一種抗疫病不同生理小種的耐熱辣椒砧木的選育方法

2024-04-05 00:18:05

一種抗疫病不同生理小種的耐熱辣椒砧木的選育方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗疫病不同生理小種辣椒耐熱砧木的選育方法，該方法綜合了辣椒雜種優勢育種技術與嫁接技術的優點，選育的抗病辣椒耐熱砧木可明顯提高綜合性狀優良、但抗病耐熱性較差品種的抗病性和耐熱性。該方法具有操作簡單，節約育種時間，選育成本低等優點。這種通過選育砧木解決優良品種抗病性和耐熱性的方法，極大地加快了辣椒抗性育種的進程。
【專利說明】一種抗疫病不同生理小種的耐熱辣椒砧木的選育方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於蔬菜育種領域，涉及一種辣椒砧木的選育方法，特別涉及抗疫病不同生理小種的耐熱辣椒砧木的選育方法，它將雜種優勢育種技術與嫁接技術巧妙地結合，選育的抗病、耐熱砧木可有效提高辣椒綜合農藝性狀優良，但抗病耐熱性差品種的抗病性和耐熱性。
【背景技術】
[0002]辣椒(Capsicum annuum L.)是典型的「喜溫不耐熱」植物，當辣椒生長的環境溫度超過32°C時就會發生熱脅迫，導致授粉受精不良和落花落果現象的發生，嚴重時可使坐果率降至10%~20%，最終影響辣椒的品質和產量。在我國，大棚蔬菜已經成為蔬菜生產的重要栽培模式。在夏季，大棚雖只保留「天棚」(大棚四周大通風，只留棚頂塑料薄膜)進行通風，但棚內溫度仍然很高，中午13:00-15:00時常常達到45°C以上，影響大棚辣椒越夏期的開花、坐果，甚至導致死秧現象，嚴重製約大棚辣椒的越夏生產。同時，辣椒疫病又是危害辣椒生產的主要病害之一，在世界上許多國家都有發生，特別是在夏季，大棚中的辣椒經常處於高溫、高溼的環境中，辣椒疫病更是頻繁發生。在我國青海、新疆、甘肅、陝西、北京、遼寧、上海、浙江、湖南、四川、雲南等辣椒主產區辣椒疫病均曾大面積發生。隨著辣椒產業的發展，辣椒疫病有逐年加重的趨勢，造成了嚴重的經濟損失。該病害的病原菌為辣椒疫黴菌(Phytophthora capsici Leon),辣椒的苗期、成株期均可受害,致使莖、葉和果實發病。辣椒疫病傳播速度快，發病田經常絕產，造成嚴重的經濟損失。目前生產上控制辣椒疫病以化學防治為主，防治成本高，且嚴重汙染環境。
[0003]選育既抗疫病又耐熱的辣椒品種是防止或減輕越夏辣椒栽培中疫病和高溫危害的有效途徑，但現有抗疫病的抗源，其果形小、品質較差、轉育難度大，難以滿足辣椒產業化對品種更新換代的要求。生產上，一些優良品種往往具有品質好、產量高等優良特性，但不兼具耐熱、抗病特性。然而，選育品質優良，綜合農藝性狀好，高抗疫病且耐熱的品種是一項複雜又漫長的育種過程。本發明通過選育辣椒耐熱純系和抗病純系，配製一代雜種(F1)，以Fl幼苗作為砧木，選品質佳，綜合農藝性狀優良，但抗病耐熱性差的品種作為接穗進行嫁接，對嫁接苗和非嫁接苗作耐熱和抗病性鑑定。結果表明，嫁接苗的抗病性和耐熱性均得到了明顯提高。該方法具有操作簡單，節約育種時間，選育成本低等優點。這種通過選育砧木解決優良品種抗病性和耐熱性的方法，極大地加快了辣椒抗性育種的進程。
[0004]以下是相關的參考文獻:
[0005]1.Cloning and Expression under Heat Stress of A Small Heat ShockProtein Gene CaHSP24from Pepper.Zhu Wei, Lu Minghui, Gong Zhenhui, and ChenRugang[J].African Journal of Biotechnology，2011，10 (25):4968_4976。
[0006]2.張瑩麗，鞏振輝，李大偉，黃煒，逯明輝，陳儒鋼.陝西辣椒疫病病原鑑定及其防治劑的室內篩選[J]，西 北農業學報，2009，18 (5):336-340。
[0007]3.馬寶鵬，辣椒耐熱性鑑定體系的建立及高溫脅迫下花葯基因表達差異的研究[Μ],西北農林科技大學碩士學位論文(導師:鞏振輝)，2013，ρ6-8。
[0008]4.楊茹薇，秦勇，吳慧，季金鳳.辣椒嫁接抗疫病效果研究【J】，新疆農業大學學報，2010，33 (I):27-30。

【發明內容】

[0009]針對以上辣椒育種中存在的問題，本發明的目的在於，提出一種抗疫病不同生理小種的辣椒耐熱砧木的選育方法。
[0010]為了實現上述目的，本發明採用如下的技術解決方案:
[0011]一種抗疫病不同生理小種的辣椒耐熱砧木的選育方法，其特徵在於，以抗辣椒疫病某一(或某些)生理小種的辣椒品系A及耐熱性較強的辣椒品系B作為選育砧木的原始材料，通過連續三代單株自交分別獲得純系A-1和B-1，再以純系A-1為母本，以B-1為父本配製一代雜種F1，以Fl為砧木，以綜合農藝性狀優良的品種為接穗，進行嫁接，然後對嫁接苗作抗病性和耐熱性鑑定，得到抗疫病不同生理小種的辣椒耐熱砧木。
