。歷史上，這通過測量某些物理特性的變化例如光散射或折射率改變來實現。然而，如今大多數免疫測定依賴於使用與可檢測標記相關聯的分析試劑。已證明了各種各樣的標記，包括酶；螢光、磷光和化學發光染料；膠乳和磁性顆粒；結晶染料、金、銀和硒膠體粒子；金屬螯合物；輔酶；電活性基團；寡核苷酸、穩定的基團及其他。這種標記用於檢測和定量結合事件，在分離游離和結合的標記試劑後或通過以結合事件影響標記所產生的信號的變化的方式設計系統進行。需要分離步驟的免疫測定(通常稱為分離免疫測定或異相免疫測定)是流行的，因為它們很容易設計，但它們經常需要多個步驟，包括仔細清洗標記試劑已結合在其上的表面。信號受結合影響的免疫測定通常可以不經分離步驟來運行。這種試驗經常可以簡單地通過混合試劑和樣品並進行物理測量來實現。這種試驗被稱為均相免疫測定或較不頻繁的非分離的免疫測定。
[0044]如本文所用，表述「夾心免疫測定」是指採用至少兩種特異性結合至相同配體的受體的免疫測定。在這種類型的免疫測定中，配體是分析物。一個受體能夠特異性結合至配體，藉此受體使配體能夠直接或間接地附著於固體載體，例如，微粒。另一受體能夠特異性結合至配體，藉此受體使配體可以直接或間接地附著於標記以提供用於檢測配體的信號。例如，一個受體可以是特異性結合至樣品中抗原的捕獲抗體，藉此使抗原直接或間接地附著於固體載體，例如，微粒，另一受體可以是特異性結合至樣品中抗原的檢測抗體，藉此使抗原直接或間接地附著於用於檢測抗原的標記。如果樣品中存在相對高量的配體，將會產生較高的信號。如果樣品中存在相對低量的配體，將會產生較低的信號。圖1為闡述夾心免疫測定的代表性實例的示意圖。
[0045]如本文所用，表述「競爭性免疫測定」是指採用結合至配體的受體的免疫測定。在這種類型的免疫測定中，配體是分析物。受體能夠特異性結合至配體，藉此使配體直接或間接地附著於固體載體，例如，微粒。標記的配體與分析物競爭相同的受體。例如，受體可以是特異性結合至樣品中抗原的捕獲抗體，藉此使抗原直接或間接地附著於固體載體，例如，微粒。樣品中的抗原是未標記的。標記的抗原與未標記的抗原競爭相同的捕獲抗體。變得附著於固體載體的標記抗原為檢測抗原提供標記。或者，在受體是特異性結合至樣品中抗體的抗原的情況下，藉此使抗體直接或間接地附著於固體載體，例如，微粒，未標記的抗體和標記抗體可競爭相同的抗原。變得附著於固體載體的標記抗體為檢測抗體提供標記。如果樣品中存在相對高量的配體，將會產生較低的信號。如果樣品中存在相對低量的配體，將會產生較高的信號。圖2為闡述競爭性免疫測定的代表性實例的示意圖。
[0046]如本文所用，術語「複合物」是指特異性彼此結合的至少兩個分子。複合物的實例包括但不限於結合至受體的配體、結合至多個受體的配體(例如，結合至兩個受體的配體)、結合至多個配體的受體(例如，結合至兩個配體的受體)。
[0047]如本文所用，表述「固相」是指受體的狀態，其中所述受體附著於固體載體的表面，使得該受體不能從液體介質中的固體載體脫離。固相可以容易地從分散固相的液體中分離。受體可附著的固體載體的實例是微粒，例如，磁微粒。所述微粒可以容易地從分散該微粒的液體中分離。所述微粒易於分散在水性介質中。
[0048]如本文所用，表述「固體載體」是指有助於產生固相的物質。固體載體的代表性實例包括但不限於微粒、微孔板的微孔、納米顆粒、凝膠、膠體、生物細胞。
[0049]如本文所用，表述「捕獲抗體」是指使分析物(即，抗原)結合至固體載體的抗體，其結果是該抗體使分析物附著於固體載體，藉此使分析物直接或間接通過幹預基團或幹預分子附著於固體載體。
[0050]如本文所用，表述「檢測抗體」是指附著於提供或可製備成提供在化學或生物反應中的可檢測信號的基團或分子的抗體。
