白介素25在銀屑病的發育中的作用的製作方法
2024-02-19 15:31:15
本發明涉及生物領域。具體地，本發明涉及白介素25在銀屑病的發育中的作用。更具體地，本發明涉及試劑在製備藥物中的用途、製劑在製備藥物中的用途、激活免疫細胞的方法、抑制免疫細胞激活的方法、疫苗以及篩選藥物的方法。
背景技術：
銀屑病俗稱牛皮癬，是一種慢性炎症性皮膚病，病程較長，有易復發傾向，有的病例幾乎終生不愈。該病發病以青壯年為主，對患者的身體健康和精神狀況影響較大。其特徵是表皮的過度增殖和真皮的炎症細胞浸潤，臨床表現以紅斑、鱗屑為主，全身均可發病，以頭皮、四肢伸側較為常見，多在冬季加重。
然而，目前對於銀屑病仍有待研究。
技術實現要素：
本發明旨在至少在一定程度上解決現有技術中存在的技術問題至少之一。為此，本發明提出了試劑在製備藥物中的用途、製劑在製備藥物中的用途、激活免疫細胞的方法、抑制免疫細胞激活的方法、疫苗以及篩選藥物的方法。
在本發明的一個方面，本發明提出了試劑在製備藥物中的用途。根據本發明的實施例，所述藥物用於抑制免疫系統激活，所述試劑選自下列的至少之一：(1)白介素25拮抗劑或其功能類似物；(2)il-17rb拮抗劑或其功能類似物；(3)stat3拮抗劑或其功能類似物；(4)白介素17拮抗劑或其功能類似物；以及(5)白介素25、il-17rb、白介素17或者stat3的表達抑制劑。由此，根據本發明實施例的試劑能夠有效地抑制免疫細胞活化，從而抑制免疫系統的激活。
根據本發明的實施例，上述試劑在製備藥物中的用途還可以具有下列附加技術特徵：
根據本發明的實施例，所述藥物用於治療自身免疫性疾病。由此，根據本發明實施例的試劑能夠有效地抑制免疫細胞活化，抑制免疫系統的激活，從而起到治療自身免疫性疾病的效果。
根據本發明的實施例，所述藥物用於治療銀屑病。由此，根據本發明實施例的試劑能夠有效地抑制免疫細胞活化，抑制免疫系統的激活，從而起到治療銀屑病的效果。
在本發明的另一方面，本發明提出了製劑在製備藥物中的用途。根據本發明的實施例，所述藥物用於激活免疫系統，所述製劑選自下列的至少之一：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細胞；(c)白介素25激動劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項的表達促進劑。由此，根據本發明實施例的製劑能夠有效地促進免疫細胞活化，從而激活免疫系統。
根據本發明的實施例，所述藥物用於治療免疫缺陷性疾病。由此，根據本發明實施例的製劑能夠有效地促進免疫細胞活化，激活免疫系統，從而起到治療免疫缺陷性疾病的效果。
根據本發明的實施例，所述分泌白介素25的細胞為角質形成細胞。由此，根據本發明實施例的製劑能夠有效地促進免疫細胞活化，激活免疫系統。
在本發明的又一方面，本發明提出了一種激活免疫細胞的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括：使免疫細胞與選自下列的至少之一接觸：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細胞；(c)白介素25激動劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項的表達促進劑。由此，根據本發明實施例的方法能夠有效地激活免疫細胞。
在本發明的又一方面，本發明提出了一種抑制免疫細胞激活的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括：使免疫細胞與選自下列的至少之一接觸：(1)白介素25拮抗劑或其功能類似物；(2)il-17rb拮抗劑或其功能類似物；(3)stat3拮抗劑或其功能類似物；(4)白介素17拮抗劑或其功能類似物；以及(5)白介素25、il-17rb、白介素17或者stat3的表達抑制劑。由此，根據本發明實施例的方法能夠有效地抑制免疫細胞激活。