[0012]具體包括以下步驟: [0013]I)抗疫病某一(或某些)生理小種辣椒純系和耐熱辣椒純系的選育
[0014]選用抗疫病不同生理小種和耐熱辣椒的抗源，將它們的種子分別經55°C溫湯浸種20min,清水浸泡5h，28 V，全黑暗人工氣候箱中進行催芽，經4d種子露白，播於穴盤中；出芽後，每天傍晚用噴壺給苗子噴一次水，以基質溼潤為止，培養期間燒Hoagland’s營養液2-3次，直至幼苗長出7-8片真葉時將它們移栽於塑料大棚中；
[0015]當植株進入花期時，選取株型健壯、生長勢良好的單株進行人工自交，並掛牌標記，在果實完熟後，採收單株自交種子，室內考種、風乾，留作翌年繼續選育。以同樣的方法經連續三代自交純化，分別選育出表型一致、遺傳性穩定、抗疫病某一(或某些)生理小種的辣椒純系A-1和耐熱辣椒純系B-1。
[0016]2)配製一代雜種
[0017]以抗疫病某一(或某些)生理小種的辣椒純系A-1為母本，以耐熱辣椒純系B-1為父本,配製、生產一代雜交種Fl種子。
[0018]3) 一代雜交種Fl幼苗的培養
[0019]將雜交種Fl的種子，以及綜合農藝性狀優良的辣椒品種的種子，分別經55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽，經4d種子露白，播於穴盤中；然後將穴盤置於人工氣候箱中進行培養，培養所需的晝夜溫光周期條件為:相對溼度50%-70%，光照3000-40001x，白天溫度25°C _30°C，16h，夜間溫度18°C，8h，培養期間澆Hoagland’s營養液，直至幼苗長出4_5片真葉時，進行嫁接以及抗疫病和耐熱性鑑定。
[0020]4)嫁接
[0021]嫁接選在每年的3-6月份在溫室進行，這一時期嫁接成活率高。砧木先於接穗5d播種。待砧木長到5-7片真葉，接穗為4-5片真葉，莖粗2mm左右時嫁接為宜。採用劈接法進行嫁接。嫁接後，及時把嫁接苗移入密閉的小拱棚內。嫁接癒合時的溫度控制在白天25-260C，夜間20-22°C，相對溼度95%以上。為防止強光照射和保持棚內溼度穩定，需在小拱棚外面覆蓋紙被，嫁接後的前5d全部遮光，以後兩側見光，並逐步加大見光與通風量。隨著傷口癒合逐漸撤掉覆蓋物，兩周後轉入正常管理。[0022]5)耐熱性鑑定
[0023]將辣椒嫁接苗和對照(綜合性狀優良，但抗病耐熱性差)秧苗子葉上方同一葉齡的功能葉帶柄採下，作為鑑定其耐熱性的樣品。每種材料的辣椒供試離體葉樣品10片，重複3次，將採集的辣椒功能葉按待檢辣椒品系編號，插入裝滿蒸餾水的250mL三角瓶中，在三角瓶壁上用記號筆標明待檢辣椒品系編號；隨後把插有待檢樣品的三角瓶置於38°C的光照培養箱中，光照3000~40001x，連續光照處理60h後，統計熱害指數；在鑑定期間，每天檢查三角瓶中水位並及時補加蒸餾水，使離體的辣椒功能葉的葉柄一直浸在水中；
[0024]按照以下辣椒離體葉片耐熱性鑑定分級標準統計待檢辣椒品系葉片級數:
[0025]O級:全葉青綠，無熱害症狀；
[0026]I級:葉片失水，輕度萎蔫；
[0027]3級:葉片輕度失綠，輕度萎蔫；
[0028]5級:全葉轉色為淺黃綠色，葉片萎蔫，葉尖部分壞死；
[0029]7級:全葉轉色為黃綠色，葉尖壞死，葉緣翻卷；
[0030]9級:全葉發黃，葉尖葉緣重度壞死焦枯，葉緣重度翻卷；
[0031]按下式計算熱害指數:
[0032]熱害指數=Σ (各級熱害指數葉片數X該熱害級別值)+ (調查總葉片數X最高級值)X 100 ；
[0033]熱害指數計算時，如重複間差異不顯著，取3次重複的平均值；如差異顯著，再重複3次，取其3次差異不顯著的平均值作為該檢測辣椒耐熱性品系的熱害指數；最後，根據以下群體分級標準確定待測辣椒品系的耐熱性:
[0034]熱吾指數< 35.0為耐熱品系；
[0035]熱害指數在35.1~59.9為較耐熱品系；
[0036]熱害指數≥60.0為熱敏品系。
[0037]6)抗病性鑑定
[0038]菌液製備
[0039]將病原菌接到馬鈴薯瓊脂蔗糖固體培養基(PDA)上，在28°C恆溫培養箱裡暗培養7d，然後置於40W日光燈下，培養皿與燈管相距30-40cm，室溫下誘導孢子囊的產生。將產生的孢子囊刮到清水中，4°C下放置lh，再在常溫下放置lh，孢子囊就會釋放大量的遊動孢子，過濾後收集濾液，鏡檢，最後稀釋到6個孢子囊/100倍視野作為接種液備用。
[0040]待嫁接苗成活後(從嫁接當天起算約2周)，這時嫁接苗生長正常。將生長有對照苗(非嫁接苗)和嫁接苗的營養缽分別灌透水，用Iml藍色槍頭在距幼苗根莖約Icm處的基質中扎一個小孔，並注入辣椒疫黴菌某一生理小種2ml的接種液，嫁接苗和對照苗(接種無菌水)各接種30株。接種後採用塑料薄膜覆蓋保溼培養5d-7d，溫度保持在25-30°C。觀察感病狀況，計算病情指數，鑑定嫁接苗的抗病性。
[0041]調查分級標準
[0042]接種後第6天統計疫病發生情況，並計算病情指數。單株分級標準與群體分級標準如下:
[0043]單株分級標準:
[0044]O級:無任何症狀；[0045]I級:幼苗根莖部稍有變黑，葉片不萎蔫或可恢復性萎蔫；
[0046]2級:幼苗根莖部變黑達l_2cm，葉片不可恢復性萎蔫，下部葉片偶有脫落；
[0047]3級:幼苗根莖部變黑超過l-2cm，葉片明顯萎蔫或落葉明顯；
[0048]4級:幼苗根莖部變黑、皺縮，生長點外部葉脫落或整株萎蔫；
[0049]5級:植株枯死。
[0050]病情指數(DI)=【Σ(病級數X該病級植株數)Χ100】/ (病級最高值X調查株數)
[0051]群體分級標準:
[0052]免疫(I):DI=0;
[0053]高抗(HR):0 < DI ^ 10 ；
[0054]抗病(R): 10 < DI 蘭 30 ;
[0055]中抗(MR):30 < DI ^ 50 ；
[0056]感病0:01>50。
[0057]本發明的抗疫病不同生理小種辣椒耐熱砧木的選育方法，綜合了辣椒雜種優勢育種技術與嫁接技術的優點，選育的抗病辣椒耐熱砧木可明顯提高綜合性狀優良，但抗病耐熱性差的品種的抗病性和耐熱性。該方法的顯著特點是操作簡便，選育成本低，可迅速應用於提高綜合農藝性狀優良 ，但抗病耐熱性差的辣椒品種的抗病性和耐熱性。可極大地加快辣椒抗性育種的進程。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0058]圖1為辣椒葉片耐熱鑑定分級標準:從左至右分別為0、1、3、5、7、9級；
[0059]圖2為辣椒疫病感病症狀分級標準:從左至右分別為0、1、2、3、4、5級。
[0060]以下結合附圖和發明人給出的實施例對本發明作進一步的詳細說明。
【具體實施方式】
[0061 ] 本發明首次提出一種抗疫病不同生理小種辣椒耐熱砧木的選育方法，該方法綜合了辣椒雜種優勢育種技術與嫁接技術的優點，選育的抗病、耐熱辣椒站木可較好地提聞綜合性狀優良，但抗病耐和熱性差的品種的抗病性和耐熱性。該方法具有操作簡單，節約育種時間，選育成本低等優點。這種通過選育砧木解決優良品種抗病性和耐熱性的方法，極大地加快了辣椒抗性育種的進程。其具體步驟如下:
[0062]I)抗疫病某一(或某些)生理小種辣椒純系和耐熱辣椒純系的選育
[0063]選用抗疫病不同生理小種和耐熱辣椒的抗源，將它們的種子分別經55°C溫湯浸種20min,清水浸泡5h，28 V，全黑暗人工氣候箱中進行催芽，經4d種子露白，播於穴盤中；出芽後，每天傍晚用噴壺給苗子噴一次水，以基質溼潤為止，培養期間燒Hoagland’s營養液2-3次，直至幼苗長出7-8片真葉時將它們移栽於塑料大棚中。當植株進入花期時，選取株型健壯、生長勢良好的單株進行人工自交，並掛牌標記，在果實完熟後，採收單株自交種子，室內考種、風乾，留作翌年繼續選育。以同樣的方法經連續三代自交純化，分別選育出表型一致、遺傳性穩定、抗疫病某一(或某些)生理小種的辣椒純系(如:A-1)和耐熱辣椒純系(如:B-1)。[0064]2)配製一代雜種
[0065]以抗疫病某一(或某些)生理小種的辣椒純系A-1為母本，以耐熱辣椒純系B-1為父本,配製、生產一代雜交種Fl種子。
[0066]3) 一代雜交種Fl幼苗的培養
[0067]將雜交種Fl的種子，以及綜合農藝性狀優良的辣椒品種的種子，分別經55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28 V，全黑暗人工氣候箱中進行催芽，經4d種子露白，播於穴盤中；然後將生長有辣椒苗的穴盤置於人工氣候箱中進行培養，培養所需的晝夜溫光周期條件為:相對溼度50%-70%，光照3000-40001x，白天溫度25°C _30°C，16h，夜間溫度18°C，8h，培養期間澆Hoagland’s營養液，直至幼苗長出4_5片真葉時，進行嫁接以及抗疫病和耐熱性鑑定。
[0068]4)嫁接
[0069]試驗最好選在每年的3-6月份在溫室進行，這一時期嫁接成活率高。砧木先於接穗5d播種。待砧木長到5-7片真葉，接穗為4-5片真葉，莖粗2mm左右時嫁接為宜。採用劈接法進行嫁接。嫁接後，及時把嫁接苗移入密閉的小拱棚內。嫁接癒合時的溫度控制在白天25-26°C，夜間20-22°C，相對溼度95%以上。為防止強光照射和保持棚內溼度穩定，需在小拱棚外面覆蓋紙被，嫁接後的前5d全部遮光，以後兩側見光，並逐步加大見光與通風量。隨著傷口癒合逐漸撤掉覆蓋物，兩周後轉入正常管理。
[0070]5)耐熱性鑑定
[0071]將辣椒嫁接苗和對照(綜合性狀優良，但抗病耐熱性差)秧苗子葉上方同一葉齡的功能葉片帶柄採下，作為鑑定其耐熱性的樣品。每種材料的辣椒供試離體葉樣品10片，重複3次，將採集的辣椒功能葉按待檢辣椒品系編號，插入裝滿蒸餾水的250mL三角瓶中，在三角瓶壁上用記號筆標明待檢辣椒品系編號；隨後把插有待檢樣品的三角瓶置於38°C的光照培養箱中，光照3000~40001x，連續光照處理60h後，統計熱害指數；在鑑定期間，每天檢查三角瓶中水位並及時補加蒸餾水，使離體的辣椒功能葉的葉柄一直浸在水中；