[0051]如本文所用，表述「特異性結合對」是指兩個不同的分子，其中一個分子在表面上或空腔中具有特異性地結合至另一分子的特定空間結構的區域。所述特異性結合對的成員被稱為配體和受體。
[0052]如本文所用，表述「非特異性結合」是指兩個或更多實體(例如，兩個分子)之間以不同於導致特異性結合對的方式結合。
[0053]如本文所用，術語「配體」是指其受體天然存在或可被製備的任何物質。這種物質包括但不限於有機化合物、無機化合物和化學元素，例如銅、鋰。
[0054]如本文所用，術語「受體」是指能夠識別分子的特定空間和極性結構(即，表位位點)的任何化合物或組合物。例示性的受體包括天然存在的受體，例如甲狀腺素結合球蛋白、抗體、酶、Fab片段、凝集素等。
[0055]配體與受體的結合涉及兩個分子物種(species)之間的非共價相互作用。典型地，但不一定，較小的配體是可溶性分子，其結合至較大的受體。配體結合至受體的實例包括但不限於以下:
(a)具有短單鏈DNA配體的互補序列的長單鏈DNA受體；
(b)結合至其互補抗原配體的任何抗體受體或結合至其互補抗體配體的抗原受體；
(c)與維生素B12配體結合的內因子蛋白受體；
(d)氧分子配體的血紅蛋白受體。[0056]如本文所用，術語「綴合物」是指包含結合對成員和信號產生系統的成員(例如，標記)的實體。如本文所用，術語「標記」是指信號產生系統的成員，其直接或間接地結合至結合對成員或微粒。如本文所用，術語「信號產生系統」是指具有一種或多種組分的系統，至少一種組分綴合至特異性結合對成員。信號產生系統產生可測量的信號，其可通過外部工具檢測，通常為電磁輻射的測量，且取決於所使用的系統，信號的水平將隨處於固體載體(例如，微粒)環境中的信號產生系統的範圍而變化。在大多數情況下，信號產生系統將涉及發色團，其中發色團包括在紫外或可見區吸收光的染料、螢光體、螢光劑、螢光團、發光團和化學發光劑。另外，酶可以用來產生信號或放大信號或上述二者兼有。
[0057]如本文所用，術語「使…合格」、「合格的」等是指從不是由包含目標分析物的複合物所引起的圖像中除去那些信號的程序。這樣被除去的信號包括但不限於非特異性結合、不期望的聚合所產生的信號，或從未附著於固體載體的位置發出的信號。在大多數情況下，但有一些例外，使分析和測量合格的那些信號是包含標記的綴合物的特異性結合的結果。
[0058]如本文所用，且一般在數字圖像領域中，術語「像素(pixel) 」或「象素(pel) 」 (圖像元素)是指數字圖像中的單個點，或顯示裝置中的最小可尋址(addressable)的屏幕元素。它是能夠表示或控制的圖像的最小單元。每像素具有其自己的地址。像素的地址與其空間坐標相對應。像素通常排列在二維網格中，且往往用點或正方形表示。每個像素為原始圖像的樣品；更多的樣品典型地提供原物(the original)的更準確表示。每個像素的強度是可變的。圖像中像素的總數可以變化。數字圖像中像素數量的代表性實例為1024X1024。
[0059]如本文所用，術語「強度」是指每單位面積或體積的電、光、熱或聲音的強度的量或程度。更具體地，關於本文中實際描述的方法，術語「強度」是指每單位時間每單位面積所計數的光子數。例如，每單位面積1000個光子在單個像素中可記錄為500計數，而每單位面積80個光子在單個像素記錄為40計數。特定的轉換取決於所使用的照相機系統。強度與所計數的光子數成正比。
[0060]如本文所用，表述「目標區域」是指經選擇用於進一步分析的圖像中的那些像素。在圖像中，像素可以是連續的`或非連續的。
[0061]如本文所用，短語「空間信息」是指識別從其中發射信號的位置。
[0062]如本文所用，術語「 IgG」是指免疫球蛋白G。