在本發明的又一方面，本發明提出了一種疫苗。根據本發明的實施例，所述疫苗含有抗原以及選自下列的至少之一：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細胞；(c)白介素25激動劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項的表達促進劑。由此，根據本發明實施例的方法能夠有效地促進免疫細胞活化，從而激活免疫系統，產生相應的抗體。
在本發明的又一方面，本發明提出了一種篩選藥物的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括：將候選試劑與細胞接觸，所述細胞分泌白介素25；以及確定所述接觸前後，所述細胞的白介素25表達水平，其中，所述接觸後所述白介素25表達升高，是所述候選試劑作為免疫缺陷性疾病藥物的指示；所述接觸後所述白介素25表達降低，是所述候選試劑作為自身免疫性疾病藥物的指示。由此，利用根據本發明實施例的篩選藥物的方法能夠獲得自體免疫疾病藥物或免疫激活藥物。
本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
附圖說明
本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：
圖1顯示了根據本發明一個實施例的白介素25誘導小鼠皮膚增厚和炎症的分析示意圖；
圖2顯示了根據本發明一個實施例的銀屑病皮膚炎症在白介素25敲除的小鼠中的表型分析示意圖；
圖3顯示了根據本發明一個實施例的白介素17介導的銀血病發育過程中起始白介素25表達的分析示意圖；
圖4顯示了根據本發明一個實施例的角質形成細胞中白介素25的敲除對小鼠銀屑病症狀影響的分析示意圖；
圖5顯示了根據本發明一個實施例的白介素25的受體il-17rb在非髓系中的敲除對imq誘導的銀屑病表型影響的分析示意圖；
圖6顯示了根據本發明一個實施例的銀屑病25促進皮膚表皮細胞的增殖且調節皮膚增殖與炎症相關基因的表達的分析示意圖；
圖7顯示了根據本發明一個實施例的接頭蛋白act1和stat3的信號通路對於白介素25誘導角質形成細胞增殖影響的分析示意圖；以及
圖8顯示了根據本發明一個實施例的白介素25激活接頭蛋白act1和stat3來發揮在角質形成細胞上的功能的分析示意圖。
具體實施方式
下面詳細描述本發明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
定義和一般術語
本發明意圖涵蓋所有的替代、修改和等同技術方案，它們均包括在如權利要求定義的本發明範圍內。本領域技術人員應認識到，許多與本文所述類似或等同的方法和材料能夠用於實踐本發明。本發明絕不限於本文所述的方法和材料。在所結合的文獻、專利和類似材料的一篇或多篇與本申請不同或相矛盾的情況下(包括但不限於所定義的術語、術語應用、所描述的技術，等等)，以本申請為準。
應進一步認識到，本發明的某些特徵，為清楚可見，在多個獨立的實施方案中進行了描述，但也可以在單個實施例中以組合形式提供。反之，本發明的各種特徵，為簡潔起見，在單個實施方案中進行了描述，但也可以單獨或以任意適合的子組合提供。
除非另外說明，本發明所使用的所有科技術語具有與本發明所屬領域技術人員的通常理解相同的含義。本發明涉及的所有專利和公開出版物通過引用方式整體併入本發明。
除非另有說明或者上下文中有明顯的衝突，本文所使用的冠詞「一」、「一個(種)」和「所述」旨在包括「至少一個」或「一個或多個」。因此，本文所使用的這些冠詞是指一個或多於一個(即至少一個)賓語的冠詞。例如，「一組分」指一個或多個組分，即可能有多於一個的組分被考慮在所述實施方案的實施方式中採用或使用。