[0072]按照以下辣椒離體葉片耐熱性鑑定分級標準統計待檢辣椒品系葉片級數【馬寶鵬，辣椒耐熱性鑑定體系的建立及高溫脅迫下花葯基因表達差異的研究【M】，西北農林科技大學碩士學位論文(導師:鞏振輝)，2013，p6-8】:
[0073]O級:全葉青綠，無熱害症狀；
[0074]I級:葉片失水，輕度萎蔫；
[0075]3級:葉片輕度失綠，輕度萎蔫；
[0076]5級:全葉轉色為淺黃綠色，葉片萎蔫，葉尖部分壞死；
[0077]7級:全葉轉色為黃綠色，葉尖壞死，葉緣翻卷；
[0078]9級:全葉發黃，葉尖葉緣重度壞死焦枯，葉緣重度翻卷；
[0079]按下式計算熱害指數:
[0080]熱害指數=Σ (各級熱害指數葉片數X該熱害級別值)+ (調查總葉片數X最高級值)X 100 ；
[0081]熱害指數計算時，如重複間差異不顯著，取3次重複的平均值；如差異顯著，再重複3次，取其3次差異不顯著的平均值作為該檢測辣椒耐熱性品系的熱害指數；最後，根據以下群體分級標準確定待測辣椒品系的耐熱性:[0082]熱害指數≤35.0為耐熱品系；
[0083]熱害指數在35.1~59.9為較耐熱品系；
[0084]熱吾指數> 60.0為熱敏品系。
[0085]6)抗病性鑑定
[0086]菌液製備
[0087]將病原菌接到馬鈴薯瓊脂蔗糖固體培養基(PDA)上，在28°C恆溫培養箱裡暗培養7d，然後置於40W日光燈下，培養皿與燈管相距30-40cm，室溫下誘導孢子囊的產生。將產生的孢子囊刮到清水中，4°C下放置lh，再在常溫下放置lh，孢子囊就會釋放大量的遊動孢子，過濾後，收集濾液，鏡檢，最後稀釋到6個孢子囊/100倍視野作為接種液備用。
[0088]待嫁接苗成活後(從嫁接當天算約2周)，這時嫁接苗生長正常。將生長有對照苗和嫁接苗的營養缽分別灌透水，用Iml藍色槍頭在距幼苗根莖約Icm處的基質中扎一個小孔，並注入辣椒疫黴菌某一生理小種2ml的接種液，嫁接苗和對照苗(接種無菌水)各接種30株。接種後採用塑料覆膜保溼培養5-7d，溫度保持在25-30°C。觀察感病狀況，計算病情指數，鑑定嫁接苗的抗病性(楊茹薇，秦勇，吳慧，季金鳳，辣椒嫁接抗疫病效果研究【J】，新疆農業大學學報，2010，33 (1):27-30)。
[0089]調查分級標準
[0090]接種後第6天統計疫病發生情況，並計算病情指數。單株分級標準與群體分級標準如下。
[0091]單株分級標準: [0092]O級:無任何症狀；
[0093]I級:幼苗根莖部稍有變黑，葉片不萎蔫或可恢復性萎蔫；
[0094]2級:幼苗根莖部變黑達l-2cm，葉片不可恢復性萎蔫，下部葉片偶有脫落；
[0095]3級:幼苗根莖部變黑超過l-2cm，葉片明顯萎蔫或落葉明顯；
[0096]4級:幼苗根莖部變黑、皺縮，生長點外部葉脫落或整株萎蔫；
[0097]5級:植株枯死。
[0098]病情指數(DI)=【Σ(病級數X該病級植株數)X 100】/ (病級最高值X調查株數)
[0099]群體分級標準:
[0100]免疫(I):DI=0;
[0101]高抗(HR):0 < DI 芻 10 ;
[0102]抗病(R):10 < DI 蘭 3O ;
[0103]中抗(MR):30 < DI ^ 50 ；
[0104]感病(S):DI>50。
[0105]以下具體的應用實施例，需要說明的是，以下實施例僅是說明性的，本發明並不限於這些實施例。
[0106]實施例1:
[0107]( I)抗疫病生理小種I和生理小種2的辣椒純系和耐熱辣椒純系的選育
[0108]選用抗疫病生理小種I (phi)和生理小種2 (ph2)辣椒品系PBC495 (張瑩麗，鞏振輝，李大偉，黃煒， 逯明輝，陳儒鋼.陝西辣椒疫病病原鑑定及其防治劑的室內篩選，西北農業學報，2009，18 (5):336-340)和耐熱辣椒品系 B35 [Zhu Wei, Lu Minghui, GongZhenhui, and Chen Rugang.Cloning and Expression under Heat Stress of A SmallHeat Shock Protein Gene CaHSP24from Pepper[J].African Journal of Biotechnology,2011,10 (25):4968-4976】，種子由西北農林科技大學園藝學院辣椒課題組提供。將它們的種子分別經55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽，經4d種子露白，播於穴盤中；出芽後，每天傍晚用噴壺給苗子噴一次水，以基質溼潤為止，培養期間澆Hoagland’s營養液2_3次，直至幼苗長出7-8片真葉時將它們移栽於塑料大棚中。當植株進入花期時，選取株型健壯、生長勢良好的單株進行人工自交，並掛牌標記，在果實完熟後，採收單株自交種子，室內考種、風乾，留作翌年繼續選育。以同樣的方法經連續三代自交純化，分別選育出表型一致、遺傳性穩定、抗疫病生理小種I和抗生理小種2的辣椒純系PBC495-1和耐熱辣椒純系B35-1。
[0109]2)配製一代雜種