[0063]在本文所述的發明的一般陳述中，配體特異性結合至受體以形成配體-受體複合物。得到配體-受體複合物的圖像。優選將圖像儲存以便它可在稍後的時間使用，如果需要的話。以僅進一步研究配體-受體複合物的方式從圖像中選擇目標區域。該選擇特徵確保背景信號和非特異性結合信號基本上從進一步分析中排除。計算目標區域的每像素光計數的平均數。
[0064]適合於本文所述方法的配體包括但不限於美國專利號4，275，149中所提到的那些，其通過引用併入本文中。適合於本文所述方法的受體包括但不限於美國專利號4，275，149中所提到的那些，其通過引用併入本文中。適合於本文所述方法的配體-受體複合物包括但不限於美國專利號4，275，149中所提到的那些，其通過引用併入本文中。
[0065]受體典型地附著於固體載體。適用於本文的固體載體為微粒。適用於本文所述方法的微粒包括但不限於磁微粒。微粒的尺寸典型地為約0.1 μ m至約100 μπι。市售的微粒可採用各種材料，包括陶瓷、玻璃、聚合物和金屬所製成的那些。適用於本文所述方法的磁微粒可商購自 Polymer Laboratories, Agilent Technologies 的子公司。雖然 0.1 μ m至100 μ m的通常所接受的定義是納米顆粒的尺寸定義的補充(complements),但還有其他的方法來定義尺寸。通常接受認為小於100 nm的微粒為納米顆粒。大於0.5 μ m的任何微粒和小於0.5 mm的任何物質被認為是微粒。一般而言,適用於本文所述方法的微粒尺寸必須足夠大使得可以通過所選擇的圖像系統來分辨兩個微粒。適用於本文所述方法的微粒的性質(例如，顏色)是選擇的問題。本領域普通技術人員能夠選擇微粒的性質以完成該方法的適當變化所施加的要求。
[0066]適用於本文所述方法的反應器包括微孔板。優選反應器具有這種特徵:可製造配體-受體複合物的圖像。優選反應器對電磁輻射是透明的，典型地在光譜的紫外和可見範圍內。適於製造反應器的材料包括玻璃和聚合物材料。優選反應器的材料不會自發突光。然而，反應器的特定形式或形狀不是關鍵的。
[0067]考慮用於本文所述方法的試驗的反應條件不是關鍵的。可使用與常規免疫測定或其他常規的特異性結合反應所使用的基本上相同的條件。這種條件包括但不限於孵育的持續時間、孵育的溫度範圍、洗滌步驟的次數、緩衝液和試驗中的其他非反應性物質等。原則上，設計用作化學發光試驗的任何免疫測定可通過本文所述方法使用螢光標記來進行。
[0068]適用於本文所述方法的成像系統可以是能夠獲取圖像使得可分辨各個微粒的任何系統。適用於本文所述方法的成像裝置包括但不限於光學顯微鏡、掃描顯微鏡、螢光成像掃描儀等。適用於本文所述方法的圖像文件類型包括但不限於JPEG/JFIF、GIF、BMP、TIFF和FITS。圖像文件格式描述於圖像文件格式-維基百科，免費的百科全書中，其可通過 Hypertext Transfer Protocol 在網站 en.wikipedia.0rg/wiki/image_file_formats訪問，其通過引用併入本文中，且FITS描述於FITS-維基百科，免費的百科全書中，其可通過 Hypertext Transfer Protocol 在網站 en.wikipedia.0rg/wiki/FITS 訪問，其通過引用併入本文中。
[0069]圖像的獲取過程中曝光持續時間不是關鍵的。適用於本文所述方法的曝光時間可以是提供足夠的解析度以辨別圖像的相關細節的任何曝光時間。
[0070]目標區域的選擇是重要的。通過使用合適的電腦程式，藉助於對比或一些替代標準確定各個微粒的位置。與微粒或其他固體載體相關聯的像素可被視為目標區域。為了得到樣品中分析物的濃度的有意義的值，優選至少約100個微粒，更優選至少約200個微粒位於圖像中。適用於本文所述方法的市售電腦程式包括但不限於具有商標「SLIDEB00K」和「METAM0RPH」的那些程序或公共領域的軟體，例如，ImageJ0