術語「含有」為開放式表達，即包括本發明所指明的內容，但並不排除其他方面的內容。
術語「功能類似物」是指具有相似功能的物質，其結構不限定相同，只要具有相同或類似的功能即可。
術語「激動劑」是指與某生物活性物質的受體結合，呈現該活性物質的作用的物質或藥品。
術語「拮抗劑」是指能與受體結合，但不具備內在活性的一類物質。拮抗劑分為競爭性拮抗劑和非競爭性拮抗劑。
本發明所使用的「自身免疫性疾病」是指與體液或細胞介導的對身體自身組分應答相關的組織損傷的任意疾病的集合。
本發明提出了試劑在製備藥物中的用途、製劑在製備藥物中的用途、激活免疫細胞的方法、抑制免疫細胞激活的方法、疫苗以及篩選藥物的方法。下面將分別對其進行詳細描述。
試劑在製備藥物中的用途
在本發明的一個方面，本發明提出了試劑在製備藥物中的用途。根據本發明的實施例，所述藥物用於抑制免疫系統激活，所述試劑選自下列的至少之一：(1)白介素25拮抗劑或其功能類似物；(2)il-17rb拮抗劑或其功能類似物；(3)stat3拮抗劑或其功能類似物；(4)白介素17拮抗劑或其功能類似物；以及(5)白介素25、il-17rb、白介素17或者stat3的表達抑制劑。
發明人發現，白介素25能夠激活免疫系統，導致一些自身免疫性疾病的發生，例如銀屑病。白介素25在銀屑病人的皮膚中以及銀屑病小鼠模型中高表達，在小鼠皮膚中注射白介素25可以直接誘導出類似銀屑病的表型，而類似銀屑病表型在白介素25敲除的銀屑病小鼠模型中有顯著下降。體外實驗證明白介素25對角質形成細胞的刺激可以引起多種炎症細胞因子和趨化因子的高表達，且這種作用是通過stat3的激活實現的。發明人經過深入研究發現，白介素25可以刺激其受體il-17rb的酪氨酸磷酸化，從而招募並且激活stat3來產生下遊反應。另外，發明人發現，白介素17可以顯著誘導白介素25的表達，而白介素17的缺失使得白介素25的表達不管在mrna水平還是蛋白水平都有顯著下降。因此，推斷出白介素25在銀屑病的發病過程中作為白介素17的一個重要的下遊因子。為此，白介素25拮抗劑或其功能類似物、il-17rb拮抗劑或其功能類似物、stat3拮抗劑或其功能類似物、白介素25表達抑制劑、il-17rb表達抑制劑以及stat3表達抑制劑均能夠有效地抑制炎症細胞因子和趨化因子的高表達，抑制免疫系統激活，從而可以起到預防或者治療自身免疫性疾病的效果。
根據本發明的實施例，所述藥物用於治療自身免疫性疾病。由此，根據本發明實施例的試劑能夠有效地抑制免疫細胞活化，抑制免疫系統的激活，從而起到治療自身免疫性疾病的效果。
根據本發明的實施例，所述藥物用於治療銀屑病。由此，根據本發明實施例的試劑能夠有效地抑制免疫細胞活化，抑制免疫系統的激活，從而起到治療銀屑病的效果。
製劑在製備藥物中的用途
在本發明的另一方面，本發明提出了製劑在製備藥物中的用途。根據本發明的實施例，所述藥物用於激活免疫系統，所述製劑選自下列的至少之一：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細胞；(c)白介素25激動劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項的表達促進劑。
發明人發現，白介素25能夠激活免疫系統，體外實驗證明白介素25對角質形成細胞的刺激可以引起多種細胞因子和趨化因子的高表達，且這種作用是通過stat3的激活實現的。發明人經過深入研究發現，白介素25可以刺激其受體il-17rb的酪氨酸磷酸化，從而招募並且激活stat3來產生下遊反應。另外，發明人發現，白介素17可以顯著誘導白介素25的表達，而白介素17的缺失使得白介素25的表達不管在mrna水平還是蛋白水平都有顯著下降。因此，推斷出白介素25作為白介素17的一個重要的下遊因子。為此，上述製劑能夠有效地促進免疫細胞的高表達，激活免疫系統。