[0110]以抗疫病生理小種I和生理小種2的辣椒純系PBC495-1為母本，以耐熱辣椒純系B35-1為父本，配製、生產一代雜交種Fl種子。
[0111]3)—代雜交種Fl幼苗的培養
[0112]將雜交種Fl的種子，以及綜合農藝性狀優良，但抗病、耐熱性較差的辣椒品種Early Calwonder的種子,分別經55°C溫湯浸種20min,清水浸泡5h, 28°C,全黑暗人工氣候箱中進行催芽，經4d種子露白，播於穴盤中；然後將穴盤置於人工氣候箱中進行培養，培養所需的晝夜溫光周期條件為:相對溼度50%-70%，光照3000-40001x，白天溫度25 V -30°C,16h，夜間溫度18°C，8h，培養期間澆Hoagland’s營養液，直至幼苗長出4_5片真葉時，進行嫁接以及抗疫病和耐熱性鑑定。
[0113]4)嫁接
[0114]嫁接在2013年3月15日在溫室進行，這一時期嫁接成活率高。砧木【(PBC495-1 XBSS-DF1]先於接穗(Early Calwonder) 5d播種。待砧木長到5-7片真葉，接穗為4-5片真葉，莖粗2_左右時嫁接為宜。採用劈接法進行嫁接。嫁接後，及時把嫁接苗移入密閉的小拱棚內。嫁接癒合時的溫度控制在白天25°C _26°C，夜間20°C _22°C，相對溼度95%以上。為防止強光照射和保持棚內溼度穩定，需在小拱棚外面覆蓋紙被，嫁接後的前5d全部遮光，以後兩側見光，並逐步加大見光與通風量。隨著傷口癒合逐漸撤掉覆蓋物，兩周後轉入正常管理。
[0115]5)耐熱性鑑定
[0116]將辣椒嫁接苗和對照(Early Calwonder)苗葉上方同一葉齡的功能葉片帶柄採下，作為鑑定其耐熱性的樣品。每種材料的辣椒供試離體葉樣品10片，重複3次，將採集的辣椒功能葉按待檢辣椒品系編號，插入裝滿蒸餾水的250mL三角瓶中，在三角瓶壁上用記號筆標明待檢辣椒品系編號；隨後把插有待檢樣品的三角瓶置於38°C的光照培養箱中，光照3000~40001x，連續光照處理 60h後，統計熱害指數；在鑑定期間，每天檢查三角瓶中水位並及時補加蒸餾水，使離體的辣椒功能葉的葉柄一直浸在水中；
[0117]按照以下辣椒離體葉片耐熱性鑑定分級標準統計待檢辣椒品系葉片級數【馬寶鵬，辣椒耐熱性鑑定體系的建立及高溫脅迫下花葯基因表達差異的研究【M】，西北農林科技大學碩士學位論文(導師:鞏振輝)，2013，p6-8】:[0118]O級:全葉青綠，無熱害症狀；
[0119]I級:葉片失水，輕度萎蔫；
[0120]3級:葉片輕度失綠，輕度萎蔫；
[0121]5級:全葉轉色為淺黃綠色，葉片萎蔫，葉尖部分壞死；
[0122]7級:全葉轉色為黃綠色，葉尖壞死，葉緣翻卷；
[0123]9級:全葉發黃，葉尖葉緣重度壞死焦枯，葉緣重度翻卷；
[0124]按下式計算熱害指數:
[0125]熱害指數=Σ (各級熱害指數葉片數X該熱害級別值)+ (調查總葉片數X最高級值)X 100 ；
[0126]熱害指數計算時，如重複間差異不顯著，取3次重複的平均值；如差異顯著，再重複3次，取其3次差異不顯著的平均值作為該檢測辣椒耐熱性品系的熱害指數；最後，根據以下群體分級標準確定待測辣椒品系的耐熱性:
[0127]熱吾指數< 35.0為耐熱品系；
[0128]熱害指數在35.1~59.9為較耐熱品系；
[0129]熱害指數≤60.0為熱敏品系。
·[0130]根據熱害指數計算公式，計算出選育的抗病耐熱嫁接苗【砧木(PBC495-1XB35-1)F1，接穗Early Calwonder】的熱害指數為22.2,為耐熱級；而Early Calwonder的熱害指數為51.1，為較耐熱級。這一結果說明利用本發明選育的抗病耐熱砧木嫁接了 EarlyCalwonder接穗後的嫁接苗的耐熱性明顯高於Early Calwonder的耐熱性。
[0131]6)抗病性鑑定
[0132]菌液製備
[0133]將病原菌接到馬鈴薯瓊脂蔗糖固體培養基(PDA)上，在28°C恆溫培養箱裡暗培養7d，然後置於40W日光燈下，培養皿與燈管相距30-40cm，室溫下誘導孢子囊的產生。將產生的孢子囊刮到清水中，4°C下放置lh，再在常溫下放置lh，孢子囊就會釋放大量的遊動孢子，過濾後，收集濾液，鏡檢，最後稀釋到6個孢子囊/100倍視野作為接種液備用。
[0134]待嫁接苗成活後(從嫁接當天算約2周)，這時嫁接苗生長正常。將生長有對照(Early Calwonder)苗和嫁接苗的營養缽分別灌透水,用Iml藍色槍頭在距幼苗根莖約Icm處的基質中扎一個小孔，分別注入辣椒疫黴菌生理小種I和生理小種2接種液2ml，嫁接苗和對照苗(接種無菌水)各接種30株。接種後採用塑料薄膜覆蓋保溼培養5-7d，溫度保持在25-30°C。觀察感病狀況，計算病情指數，鑑定嫁接苗的抗病性【楊茹薇，秦勇，吳慧，季金鳳.辣椒嫁接抗疫病效果研究[J].新疆農業大學學報，2010，33 (1):27-30】。
[0135]調查分級標準
[0136]接種後第6天統計疫病發生情況，並計算病情指數。單株分級標準與群體分級標準如下。
[0137]單株分級標準:
[0138]O級:無任何症狀；