[0071]為了執行該方法的簡化形式，市售的落射螢光顯微鏡可用於通過支持它們的透明表面對複合物進行成像。這種顯微鏡的代表性實例是配備有高分辨CXD相機(Hamamatsu型號C4742-80-12AG)的機動倒置螢光顯微鏡(OLYMPUS 「 1X81」)，其可商購自許多來源。
[0072]在該方法的基本形式中，單色方法可利用來自反應混合物的總量的光信號用於提供比常規免疫測定更高的靈敏度。該更高的靈敏度可通過在較低濃度時具有較大斜率的線性函數的圖與在常規免疫測定中用作校準曲線的線性圖的對比來證實。
[0073]帶有捕獲抗體的微粒、附著於螢光團的檢測抗體和懷疑含有分析物的樣品在適當的條件下混合以進行免疫測定。進行免疫測定後，排除不是從包含附著於捕獲抗體的微粒、分析物和包含附著於螢光團的檢測抗體的綴合物的複合物發出的任何螢光信號。然後，基於綴合物的螢光團所發射的螢光使剩餘的複合物進一步合格。該較後的步驟排除了不符合選擇標準的微粒的表面的任何部分。基於統計參數(例如，標準偏差)，選擇標準的典型實例是用於測量的微粒具有大體上均勻的包被，其基本上消除了由於高度的非特異性結合所導致的綴合物的過度聚集。一般而言，選擇標準根據特定的試驗會有所不同。特定試驗領域的一個普通技術人員應該能夠為特定的試驗制定有意義的選擇標準。最後，測量合格顆粒的每像素強度的平均值以與建立作為強度函數的分析物的濃度的校準曲線的強度進行比較。合格顆粒的每像素強度的平均值可通過CCD相機來確定，其能夠測量光的強度。將強度的測量轉換為參數，並將其在計數的單元中指定。每像素具有與在該象素測得的光強度相對應的數。
[0074]在一個優選的實施方案中，得到反應混合物的白光圖像。白光圖像用來定位每個固體載體(例如，微粒)的位置。使用用於照明和檢測的整個電磁光譜形成白光圖像。該步不是必需的，但是是優選的，因為可能需要定位每個固體載體(例如，微粒)的位置。然後獲取螢光圖像以確定附著於微粒的檢測抗體的位置和強度。螢光圖像使用顏色，例如，紅色、綠色。計算每像素計數並記錄每像素計數的平均值和標準偏差。從分析中排除具有計數大於或小於例如上述標準偏差2倍的像素。計算剩餘像素的每像素計數的平均數。從檢測抗體的標記所測得的信號的數量確定分析物的濃度。
[0075]為了執行將提供更高程度的靈敏度的更複雜測量，市售的落射螢光顯微鏡可用於通過支持它們的透明表面對複合物進行成像。這種顯微鏡的代表性實例是配備有高解析度的CCD相機(Hamamatsu型號C4742-80-12AG)的機動倒置螢光顯微鏡(OLYMPUS 「1X81」)，其可商購自許多來源。
[0076]在該更複雜的測量中，雙色方法利用來自反應混合物的總量的光信號，用於提供比常規的免疫測定和採用早期所述的單色方法進行的測量更高的靈敏度。該更高的靈敏度可通過在較低濃度時具有較大斜率的線性函數的圖與在常規免疫測定或使用單色方法進行的試驗中用作校準曲線的線性圖的對比來證實。
[0077]將帶有捕獲抗體的微粒、附著於螢光團的檢測抗體和懷疑含有分析物的樣品在適當的條件下混合以進行免疫測定。進行免疫測定後，排除不是從包含附著於捕獲抗體的微粒、分析物和包含附著於第一螢光團的檢測抗體的綴合物的複合物發出的任何螢光信號。接下來，獲取捕獲抗體(以第二螢光團為特徵，其不同於第一螢光團)的圖像。該圖像排除與未以均相方式包被有捕獲抗體的任何微粒相對應的任何像素。如果微粒未均勻包被，則排除來自不是均勻包被的部分的像素。然後，基於綴合物所發射的螢光使複合物進一步合格。該後一步驟排除了不符合選擇標準的複合物的任何部分。選擇標準的典型實例是均勻的包被，其基本上消除了可由高度的非特異性結合所導致的綴合物的過度聚集。如前所述，選擇標準根據特定的試驗會有所不同。最後，測量合格顆粒的每像素強度的平均值以與建立分析物的濃度的校準曲線的強度進行對比。