根據本發明的實施例，所述藥物用於治療免疫缺陷性疾病。由此，根據本發明實施例的製劑能夠有效地促進免疫細胞活化，激活免疫系統，從而起到治療免疫缺陷性疾病的效果。
根據本發明的實施例，所述分泌白介素25的細胞為角質形成細胞。發明人發現，角質形成細胞是白介素25的主要來源。由此，根據本發明實施例的製劑能夠有效地促進免疫細胞活化，激活免疫系統。
激活免疫細胞的方法
在本發明的又一方面，本發明提出了一種激活免疫細胞的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括：使免疫細胞與選自下列的至少之一接觸：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細胞；(c)白介素25激動劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項的表達促進劑。由此，根據本發明實施例的方法能夠有效地激活免疫細胞。
本領域技術人員能夠理解的是，前面針對製劑在製備藥物中的用途所描述的特徵和優點，同樣適用於該激活免疫細胞的方法，在此不再贅述。
抑制免疫細胞激活的方法
在本發明的又一方面，本發明提出了一種抑制免疫細胞激活的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括：使免疫細胞與選自下列的至少之一接觸：(1)白介素25拮抗劑或其功能類似物；(2)il-17rb拮抗劑或其功能類似物；(3)stat3拮抗劑或其功能類似物；(4)白介素17拮抗劑或其功能類似物；以及(5)白介素25、il-17rb、白介素17或者stat3的表達抑制劑。由此，根據本發明實施例的方法能夠有效地抑制免疫細胞激活。
本領域技術人員能夠理解的是，前面針對試劑在製備藥物中的用途所描述的特徵和優點，同樣適用於該抑制免疫細胞激活的方法，在此不再贅述。
疫苗
在本發明的又一方面，本發明提出了一種疫苗。根據本發明的實施例，所述疫苗含有抗原以及選自下列的至少之一：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細胞；(c)白介素25激動劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項的表達促進劑。由此，根據本發明實施例的方法能夠有效地促進免疫細胞活化，從而激活免疫系統，產生相應的抗體。
本領域技術人員能夠理解的是，前面針對製劑在製備藥物中的用途所描述的特徵和優點，同樣適用於該疫苗，在此不再贅述。
篩選藥物的方法
在本發明的又一方面，本發明提出了一種篩選藥物的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括：將候選試劑與細胞接觸，所述細胞分泌白介素25；以及確定所述接觸前後，所述細胞的白介素25表達水平，其中，所述接觸後所述白介素25表達升高，是所述候選試劑作為免疫缺陷性疾病藥物的指示；所述接觸後所述白介素25表達降低，是所述候選試劑作為自身免疫性疾病藥物的指示。
如前所述，白介素25的高表達能夠促進免疫細胞活化，進而激活免疫系統，起到預防和治療免疫缺陷性疾病的效果；白介素25表達被抑制會抑制免疫細胞活化，進而抑制免疫系統，起到預防和治療自身免疫性疾病的效果。由此，利用根據本發明實施例的篩選藥物的方法能夠獲得自體免疫疾病藥物或免疫激活藥物。
需要說明的是，「細胞分泌白介素25」應作廣義理解，主要是指該細胞能夠分泌白介素25或者具有分泌白介素25的潛能。根據本發明的具體實施例，所述細胞為角質形成細胞。
下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