[0139]I級:幼苗根莖部稍有變黑，葉片不萎蔫或可恢復性萎蔫；
[0140]2級:幼苗根莖部變黑達l-2cm，葉片不可恢復性萎蔫，下部葉片偶有脫落；
[0141]3級:幼苗根莖部變黑超過l-2cm，葉片明顯萎蔫或落葉明顯；[0142]4級:幼苗根莖部變黑、皺縮，生長點外部葉脫落或整株萎蔫；
[0143]5級:植株枯死。
[0144]病情指數(DI)=【Σ(病級數X該病級植株數)Χ100】/ (病級最高值X調查株數)
[0145]群體分級標準:
[0146]免疫(I):DI=0;
[0147]高抗(HR):0 < DI 芻 10 ;
[0148]抗病(R):10 < DI 蘭 3O ;
[0149]中抗(MR):30 < DI ^ 50 ；
[0150]感病(S):DI>50。
[0151]根據病情指數計算公式，接種辣椒疫黴菌生理小種I後，嫁接苗【砧木(PBC495-1 XB35-1) F1,接穗 Early Calwonder]的病情指數為 17.4,為抗病級;而 EarlyCalwonder的病情指數為51.5，為感病級；接種辣椒疫黴菌生理小種2後，嫁接苗病情指數為28.6,為抗病級；而Early Calwonder病情指數57.1,為感病級；這一結果說明利用本發明選育的抗病耐熱站木嫁接了 EarlyCalwonder接穗後的嫁接苗的抗病性明顯高於EarlyCalwonder的抗病性。
[0152]實施例2:
[0153]( I)抗疫病生理小種I的辣椒純系和耐熱辣椒純系的選育
[0154]選用抗疫病生理小種I (phi)辣椒品系PBC137【張瑩麗，鞏振輝，李大偉，黃煒，逯明輝，陳儒鋼.陝西辣椒疫病病原鑑定及其防治劑的室內篩選，西北農業學報，2009，18(5):336-340】和耐熱辣椒品系 B35【Zhu Wei, Lu Minghui, Gong Zhenhui, and Chen Rugang.Cloning and Expression under Heat Stress of A Small Heat Shock Protein GeneCaHSP24from Pepper[J].African Journal of Biotechnology,2011,10(25):4968-4976],種子由西北農林科技大學園藝學院辣椒課題組提供。將它們的種子分別經55°C溫湯浸種20min,清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽，經4d種子露白，播於穴盤中；出芽後，每天傍晚用噴壺給苗子噴一次水，以基質溼潤為止，培養期間燒Hoagland’s營養液2-3次，直至幼苗長出7-8片真葉時將它們移栽於塑料大棚中。當植株進入花期時，選取株型健壯、生長勢良好的單株進行人工自交，並掛牌標記，在果實完熟後，採收單株自交種子，室內考種、風乾，留作翌年繼續選育。以同樣的方法經連續三代自交純化，分別選育出表型一致、遺傳性穩定、抗疫病生理小種I的辣椒純系PBC137-1和耐熱辣椒純系B35-1。
[0155]2)配製一代雜種
[0156]以抗疫病生理小種I的辣椒純系PBC137-1為母本，以耐熱辣椒純系B35-1為父本,配製、生產一代雜交種Fl種子。
[0157]3) 一代雜交種Fl幼苗的培養
[0158]將雜交種Fl的種子，以及綜合農藝性狀優良，但抗病耐熱性較差的辣椒品種B12的種子，分別經55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽，經4d種子露白，播於穴盤中；然後將穴盤置於人工氣候箱中進行培養，培養所需的晝夜溫光周期條件為:相對溼度50%-70%，光照3000-40001x，白天溫度25°C _30°C，16h，夜間溫度18°C，8h，培養期間澆Hoagland’s營養液，直至幼苗長出4_5片真葉時，進行嫁接以及抗疫病性和耐熱性鑑定。
[0159]4)嫁接
[0160]嫁接在2013年3月15日在溫室進行，這一時期嫁接成活率高。砧木【選育的抗病耐熱砧木(PBC137-1XB35-1)】先於接穗(辣椒品種B12)5d播種。待砧木長到5_7片真葉，接穗為4-5片真葉，莖粗2_左右時嫁接為宜。採用劈接法進行嫁接。嫁接後，及時把嫁接苗移入密閉的小拱棚內。嫁接癒合時的溫度控制在白天25-26°C，夜間20-22°C，相對溼度95%以上。為防止強光照射和保持棚內溼度穩定，需在小拱棚外面覆蓋紙被，嫁接後的前5d全部遮光，以後兩側見光，並逐步加大見光與通風量。隨著傷口癒合逐漸撤掉覆蓋物，兩周後轉入正常管理。
[0161]5)耐熱性鑑定[0162]將辣椒嫁接苗和對照(B12)苗子葉上方同一葉齡的功能葉片帶柄採下，作為鑑定其耐熱性的樣品。每種材料的辣椒供試離體葉樣品10片，重複3次，將採集的辣椒功能葉按待檢辣椒品系編號，插入裝滿蒸餾水的250mL三角瓶中，在三角瓶壁上用記號筆標明待檢辣椒品系編號；隨後把插有待檢樣品的三角瓶置於38°C的光照培養箱中，光照3000~40001x,連續光照處理60h後，統計熱害指數；在鑑定期間，每天檢查三角瓶中水位並及時補加蒸餾水，使離體的辣椒功能葉的葉柄一直浸在水中；