[0078]在一個優選的實施方案中，得到反應混合物的白光圖像。白光圖像用來定位每個固體載體(例如，微粒)的位置。使用用於照明和檢測的整個電磁光譜形成白光圖像。該步驟不是必需的，但是是優選的，因為可能需要定位每個固體載體(例如，微粒)的位置。然後獲取第一螢光圖像以確定附著於微粒的捕獲抗體的位置。第一螢光圖像使用顏色，例如，紅色、綠色。獲取第二螢光圖像以確定作為綴合物的組分存在的抗體的位置。第二螢光圖像使用顏色，例如，紅色、綠色，但第二螢光圖像的顏色不同於第一螢光圖像的顏色。選擇來自於微粒上的捕獲抗體和綴合物上的抗體的像素用於進一步分析。計算每像素計數並記錄每像素計數的平均值和標準偏差。從分析中排除具有計數大於或小於例如上述標準偏差兩倍的像素。計算剩餘像素的每像素計數的平均數。從檢測抗體的標記測得的信號的數量確定分析物的濃度。
[0079]圖3、4和5闡述使配體-受體結合試驗的結果合格所需的步驟。通過包含激發濾波器和發射濾波器的一組濾波器對螢光通道進行限定，其允許具有特定波長的光到達樣品和具有特定波長的信號到達CCD相機。例如，螢光團R-藻紅蛋白(或者在本文中被稱為「PE」)只能在PE通道中檢測且不能在任何其它螢光通道中檢測。類似地，螢光團散二碳青色素(indodicarbocyanine)(或者在本文中被稱為「Cy5」)只能在Cy5通道檢測且不能在任何其它螢光通道檢測。在圖3中，檢測器中的一個通道測量用紅色螢光團(Cy5通道)標記的捕獲抗體的螢光圖像。僅顯現已被具有紅色螢光標記的捕獲抗體包被的微粒。有兩個位置(白色圓圈)可以被省略，因為它們未附著於微粒。在圖4中，檢測器的另一通道測量附著於微粒的檢測抗體的螢光圖像。顯現與其他微粒的強度分布不一致的非常亮的點，並用白色圓圈進行指定。該位置也可以從分析中排除。圖5表示目標區域，從該區域可計算每像素的強度值。不符合給定的選擇標準的區域可以從該類型的分析中排除。
[0080]以下非限制性實施例進一步闡述本發明的實施方案。在以下實施例中，所有濃度以重量計(w/w)，除非另有說明。在以下實施例中，根據本領域普通技術人員已知的常規方法製備綴合物，除非另有說明。在實施例1中，除非另有說明，帶有抗肌鈣蛋白單克隆抗體19C7的包被但在免疫測定中尚未反應的微粒被稱為「包被有抗肌鈣蛋白單克隆抗體19C7的微粒」;在免疫測定中已經反 應且存在於夾心複合物中的微粒被稱為「附著於單克隆抗體19C7:肌鈣蛋白:綴合物M06-PE複合物的微粒」。在實施例2中，除非另有說明，帶有抗人IgG單克隆抗體的包被但在免疫測定中尚未反應的微粒被稱為「包被有抗人IgG單克隆抗體的微粒」;在免疫測定中已經反應且存在於夾心複合物中的微粒被稱為「附著於綴合物2322-Cy5 =NGAL:綴合物903-PE複合物的微粒」。
[0081]實施例1
該實施例通過使用單一螢光染料作為標記來檢測抗體，闡述肌鈣蛋白的免疫測定。
[0082]製備包被有抗肌鈣蛋白單克隆抗體19C7的微粒。在含有牛血清白蛋白(BSA)(0.5%)、表面活性劑(「STANDAP0L」，。.2 %)和抗微生物劑(「PR0CLIN」 300,0.1%)的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中製備以下濃度的一組肌鈣蛋白(Tnl (28-1 IOaa)-TnC)校準品。下表列出了每個校準品中Tnl (28-1 IOaa)-TnC的濃度。