實施例1
為了研究白介素25在銀屑病中的作用，首先檢測了在銀屑病病人中白介素25的表達。和正常病人的皮膚相比，銀屑病病人皮膚中的白介素25的表達在mrna和蛋白水平都有顯著上升。imq是一種普遍用來在小鼠身上誘導銀屑病表型的一種藥，採用該方法建立了小鼠銀屑病模型，在小鼠皮膚中，白介素25在mrna和蛋白水平均高表達。
為了進一步探索25的作用，採用在皮膚中直接注射白介素25的蛋白。在一段時間的注射之後，皮膚表現出類似銀屑病的特徵，包括表皮的過度增殖，真皮炎症細胞的浸潤。更為重要的是，白介素25的注射顯著地在皮膚中提高了白介素25本身以及其受體的表達，還包括白介素17、白介素17c的表達，而白介素17和17c是已經被證實在銀屑病發育過程中起重要作用的。
以上的數據暗示了白介素25在銀屑病的發育過程中可能的重要作用。為了進一步確證這種作用，在白介素25缺失的小鼠上誘導了imq銀屑病模型，結果如圖1和圖2所示。圖1中，a：白介素25在正常皮膚和牛皮癬患者中的基因表達；b：白介素25在正常和銀屑病患者皮膚石蠟切片中的免疫螢光染色；c：白介素25在正常和imiquimod處理的小鼠皮膚中mrna水平的表達；d：在正常小鼠皮膚以及imq處理過的小鼠皮膚切片中白介素25的免疫螢光染色；e：分別用pbs(n＝5)或il-25(n＝5)注射的c57bl/6小鼠背部皮膚然後進行色；f：用pbs(n＝5)或il-25(n＝5)注射c57bl/6小鼠的耳朵，進行的h&e染色；g：用pbs(n＝5)或il-25(n＝5)注射c57bl/6小鼠耳朵，每天測試小鼠耳朵厚度；h：用pbs或者il-25注射小鼠皮膚後兩組間部分基因的表達變化。實驗結果重複三次，結果一致。比例尺在(b)和(d)中代表100μm，在(e)和(f)中代表50μm(放大圖)或100μm(縮小圖)。*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒有差別，p值用t-test來決定，數據以平均值正負標註誤的形式來表示。
圖2中，a：野生型小鼠和白介素25基因敲除小鼠分別塗抹imq(咪喹莫特)來誘導銀屑病，持續3.5天做h&e染色並做表皮與真皮厚度統計。同時，分離真皮細胞並做流式分析髓系細胞比例，即cd45+細胞在各組中的比例(見b)；c：分析真皮髓系細胞同時分析在cd45+細胞中各種類型細胞的比例變化。實驗結果重複三次,結果一致。比例尺代表50μm；*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒有差別，p值用t-test來決定，數據以平均值正負標註誤的形式來表示。
結果表明，這種小鼠的銀屑病表型的嚴重程度要遠遠輕於野生型的誘導了銀屑病模型的小鼠，而且這種小鼠皮膚中免疫細胞的數量和比例也要遠低於野生型的小鼠。真皮中減少的免疫細胞包括樹突狀細胞、巨噬細胞和γδt細胞。除了中性粒細胞的比例相對於野生型有略微上升，這些細胞的比例和總細胞數都相對於野生型有較明顯的下降。同時，白介素25的缺失還導致了例如白介素17、22、6、23的mrna表達量下降。
總之，以上數據表明白介素25確實在銀屑病的發生發育過程中起重要作用。
實施例2
免疫螢光的數據證明了白介素25隻在銀屑病皮膚的表皮層有表達，暗示了角質形成細胞可能是白介素25的主要來源。由於缺乏託樣受體7/8，角質形成細胞不能直接對imq做出反應。為了證實白介素25是如何在皮膚中被起始表達的，在體外培養了角質形成細胞並用不同的已經被證實在銀屑病發生過程中有作用的因子去刺激這些細胞來檢測白介素25的表達被誘導的情況，這些因子包括白介素17、17c和tnf-α等。結果如圖3所示。其中a：在體外培養角質形成細胞並用不同的細胞因子去刺激來檢測白介素25的表達被誘導的情況；b和c：在銀屑病模型中，白介素25的表達在白介素17的缺失小鼠中不管在mrna水平還是蛋白水平都有顯著下降。實驗結果重複三次，結果一致。比例尺在(c)中代表100μm，*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒有差別，p值用t-test來決定，數據以平均值正負標註誤的形式來表示。