[0163]按照以下辣椒離體葉片耐熱性鑑定分級標準統計待檢辣椒品系葉片級數【馬寶鵬，辣椒耐熱性鑑定體系的建立及高溫脅迫下花葯基因表達差異的研究[M]，西北農林科技大學碩士學位論文(導師:鞏振輝)，2013，p6-8】:
[0164]O級:全葉青綠，無熱害症狀；
[0165]I級:葉片失水，輕度萎蔫；
[0166]3級:葉片輕度失綠，輕度萎蔫；
[0167]5級:全葉轉色為淺黃綠色，葉片萎蔫，葉尖部分壞死；
[0168]7級:全葉轉色為黃綠色，葉尖壞死，葉緣翻卷；
[0169]9級:全葉發黃，葉尖葉緣重度壞死焦枯，葉緣重度翻卷；
[0170]按下式計算熱害指數:
[0171]熱害指數=Σ (各級熱害指數葉片數X該熱害級別值)+ (調查總葉片數X最高級值)X 100 ；
[0172]熱害指數計算時，如重複間差異不顯著，取3次重複的平均值；如差異顯著，再重複3次，取其3次差異不顯著的平均值作為該檢測辣椒耐熱性品系的熱害指數；最後，根據以下群體分級標準確定待測辣椒品系的耐熱性:
[0173]熱吾指數< 35.0為耐熱品系；
[0174]熱害指數在35.1~59.9為較耐熱品系；
[0175]熱害指數≥60.0為熱敏品系。
[0176]根據熱害指數計算公式，計算出選育的抗病耐熱嫁接苗【砧木(PBC137-1XB35-1)F1，接穗B12】的熱害指數為20.7，為耐熱級；而對照辣椒品種B12的熱害指數為48.6，為較耐熱級。這一結果說明利用本發明選育的抗病耐熱砧木嫁接了 B12接穗後的嫁接苗的耐熱性明顯高於對照B12的耐熱性。
[0177]6)抗病性鑑定[0178]囷液製備
[0179]將病原菌接到馬鈴薯瓊脂蔗糖固體培養基(PDA)上，在28°C恆溫培養箱裡暗培養7d，然後置於40W日光燈下，培養皿與燈管相距30-40cm，室溫下誘導孢子囊的產生。將產生的孢子囊刮到清水中，4°C下放置lh，再在常溫下放置lh，孢子囊就會釋放大量的遊動孢子，過濾後，收集濾液，鏡檢，最後稀釋到6個孢子囊/100倍視野作為接種液備用。
[0180]待嫁接苗成活後(從嫁接當天算約2周)，這時嫁接苗生長正常。將生長有對照(B12)苗和嫁接苗的營養缽分別灌透水，用Iml藍色槍頭在距幼苗根莖約Icm處的基質中扎一個小孔，並注入辣椒疫黴菌生理小種I接種液2ml，嫁接苗和對照苗(接種無菌水)各接種30株。接種後採用塑料薄膜覆蓋保溼培養5-7d，溫度保持在25-30°C。觀察感病狀況，計算病情指數，鑑定嫁接苗的抗病性【楊茹薇，秦勇，吳慧，季金鳳.辣椒嫁接抗疫病效果研究[J].新疆農業大學學報，2010，33 (1):27-30】。
[0181]調查分級標準
[0182]接種後第6天統計疫病發生情況，並計算病情指數。單株分級標準與群體分級標準如下。
[0183]單株分級標準:
[0184]O級:無任何症狀；
[0185]I級:幼苗根莖部稍有變黑，葉片不萎蔫或可恢復性萎蔫；
[0186]2級:幼苗根莖部變黑 達l-2cm，葉片不可恢復性萎蔫，下部葉片偶有脫落；
[0187]3級:幼苗根莖部變黑超過l-2cm，葉片明顯萎蔫或落葉明顯；
[0188]4級:幼苗根莖部變黑、皺縮，生長點外部葉脫落或整株萎蔫；
[0189]5級:植株枯死。
[0190]病情指數(DI)=【Σ(病級數X該病級植株數)Χ100】/ (病級最高值X調查株數)
[0191]群體分級標準:
[0192]免疫(I):DI=0;
[0193]高抗(HR):0 < DI 芻 10 ;
[0194]抗病(R):10 < DI 蘭 30 ;
[0195]中抗(MR):30 < DI ^ 50 ；
[0196]感病(S):DI>50。
[0197]根據病情指數計算公式，接種辣椒疫黴菌生理小種I後，嫁接苗【砧木(Pbcist-1xbss-1)F1，接穗B12品種】的病情指數為ιι.3，為抗病級；對照辣椒品種B12的病情指數為36.5，為中抗級；這一結果說明利用本發明選育的抗病耐熱砧木嫁接了辣椒品種B12接穗後的嫁接苗的抗病性明顯高於對照辣椒品種B12的抗病性。
【權利要求】
1.一種抗疫病不同生理小種的辣椒耐熱砧木的選育方法，其特徵在於，該方法以抗辣椒疫病某一或某些生理小種的辣椒品系A及耐熱性較強的辣椒品系B作為選育砧木的原始材料，通過連續三代單株自交分別獲得純系A-1和B-1，再以純系A-1為母本，以B-1為父本配製一代雜種F1，以Fl為砧木，以綜合農藝性狀優良，但抗病性、耐熱性差的品種為接穗，進行嫁接，然後對嫁接苗作抗病性和耐熱性鑑定，得到抗疫病不同生理小種的辣椒耐熱石佔木。