[0083]表1
【權利要求】
1.一種用於分析配體-受體結合試驗結果的方法，其包括以下步驟: (a)通過使用選自圖像的至少一個目標區域，提供配體-受體結合試驗結果；和 (b)使配體-受體結合試驗結果合格。
2.權利要求1的方法，其中所述圖像為數字圖像。
3.權利要求1的方法，其中所述至少一個目標區域包括用於進一步分析所選的數字圖像的像素。
4.權利要求1的方法，其中所述使合格步驟包括: (a)獲取第一螢光圖像以確定第一綴合物的位置； (b)選擇用於分析的像素； (c)計算並記錄步驟(b)中所選像素的每像素的計數的平均值和方差； (d)省略計數大於或小於指定方差的像素；和 (e)計算剩餘像素的每像素的計數的平均值。
5.權利要求4的方法，進一步包括根據步驟(e)中的數據確定分析物濃度的步驟。
6.權利要求4的方法，進一步包括提供包含配體-受體的反應混合物；和製備反應混合物的白光圖像以確定微粒的位置的步驟。
7.步驟4的方法，進一步包括獲取第二螢光圖像以用於確定第二綴合物的位置的步驟。
8.權利要求4的方法，其中所述省略的像素從分析中排除.
9.源文件第九條權利要求書缺失。
10.權利要求1的方法，其中聚集蛋白從分析中排除.
11.權利要求1的方法，其中所述結果源於免疫測定.
12.權利要求11的方法，其中所述結果源於夾心免疫測定.
13.權利要求11的方法，其中所述結果源於競爭性免疫測定.
14.權利要求11的方法，其中所述結果源於均相免疫測定.
15.權利要求11的方法，其中所述免疫測定涉及在反應器中混合附著於微粒的捕獲抗體、附著於標記的檢測抗體和懷疑含有抗原的樣品並允許反應發生的步驟.
16.權利要求15的方法，其中僅需要至多約兩百(200)個包被微粒.
17.權利要求11的方法，其中所述免疫測定涉及在反應器中混合附著於微粒的捕獲抗體、附著於標記的抗原和懷疑含有分析物的樣品並允許反應發生的步驟.
18.權利要求17的方法，其中僅需要至多約兩百(200)個包被微粒.
19.權利要求1的方法，其中所述結果源於核酸.
20.權利要求19的方法，其中所述試驗涉及混合含有DNA單鏈的配體和含有與配體的DNA單鏈互補的DNA鏈的受體的步驟.
21.權利要求1的方法，其中所述圖像通過配備有數位相機的螢光顯微鏡記錄.
22.權利要求1的方法，其中試驗的記錄以與保持X-射線和組織病理學記錄的那些方式類似的方式保持.
23.權利要求1的方法，其中獲取圖像並離線存儲.
24.權利要求1的方法，其中測量蛋白質的聚集而不是從生成的圖像中移除.
25.權利要求1的方法，其中空間信息用於使配體-受體結合試驗結果合格和定量配體-受體結合試驗結果.
26.權利要求1的方法，其中所述使合格包括使來自圖像中的配體-受體複合物的光信號合格.
27.權利要求26的方法，其中所述使合格步驟包括: (a)獲取第一螢光圖像以確定第一綴合物的位置； (b)選擇用於分析的目標區域； (c)省略計數大於或小於計算平均值的目標區域；和 (d)根據剩餘目標區域確定分析物濃度.
28.權利要求27的方法，其進一步包括提供包含配體-受體複合物的反應混合物；和製備所述反應混合物的白光圖像以確定微粒位置的步驟.
29.權利要求27的方法，其進一步包括獲取第二螢光圖像以確定第二綴合物位置的步驟.
30.權利要求27的方法，其中省`略的像素從分析中排除。
【文檔編號】G01N21/64GK103733066SQ201280038566
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年6月5日 優先權日:2011年6月6日
【發明者】阮俏俏, S.C.薩爾達納, J.P.斯金納, S.Y.特丁 申請人:雅培製藥有限公司