結果表明，在這些因子當中，只有白介素17可以顯著地誘導白介素25的表達。而白介素17的缺失導致在銀屑病模型中白介素25的表達不管在mrna水平還是蛋白水平都有顯著下降。因此，白介素25可能在銀屑病的發病過程中作為白介素17的一個重要的下遊因子。
實施例3
因為白介素25的表達主要局限於高增生角質形成細胞在銀屑病人的損傷皮膚中，從而假設在角質形成細胞中表達的白介素25可促進銀屑病的發展。圖4表明了角質形成細胞中特異性的白介素25敲除使得小鼠中銀屑病症狀下降。其中，a：野生型小鼠和白介素25特異性皮膚表皮細胞基因敲除小鼠(il-25f/fk5cre)分別塗抹imq(咪喹莫特)來誘導銀屑病，持續3.5天做h&e染色並做表皮與真皮厚度統計，同時，分離真皮細胞並做流式分析髓系細胞比例，即cd45+細胞在各組中的比例(見圖b)；c：分析真皮髓系細胞同時分析在cd45+細胞中各種類型細胞的比例變化。實驗結果重複三次,結果一致。比例尺代表50μm；*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒有差別，p值用t-test來決定，數據以平均值正負標註誤的形式來表示。
白介素25基因(il25)的floxed小鼠與k5cre基因小鼠雜交可在角質形成細胞中選擇性去除角質形成細胞的il25表達。il25的表達在誘導了銀屑病模型的小il25f/fk5cre小鼠相比imq誘導wt小鼠皮損中明顯降低。類似於il25生殖系基因敲除小鼠，白介素25在角質形成細胞中的缺乏大大降低表皮棘細胞增生，真皮厚度和真皮層免疫細胞浸潤。此外，樹突狀細胞(cd45+、cd11c+)、中性粒細胞(cd45+、cd3-、cd11b+、gr1+)和δt細胞(cd45+、cd3+、δt+)的數量和百分比的都降低，但與il25f/fk5cre的銀屑病模型小鼠相比，il25f/f組中，巨噬細胞(cd45+cd3-cd11b+f4/80+)的數量沒有明顯減少。這些數據表明，表皮角質形成細胞產生的白細胞介素25可以作為驅動的牛皮癬病理發展的主要來源。
實施例4
白細胞介素25可以通過靶標到白介素受體複合物il17rb和il17ra作用到機體的免疫及非免疫細胞。為了確認白介素25如何通過激活的il17rb的活動，首先用重組白細胞介素25來刺激小鼠角質形成細胞。結果如圖5所示。其中，a：在體外培養角質形成細胞並用白介素25去刺激來檢測白介素25和其受體il-17rb的表達；b：野生型小鼠和白介素25基因受體敲除小鼠分別塗抹imq(咪喹莫特)來誘導銀屑病，持續3.5天做h&e染色並做表皮與真皮厚度統計，同時，分離真皮細胞並做流式分析髓系細胞比例，即cd45+細胞在各組中的比例(見圖c)；d：分析白介素25受體在白介素25敲除的小鼠的銀屑病模型皮膚的mrna水平的表達。實驗結果重複三次，結果一致。比例尺代表50μm；*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒有差別。p值用t-test來決定，數據以平均值正負標註誤的形式來表示。