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，具體包括以下步驟: 1)抗疫病某一或某些生理小種辣椒純系和耐熱辣椒純系的選育 選用抗疫病不同生理小種和耐熱辣椒的抗源，將它們的種子分別經55°C溫湯浸種20min,清水浸泡5h，28 V，全黑暗人工氣候箱中進行催芽，經4d種子露白，播於穴盤中；出芽後，每天傍晚用噴壺給苗子噴一次水，以基質溼潤為止，培養期間燒Hoagland』 s營養液2-3次，直至幼苗長出7-8片真葉時將它們移栽於塑料大棚中；當植株進入花期時，選取株型健壯、生長勢良好的單株進行人工自交，並掛牌標記，在果實完熟後，採收單株自交種子，室內考種、風乾，留作翌年繼續選育； 以同樣的方法經連續三代自交純化，分別選育出表型一致、遺傳性穩定、抗疫病某一或某些生理小種的辣椒純系A-1和耐熱辣椒純系B-1 ； 2)配製一代雜種 以抗疫病某一或某些生理小種的辣椒純系A-1為母本，以耐熱辣椒純系B-1為父本，配製、生產一代雜交種Fl種子； 3)一代雜交種Fl幼 苗的培養 將雜交種Fl的種子，以及綜合農藝性狀優良，但抗病耐熱性較差的辣椒品種的種子，分別經55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽，經4d種子露白，播於穴盤中；然後將穴盤置於人工氣候箱中進行培養，培養所需的晝夜溫光周期條件為:相對溼度50%-70%，光照3000-40001x，白天溫度25°C _30°C，16h，夜間溫度18°C，8h，培養期間澆Hoagland’s營養液，直至幼苗長出4_5片真葉時，進行嫁接以及抗疫病和耐熱性鑑定; 4)嫁接 嫁接選在每年的3-6月份在溫室進行，砧木先於接穗5d播種，待砧木長到5-7片真葉，接穗為4-5片真葉，莖粗2mm時嫁接； 採用劈接法進行嫁接，嫁接後，及時把嫁接苗移入密閉的小拱棚內；嫁接癒合時的溫度控制在白天25V~26°C，夜間20°C~22°C，相對溼度95%以上；為防止強光照射和保持棚內溼度穩定，在小拱棚外面覆蓋紙被，嫁接後的前5d全部遮光，以後兩側見光，並逐步加大見光與通風量，隨著傷口癒合逐步撤掉覆蓋物，兩周後轉入正常管理； 5)耐熱性鑑定 將辣椒嫁接苗和對照苗子葉上方同一葉齡的功能葉片帶柄採下，作為鑑定其耐熱性的樣品；每種材料的辣椒供試離體葉樣品10片，重複3次，將採集的辣椒功能葉按待檢辣椒品系編號，插入裝滿蒸餾水的250mL三角瓶中，在三角瓶壁上用記號筆標明待檢辣椒品系編號；隨後把插有待檢樣品的三角瓶置於38°C的光照培養箱中，光照3000~40001x，連續光照處理60h後，統計熱害指數；在鑑定期間，每天檢查三角瓶中水位並及時補加蒸餾水，使離體的辣椒功能葉的葉柄一直浸在水中； 按照以下辣椒離體葉片耐熱性鑑定分級標準統計待檢辣椒品系葉片級數: O級:全葉青綠,無熱害症狀； I級:葉片失水，輕度萎蔫； 3級:葉片輕度失綠，輕度萎蔫； 5級:全葉轉色為淺黃綠色，葉片萎蔫，葉尖部分壞死； 7級:全葉轉色為黃綠色，葉尖壞死，葉緣翻卷； 9級:全葉發黃，葉尖葉緣重度壞死焦枯，葉緣重度翻卷； 按下式計算熱害指數: 熱害指數=Σ (各級熱害指數葉片數X該熱害級別值)+ (調查總葉片數X最高級值)XlOO ； 熱害指數計算時，如重複間差異不顯著，取3次重複的平均值；如差異顯著，再重複3次，取其3次差異不顯著的平均值作為該檢測辣椒耐熱性品系的熱害指數；最後，根據以下群體分級標準確定待測辣椒品系的耐熱性: 熱吾指數 60.0為熱敏品系； 6)抗病性鑑定 菌液製備 將病原菌接到馬鈴薯瓊脂蔗糖固體培養基上，在28°C恆溫培養箱裡暗培養7d，然後置於40W日光燈下，培養皿與燈管相距30-40cm，室溫下誘導孢子囊的產生；將產生的孢子囊刮到清水中，4°C下放置lh，再在常溫下放置lh，孢子囊就會釋放大量的遊動孢子，過濾後，收集濾液，鏡檢，最後稀釋到6個孢子囊/100倍視野作為接種液備用； 待嫁接苗成活後，將生長有對照苗和嫁接苗的營養缽分別灌透水，用Iml藍色槍頭在距幼苗根莖約Icm處的基質中扎一個小孔，並注入辣椒疫黴菌某一生理小種2ml的接種液，嫁接苗和對照苗(接種無菌水)各接種30株；接種後採用塑料覆膜覆蓋保溼培養5~7d，溫度保持在25°C -30°C ;觀察感病狀況，計算病情指數，鑑定嫁接苗的抗病性； 調查分級標準 接種後第6天統計疫病發生情況，並計算病情指數，單株分級標準與群體分級標準如下: 單株分級標準: O級:無任何症狀； I級:幼苗根莖部稍有變黑，葉片不萎蔫或可恢復性萎蔫； 2級:幼苗根莖部變黑達l_2cm，葉片不可恢復性萎蔫，下部葉片偶有脫落； 3級:幼苗根莖部變黑超過l-2cm，葉片明顯萎蔫或落葉明顯； 4級:幼苗根莖部變黑、皺縮，生長點外部葉脫落或整株萎蔫； 5級:植株枯死； 病情指數=【Σ (病級數X該病級植 株數)X 100】/ (病級最高值X調查株數) 群體分級標準:免疫:DI=0 ；高抗:0 < DI蘭10 ;抗病:10 < DI ^ 30 ；中抗:30 50。·
【文檔編號】A01G1/06GK103843592SQ201410035775
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年1月26日 優先權日:2014年1月26日
【發明者】鞏振輝, 田士林, 張瑩麗, 郭猛, 賀玉梅 申請人:西北農林科技大學