白細胞介素25的刺激大大增強原發性角質形成細胞中il17rb和il25的表達(圖5a)。接下來，應用il17rb/-小鼠銀屑病模型，發現銀屑病病理在imq誘導il17rb-/-的小鼠中大大減輕(圖5b)。此外，還觀察到il17rb的表達在il25缺陷小鼠的表皮中大大減少(圖5c，5d)。為了進一步評估銀屑病模型中白介素25的靶細胞，進行了骨髓轉移實驗，從骨髓細胞分離的wt和il17rb/-小鼠分別轉入受致死劑量照射wt或il17rb-/-小鼠，8周後，受鼠用imq誘發銀屑病。il17rb-/-受體小鼠有明顯緩解的銀屑病樣症狀，而il17rb-/-的供體骨髓細胞則無此表型(圖5e)。綜上所述，白介素25調節很大程度上是通過靶向非造血細胞來調節銀屑病的發生，且很有可能是通過自分泌的形式。
實施例5
為了確定白介素25中角質形成細胞的功能下遊因子，用白介素25刺激角質形成細胞8小時，然後用rna測序的方法研究白介素25調節的基因mrna情況。總體上，在白介素25的刺激下，8,449種基因表達上調，7,272種基因表達下調。白細胞介素-25誘導的基因中，其中有大量的趨化因子和細胞因子可以吸引或誘導各種銀屑病相關免疫細胞到皮膚中，包括ccl2可以招募單核細胞、t細胞和樹突狀細胞，ccl7可以招募單核細胞、單核細胞和t細胞，cx3cl1和csf3可刺激粒系造血細胞。此外，許多白細胞介素25誘導的基因曾被報導可調控細胞增殖和細胞周期進程，包括ccl2，fn1。
因此，白介素25可能通過調節細胞增殖和誘導炎症基因來促進銀屑病發展。為了做進一步的證實，用白細胞介素25在體外刺激角質形成細胞。具體地，從小鼠中分離培養角質形成細胞並用白介素25刺激8h，以培養基作為對照，提取rna做表達譜測序檢測。結果如圖6所示。其中，a：對白介素25調節的差異表達基因信號通路的分析；b：白介素25調節的基因的散點圖；c：原代角質形成細胞用白介素25或是培養基刺激在不同濃度和時間點計算細胞數變化；e：培養小鼠皮膚角質細胞並用白介素25去刺激，48h後染ki67去看細胞增殖狀態；f：培養小鼠皮膚角質細胞用白介素25去刺激，24h後染dapi看細胞周期變化；g：在野生型和白介素25缺失的小鼠皮膚中做ki67的免疫螢光染色(10x)；比例尺代表50μm；*p<0.05。**p<0.01；n.s.，沒有差別。p值用t-test來決定。數據以平均值正負標註誤的形式來表示。
發現白介素25在較後的時間點(圖6d)以劑量依賴的方式(圖6c)促進促進細胞增殖提高細胞數量。同樣地，白介素25也提高了增殖標記ki67的表達比例(圖6e)，且有更多的細胞進入活躍細胞周期(s和g2/m期)(圖6f)。相反，il25缺失大大減少誘導銀屑病的小鼠皮膚表皮層組化染色的ki67的比例和數量(圖6g和圖6a)，進一步表明白介素25在調節角質形成細胞在銀屑病發病中的增殖的必不可少的作用。
實施例6
在此將研究白介素25介導角質形成細胞增殖和炎症因子產生的信號轉導機制。此前已知act1作為接頭蛋白，介導白細胞介素25信號通路，我們比較了wt和act1/-小鼠角質形成細胞中幾種白介素25介導的相關基因表達與細胞增殖或或與炎症反應有關的基因。結果如圖7所示。其中，a：在野生型和act1缺失的角質形成細胞中用白介素25刺激或是不刺激8h，觀察由rnaseq挑選出的基因的表達誘導情況；b：在野生型和act1缺失的角質形成細胞中，用白介素25刺激或是不刺激24h去看細胞增殖標記ki67(左)以及細胞周期(右)變化；c：角質形成細胞用白介素25刺激或者24小時，觀察stat3在兩組中的磷酸化情況；d：磷酸化stat3(p-stat3)在用pbs或是經過白介素25注射誘導16天後的皮膚中的免疫組化；e：角質形成細胞用白介素25刺激或者不刺激24h，在stat3磷酸化抑制劑或者白介素6抗體處理或是不處理的情況下的ki67和細胞周期分析；f：角質形成細胞用白介素25刺激或是不刺激或是加上stat3的磷酸酶抑制劑之後並處理8h之後，觀察挑選出來的rnaseq相關基因的表達變化。比例尺代表50μm；*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒有差別。p值用t-test來決定。數據以平均值正負標註誤的形式來表示。
act1的缺失會使白介素25的刺激作用消失。此外，正如所預測的那樣，被白介素25誘導的角質形成細胞增殖依賴於act1(圖7b)。
stat3是眾所周知的在不同細胞中控制細胞周期和細胞增殖的因子，其中包括角質形成細胞，並已被證明能夠參與銀屑病樣皮膚炎症。為了確定白介素25是否可以調節通過活化stat3來調節角質形成細胞增殖，我們測試了角質形成細胞在白介素25的刺激下stat3的磷酸化。結果表明，白介素25的刺激在24個小時導致了明顯的stat3磷酸化(圖7c)。同樣地，皮膚注射白細胞介素25也誘導明顯stat3磷酸化(圖7d)。此外，阻斷stat3激活的stat3的抑制劑sttatic顯著減少白細胞介素25誘導的角質形成細胞增殖和細胞周期變化，且這個過程是獨立於白細胞介素6的作用的(圖7e)。我們還發現與角質形成細胞增殖相關的基因表達或與招募炎症細胞相關的基因中，如ccl2、ccl7和csf3，取決於stat3的激活，而其他的基因，如naip5和dclre1c，則獨立的stat3激活(圖7f)。總之，act1和stat3信號對於白介素25誘導角質形成細胞增殖和細胞因子和趨化因子的表達是非常必要的。
實施例7
上述的數據表明，白介素25對角質形成細胞的有絲分裂影響依賴stat3激活但獨立白細胞介素6介導的信號(圖7e和7f)，由此，預測白介素25可以直接激活stat3。為了檢驗這種可能性，用白介素25體外刺激角質形成細胞，在較短的時間內進行stat3激活的檢測以排除這種作用是二級作用。圖8表明了白介素25可激活接頭蛋白act1和stat3來發揮在角質形成細胞上的功能。其中，a：用白介素25刺激從野生型和act1缺失的乳鼠中分離的原代角質形成細胞細胞，在不同時間點收集細胞做免疫印跡實驗，研究p-stat3和stat3的蛋白表達；b：野生型角質形成細胞用白介素25刺激，在白介素6中和抗體或是jak1/2抑制劑處理或者不處理情況下研究p-stat3和stat3的表達；c：在293t細胞中過表達ha標籤的白介素25受體il-17rb和stat3或是空質粒和stat3，收集細胞裂解，免疫共沉澱il-17rb，接著免疫印跡stat3和ha標籤；d：在293t細胞中過表達ha標籤的白介素25受體il-17rb，不同的時間點用白介素25刺激，收集細胞免疫共沉澱ha標籤蛋白，免疫印跡酪氨酸磷酸化抗體和ha標籤抗體；e：培養小鼠原代角質形成細胞用白介素25刺激一小時，用受體白介素25的另一受體il-17ra進行免疫共沉澱，免疫印跡il-17ra和stat3。
與功能檢測(圖7e)結果一致，白介素25在10分鐘後誘導明顯stat3磷酸化，且這個過程依賴於act1，但是獨立於白細胞介素6。並且，與報導的一樣，這種作用在jak1/2抑制劑處理下完全消失(圖8a、8b)。這一結果表明stat3可能被白介素25直接激活。接下來我們在293t細胞中用ha標記的il-17rb檢驗了stat3是否能與il-17rb直接相互作用。意外發現，在免疫沉澱後的含il-17rb的蛋白複合物中檢測到stat3(圖8c)。此外，白介素25能在10分鐘後誘導il17rb上的酪氨酸磷酸化(圖8d)。因為白介素25是通過結合到il-17ra/il-17rb複合物受體來進行下遊信號轉導，我們研究在小鼠角質形成細胞中白細胞介素25的刺激是否能促進il-17ra/rb複合物與stat3的相互作用。內源性白細胞介素-17ra被發現與stat3基因共同沉澱(圖8e)。綜上所述，研究結果為白介素25在角質形成細胞中可以直接激活stat3的磷酸化的提供了實驗證據。
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